Transcriptome-Wide Profiling of Protein-RNA Interactions by Cross-Linking and Immunoprecipitation Mediated by FLAG-Biotin Tandem Purification
Summary
Ici, nous présentons un protocole CLIP-seq modifié appelé FBIoCLIP-seq avec purification tandem FLAG-biotine pour déterminer les cibles arn des protéines liant l’ARN (RBPs) dans les cellules mammifères.
Abstract
Les protéines liant l’ARN et l’ARN (P RB) contrôlent de multiples processus biologiques. L’arrangement spatial et temporel des ARN et des PRR sous-tend la réglementation délicate de ces processus. Une stratégie appelée CLIP-seq (liaison croisée et immunoprécipitation) a été mise au point pour capturer les interactions protéine-ARN endogènes avec les liaisons UV suivies d’immunoprécipitation. Malgré l’utilisation à grande échelle de la méthode clip-seq conventionnelle dans l’étude RBP, la méthode CLIP est limitée par la disponibilité d’anticorps de haute qualité, de contaminants potentiels provenant des P RB copurifiés, de l’exigence de manipulation des isotopes et de la perte potentielle d’information au cours d’une procédure expérimentale fastidieuse. Ici, nous décrivons une méthode clip-seq modifiée appelée FBIoCLIP-seq en utilisant la purification tandem tag FLAG-biotine. Grâce à la purification en tandem et à des conditions de lavage rigoureuses, presque toutes les protéines liant l’ARN interagissent sont éliminées. Ainsi, les ARN qui interagissent indirectement sous la couverture de ces PRR copurifiés sont également réduits. Notre méthode FBIoCLIP-seq permet une détection efficace des ARN directs liés aux protéines sans SDS-PAGE et sans procédures de transfert de membrane s’il n’y a pas d’isotopes et d’anticorps spécifiques aux protéines.
Introduction
Les ARN et les protéines liant l’ARN contrôlent divers processus cellulaires, y compris l’épissage, la traduction, la biogenèse ribosome, la régulation épigénétique et la transition du destincellulaire 1,2,3,4,5,6. Les mécanismes délicats de ces processus dépendent de l’arrangement spatial et temporel unique des ARN et des PRR. Par conséquent, une étape importante vers la compréhension de la régulation de l’ARN au niveau moléculaire consiste à révéler les informations positionnelles sur les sites contraignants des P RB.
Une stratégie appelée liaison croisée et immunoprécipitation (CLIP-seq) a été mise au point pour capturer les interactions protéine-ARN avec les liaisons UV suivies de l’immunoprécipitation de la protéine d’intérêt7. La principale caractéristique de la méthodologie est l’induction de liens croisés covalents entre une protéine liant l’ARN et ses molécules d’ARN directement liées (dans ~1 Å) par irradiation UV8. Les empreintes RBP peuvent être déterminées par le clustering des balises CLIP et l’appel de pointe, qui ont généralement une résolution de 30−60 nt. Alternativement, l’étape de transcription inverse de CLIP peut conduire à des indélébiles (insertions ou suppressions) ou des substitutions aux sites de liaison croisée, ce qui permet d’identifier les sites de liaison protéique sur les ARN à une résolution à nucléotide unique. Des pipelines comme Novoalign et CIMS ont été développés pour l’analyse des résultats de séquençage à haut débit de CLIP-seq8. Plusieurs méthodes clip-seq modifiées ont également été proposées, y compris la résolution individu-nucléotide reliant et immunoprécipitant (iCLIP), clip amélioré (eCLIP), irCLIP, et ribonucleoside-amélioré photoactivatable cross-linking and immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Malgré l’utilisation à grande échelle des méthodes traditionnelles clip-seq dans l’étude des P RB, les méthodes CLIP présentent plusieurs inconvénients. Tout d’abord, l’électrophoresis de gel dénaturé fastidieux et la procédure de transfert de membrane peuvent mener à la perte de l’information, et causer la complexité limitée de séquence. Deuxièmement, la méthode clip à base d’anticorps protéiques peut tirer vers le bas un complexe protéique au lieu d’une seule protéine cible, ce qui peut conduire à de fausses interactions positives protéine-ARN à partir des RBPs copurifiés. Troisièmement, la stratégie à base d’anticorps nécessite une grande quantité d’anticorps de haute qualité, ce qui rend l’application de ces méthodes inadéquate pour l’étude des RBPs sans anticorps de haute qualité disponibles. Quatrièmement, la méthode CLIP traditionnelle exige que l’ATP radioétique étiqueter les ARN liés aux protéines.
La forte affinité de la streptavidine avec les protéines biotinylées en fait une approche très puissante pour purifier des protéines ou des complexes protéiques spécifiques. La biotinylation efficace des protéines portant une séquence artificielle de peptide par ligase bactérien de biotine de BirA exprimée ectopiquement dans les cellules mammifères en fait une stratégie efficace pour exécuter la purification de biotine in vivo13. Nous avons développé une méthode clip-seq modifiée appelée FBIoCLIP-seq(FLAG-Bioteinté Cross-lencrage et jemmunoprecipitation suivie d’un séquençage à haut débit) en utilisant FLAG-biotin tag tandem purification14 (Figure 1). Grâce à la purification en tandem et à des conditions de lavage rigoureuses, presque tous les P RB en interaction sontéliminés ( figure 2). Les conditions de lavage rigoureuses permettent également de contourner le SDS-PAGE et le transfert de membrane, qui est exigeant en main-d’œuvre et techniquement difficile. Et semblable à eCLIP et irCLIP, la méthode FBIoCLIP-seq est sans isotopes. Sauter les étapes de fonctionnement et de transfert du gel permet d’éviter la perte d’informations, de garder intactes les interactions protéine-ARN authentiques et d’augmenter la complexité de la bibliothèque. De plus, l’efficacité élevée du système de marquage en fait un bon choix pour les P RB sans anticorps de haute qualité disponibles.
Ici, nous fournissons une description étape par étape du protocole CLIP-seq fbiopour les cellules mammifères. En bref, les cellules sont reliées entre elles par 254 nm UV, suivies de la lyse cellulaire et de l’immunoprécipitation FLAG (FLAG-IP). Ensuite, les complexes protéine-ARN sont encore purifiés par la capture d’affinité de biotine et les ARN sont fragmentés par digestion partielle avec MNase. Ensuite, l’ARN lié aux protéines est déphosphorylaté et ligaté avec un linker de 3′. Un lieneur d’ARN de 5′ est ajouté après que l’ARN soit phosphorylaté avec PNK et élulisé par la digestion de proteinase K. Après transcription inverse, les signaux arn lié aux protéines sont amplifiés par PCR et purifiés par purification du gel agarose. Deux RBPs ont été choisis pour illustrer le résultat de FBIoCLIP-seq. LIN28 est une protéine liant l’ARN bien caractérisée impliquée dans la maturation des microARN, la traduction des protéines et la reprogrammationcellulaire 15,16,17. WDR43 est une protéine contenant du domaine WD40 qui coordonnerait la biogenèse ribosome, la transcription eucaryotique et le contrôle de la pluripotence des cellules souchesembryonnaires 14,18. Conformément aux résultats précédemment rapportés pour LIN28 avec CLIP-seq, FbioCLIP-seq révèle des sites contraignants de LIN28 sur des motifs « GGAG » dans le microARN mir-let7g et les ARNM16,19 (Figure 3). WDR43 FbioCLIP-seq a également identifié la préférence contraignante de WDR43 avec des espaceurs transcrits externes de 5′ (5′-ETS) des pré-rRNAs20 (Figure 4). Ces résultats valident la fiabilité de la méthode FBIoCLIP-seq.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous introduisons une méthode CLIP-seq modifiée appelée FBIoCLIP-seq, en profitant du système flag-biotine double marquage pour effectuer la purification en tandem des complexes protéines-ARN. Il a été démontré que le système de double étiquetage FLAG-biotine est puissant pour identifier les interactions protéine-protéines et protéines-ADN13,21. Ici, nous démontrons la grande spécificité et la commodité de ce système dans l’id…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le soutien des subventions est du Programme national de recherche fondamentale de Chine (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), de la National Natural Science Foundation of China (31630095) et du Center for Life Sciences de l’Université de Tsinghua.
Materials
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3′ Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP–transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP–a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
