Summary
在这里，我们提出了一个改进的 CLIP-seq 协议， 称为 FbioCLIP-seq 与 FLAG 生物素串联纯化，以确定哺乳动物细胞中RNA结合蛋白（RBPs）的RNA靶点。
Abstract
RNA和RNA结合蛋白（RBP）控制多种生物过程。区域和空间保护方案的空间和时间安排是这些过程的微妙监管的基础。已开发出一种称为 CLIP-seq（交叉链接和免疫沉淀）的策略，用于捕获内源性蛋白质-RNA 与紫外线交对的相互作用，然后是免疫沉淀。尽管传统的 CLIP-seq 方法在 RBP 研究中广泛应用，但 CLIP 方法仍受到高质量抗体的可用性、共净化 RBP 中的潜在污染物、同位素操作的要求以及繁琐实验过程中潜在的信息丢失限制。在这里，我们描述了一个修改的 CLIP-seq 方法 称为 FbioCLIP-seq 使用 FLAG 生物素标记串联纯化。通过串联纯化和严格的洗涤条件，几乎所有相互作用的RNA结合蛋白被去除。因此，由这些共同净化的RBC间接调解的RNA也减少了。我们的 FbioCLIP-seq 方法允许以无同位素和蛋白质特异性抗体的方式高效检测直接蛋白结合RNA，无需 SDS-PAGE 和膜转移程序。
Introduction
RNA和RNA结合蛋白（RBPs）控制不同的细胞过程，包括拼接、转化、核糖体生物生成、表观遗传调控和细胞命运过渡1、2、3、4、5、6。这些过程的微妙机制取决于区域一项和成果数据库独特的空间和时间安排。因此，在分子水平上了解RNA调控的一个重要步骤是揭示RSP结合位点的位置信息。
一种称为交对和免疫沉淀（CLIP-seq）的策略已经开发出来，用于捕获蛋白质-RNA与UV交对的相互作用，然后是有关蛋白质的免疫沉淀7。该方法的主要特点是通过紫外线照射8诱导RNA结合蛋白与其直接结合RNA分子（在+1+内）之间的共价交集。RBP 足迹可以通过 CLIP 标记聚类和峰值调用确定，通常分辨率为 30~60 nt。或者，CLIP 的逆转录步骤可导致内德尔（插入或删除）或对交链接位点的替代，从而以单核苷酸分辨率识别RNA上的蛋白质结合位点。已开发出像Novoalign和CIMS这样的管道，用于分析S CLIP-seq8的高通量测序结果。还提出了几种经过修改的CLIP-seq方法，包括单核苷酸分辨率交叉链接和免疫沉淀（iCLIP）、增强的CLIP（eCLIP）、irCLIP和光活性核糖苷增强的交叉链接和免疫沉淀（PAR-CLIP）9、10、11、12。
尽管传统的 CLIP-seq 方法在 RBP 研究中应用广泛，但 CLIP 方法还是有几个缺点。首先，繁琐的变性凝胶电泳和膜传输过程可能导致信息丢失，并导致有限的序列复杂性。其次，基于蛋白质特异性抗体的 CLIP 方法可以拉下蛋白质复合物而不是单一靶蛋白，这可能导致来自共纯性 RBP 的假阳性蛋白-RNA 相互作用。 第三，基于抗体的策略需要大量的高质量抗体，这使得这些方法的应用不足以研究没有高质量抗体的 RBP。第四，传统的 CLIP 方法要求带放射性标签的 ATP 对蛋白结合的 RNA 进行标记。
链球菌素与生物素化蛋白质的高亲和力使它成为纯化特定蛋白质或蛋白质复合物的一种非常强大的方法。通过异位表达的细菌BirA生物素连接酶在哺乳动物细胞中携带人工肽序列的蛋白质进行有效的生物基化，使得它在体内进行生物素纯化成为有效的策略。我们开发了一种改进的 CLIP-seq 方法，称为 FbioCLIP-seq（FLAG-生物锡介质Cross-l 墨迹和Immunop 恢复，然后是高通量测序） 使用 FLAG-biotin 标签串联纯化14 （图 1）.通过串联纯化和严格的洗涤条件，几乎所有相互作用的RSP被移除（图2）。严格的洗涤条件还允许规避SDS-PAGE和膜传输，这是劳动密集型和技术挑战。与黄道和伊尔克类似，FbioCLIP-seq 方法不含同位素。跳过凝胶运行和转移步骤可避免信息丢失，保持正宗的蛋白质-RNA相互作用完好无损，并增加库的复杂性。此外，标记系统的高效率使它成为没有高质量抗体的 RBC 的一个很好的选择。
在这里，我们提供了哺乳动物细胞的 FbioCLIP-seq 协议的分步描述。简言之，细胞与254纳米紫外线交相关，其次是细胞解解和旗免疫沉淀（FLAG-IP）。接下来，蛋白质-RNA复合物通过生物素亲和力捕获进一步纯化，RNA通过MNase部分消化而分裂。然后，蛋白结合RNA被去磷酸化，并结合3'链接器。RNA与PNK磷酸化，并由蛋白酶K消化洗清后，加入5'RNA链接器。逆转录后，蛋白结合RNA信号通过PCR扩增，通过加糖凝胶纯化进行纯化。选择两个 RP 作为 Fbi剪辑结果的典范。LIN28是一种具有良好特征的RNA结合蛋白，涉及微RNA成熟、蛋白质转化和细胞重新编程15、16、17。WDR43是一种含有WD40域的蛋白质，被认为可以协调核糖体生物生成、真核转录和胚胎干细胞多能控制14、18。与之前报告的LIN28与 CLIP-seq的结果一致，FbioCLIP-seq揭示了LIN28在微RNA mir-let7g和mRNA16，19（图3）中"GGG"图案上的结合位点。WDR43 FbioCLIP-seq 还确定了 WDR43 与 5' 外部转录空格 （5' -ETS） 的预 rRNA20的绑定首选项 （图 4）这些结果验证了FbioCLIP-seq 方法的可靠性。
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Protocol
1. 细胞系结构
- 将感兴趣的基因克隆成PiggyBac载体pPiggyBac-FLAG-bio-cDNA的兴趣]-（抗海格罗霉素）质粒，携带旗生物素表位13，21，以表达一个 FLAG-生物素标签融合RBP（FB RBP）。
- 将FB RBP与pBase向量表达向量合成表达BirA酶22的细胞系。
注：在这项研究中 ，FBRBP基因被转染成携带综合BirA表达载体21的小鼠胚胎干细胞（MESCs）。或者 ，FB RBP表达向量可以一起与 pBase 和 pPiggyBac-BirA-V5 一起被共进细胞。 - 在明胶盘上生长在MESC中的细胞，并在37°C下以5%CO2在mES培养基（材料表）中保持。 选择与湿霉素b（100μg/mL）的转染细胞1周。
- 药物选择后，通过SDS加载缓冲液（表1）收获细胞，并使用西方印迹23 分别用 FLAG抗体和链球菌素-HRP确认该基因的标记和表达。
2. 交叉链接
- 在实验前1天，在10厘米的板中板+3 x 106 mES细胞，使细胞在收获时长到70~90%汇合（每个样本5~1000万个细胞）。
- 用真空去除介质。在室温 （RT） 下用 2 mL 的 0.25% trypsin-EDTA 治疗细胞 2 分钟，用 4 mL 的新鲜 mESC 介质淬火。将电池转移到 15 mL 离心管。在 4 °C 下，在 300 x g 下离心 旋转细胞 3 分钟，然后取出上经剂。
- 用 4 mL 的冷 PBS 将电池挂起，将电池板板回 10 厘米板进行交叉链接。用 254 nm 紫外光通过辐射将细胞交叉链接（将参数为 400 mJ/cm 2 的 UV 交叉链接器设置为 2。
注：对于细胞单层，细胞可以在尝试素处理之前直接与光在板上的紫外光交相关。 - 将交链接的细胞转移到15 mL管。在 4 °C 下以 300 x g 离心旋转 3 分钟，然后取出上经剂。
注：交链接细胞颗粒可储存在-80°C，直到使用。
3. 细胞酸盐制备
- 用500μL的洗涤缓冲液A（表1）将细胞与1 mM DTT、1 mM PMSF、1/500蛋白酶抑制剂鸡尾酒和400 U/mL RNase抑制剂一起重新补充。将细胞转移到无 RNase 的 1.5 mL 管。在转子上孵育细胞30~60分钟，在4°C下温和旋转。
- 在37°C下用30μL的DNase I处理酸盐10分钟。加入 4 μL 的 0.5 M EDTA，停止反应。在4°C下将不溶性颗粒旋转12，000 x g20 分钟，然后将上先液转移到新的预冷1.5 mL管中。
注：立即使用，请保持冰。如果超量液不会立即使用，请将其储存在-80°C，直到使用。
4. FLAG 珠制备
- 将每个样品的 40 μL 泥浆旗珠添加到新鲜的 1.5 mL 管中。
- 用 0.5 mL 的冰冷洗液缓冲液 A 快速清洗珠子，在 4 °C 下旋转 3，000 x g 2 分钟。
- 重复步骤 4.2 一次。在 4 °C 下用 3，000 x g 旋转珠子 2 分钟。 用窄端移液器尖端小心地拆下缓冲液。避免取下珠子。
5. 免疫沉淀
- 将细胞从步骤 3.2 转移到预平衡的 FLAG 珠。在 4 °C 下轻轻旋转滚轮摇床上的所有样品。用利盐孵育 FLAG珠2~4小时或过夜。
- 在 3，000 x g 下将珠子离心 2 分钟 ，然后取出上盖。
- 在4°C的旋转器中用0.5 mL的预冷洗缓冲液 A清洗珠子5分钟，用3000 x g 旋转珠子2分钟，取出上经剂。重复洗涤1x。
- 重复洗涤2x，如步骤5.3所述，用0.5 mL的预冷洗涤缓冲液B（表1）。
6. 用 3 倍旗肽洗脱
- 通过将 1 毫克 3 倍 FLAG 肽与 5 mL 的洗涤缓冲液 A 溶解到最终浓度为 200 ng/mL，准备 3x FLAG 洗脱溶液。
- 从步骤 5.4 旋转 FLAG 珠，用 3，000 x g 旋转 2 分钟。小心地拆下上一液。使用狭窄的末端移液器尖端确保去除大部分上流液。
- 向每个样品添加 200 μL 的 3x FLAG 洗脱溶液。在4°C下，温和旋转30分钟，孵育样品。 在 3，000 x g 下旋转 FLAG 珠 2 分钟。将超自然剂转移到新鲜管子上。
- 重复洗脱 2x，如步骤 6.2 和 6.3 中所述，将洗脱将洗脱将池在一起。为西方印迹分析或银染色保存 5% 的吸水器，以检查 FLAG-IP 的效率。
7. 斯特雷普他丁珠制备
- 为每个样品准备 50 μL 的链球菌浆。用磁性支架收集 30 s 的磁珠，然后用移液器尖端取出上流水线。
- 用0.5 mL的冷洗缓冲液 A 快速清洗珠子，用磁性支架收集 30 s 的磁珠。
- 重复洗涤1x。洗涤后取出上经剂。
8. 生物素亲和力纯化
- 将池式埃卢器从步骤 6.4 转移到步骤 7.3 的链球菌珠，并在 4°C 下轻轻旋转样品 1~3 小时或过夜。
- 用磁性支架收集 30 s 的磁珠，然后取出上经剂。用500μL的洗涤缓冲液C（表1）用RT轻轻旋转5分钟，将珠子洗2倍。
- 用磁性支架收集珠子并取出上经剂。用500μL的洗涤缓冲液D（表1）用500μL清洗珠子2x，在RT上旋转5分钟。
- 用磁性支架收集珠子并取出上经剂。使用 500 μL 的冷 PNK 缓冲液快速清洗珠子 2 倍（表 1）。
9. 部分RNA消化
- 使用MNase反应缓冲液进行105倍稀释（表1）。向每个样品添加 100 μL 的 MNase 溶液。在 37 °C 下旋转珠子，热混合器设置为 1，200 rpm（5 s 运行，30 s 停止），持续 10 分钟，用磁性支架收集磁力 30 s 的磁珠并去除上经剂。
注：MNase的浓度应针对不同的RNA结合蛋白进行优化。能够将RNA消化成30~50 nt片段的MNase浓度（由最终库的插入大小决定）是最佳的。 - 用 500 μL 的冷 PNK+EGTA 缓冲液快速清洗珠子 2x （表 1） 。用磁性支架收集珠子，并在每个洗涤步骤之间拆下上经剂。
- 用 500 μL 的洗涤缓冲液 C 将珠子洗涤 2x，在 RT 下轻轻旋转 5 分钟。然后用500μL的冰冷PNK缓冲液快速洗涤珠子2倍。
10.RNA脱磷化
- 使小腿肠磷酸酶（CIP）反应与8μL的10xCIP缓冲液（材料表），3μL的CIP酶和69μL的水混合。总体积为每反应80μL。
- 用磁性支架收集磁珠并取出缓冲液。将 CIP 反应混合物添加到珠子中。在 37 °C 下旋转珠子，热混合器设置为 1，200 rpm（5 s 运行，30 秒停止），持续 10 分钟。
- 使用 500 μL 的冷 PNK+EGTA 缓冲液快速清洗珠子 2 倍。使用 500 μL 的冷 PNK 缓冲液快速清洗珠子 2 倍。
11. 3' 连结连接
- 与 4 μL 的 20 μM 3' 链接器、4 μL 的 10x T4 RNA 连体缓冲液、4 μL 的 50% PEG8000、2 μL 的 T4 RNA 连结酶 2（截断）和 26 μL 的水进行组合。总体积为每反应40μL。
- 用磁性支架从步骤 10.3 中收集磁珠，然后取出缓冲液。将 3' 连接器连接混合物的 40 μL 添加到珠子中。在 16 °C 下旋转珠子，热混合器设置为 1，200 rpm（5 s 运行，30 秒停止），持续 3 小时或过夜。
- 使用 500 μL 的冷 PNK+EGTA 缓冲液快速清洗珠子 2 倍。使用 500 μL 的冷 PNK 缓冲液快速清洗珠子 2 倍。
12. PNK治疗
- 使用 4 μL 的 10x PNK 缓冲液、2 μL 的 T4 PNK 酶、1 μL 的 10 mM ATP 和 33 μL 的水进行 PNK 混合。总体积为每反应40μL。
- 用磁性支架收集磁珠并取出缓冲液。将 40 μL 的 PNK 混合物添加到珠子中。在 37 °C 下轻轻旋转珠子，热混合器设置为 1，200 rpm（5 s 运行，30 秒停止），持续 10 分钟。
- 使用 500 μL 的冷 PNK+EGTA 缓冲液快速清洗珠子。
- 使用 500 μL 的冰冷 PNK 缓冲液快速清洗珠子。保存5%的珠子进行西化或银染色分析，以确认免疫沉淀的效率。
13. RNA分离
- 用磁性支架从步骤 12.4 中收集磁珠并取出缓冲液。加入200μL的蛋白酶K消化缓冲液（表1）。在37°C下旋转珠子30分钟，热混合器设置为1，200 rpm（5 s运行，30秒停止）。磁性分离珠子，并采取上一液实验。
- 从步骤13.1中加入400μL的RNA分离试剂（材料表），彻底混合，在冰上孵育5分钟。加入80μL的氯仿，彻底混合，然后在冰上孵育5分钟。以 12，000 x g 旋转，10 分钟 4 °C。
注：此步骤应在化学罩中执行。 - 以上流剂（±500 μL）加入两卷异丙醇：乙醇混合物（1：1）、1/10卷3M醋酸钠（pH= 5.5）和1μL的糖原。在-20°C下冷冻2小时。在 4 °C 下以 12，000 x g 进行 离心 ，20 分钟。
- 用冰冷的70%乙醇清洗颗粒2x。在 4 °C 下旋转颗粒，12，000 x g 旋转 5 分钟。拆下上一液并擦干颗粒。将RNA溶解在无 RNase 的 5μL 中 H2O。
14. 5' RNA 链接器连接
- 与 1 μL 10x T4 RNA 结糖缓冲液、0.5 μL BSA（1 μg/μL）、1 μL 10 mL ATP、1 μL 的 RNase 抑制剂和 0.5 μL 的 T4 RNA 连接酶进行 5' RNA 结扎混合。总体积为每反应4μL。
- 从步骤13.4向RNA加入1 μL 5' 20 μMRNA链接器，在70°C加热2分钟，使RNA变性，并立即在冰上冷却。
- 从步骤14.2将5'RNA结扎混合物加入RNA。在16°C孵育过夜。
15. 逆转录
- 如第 13 节所述，净化 RNA，用 11.5 μL 无 RNase 水溶解 RNA。
- 在纯化的RNA中加入1 μL 10 μM逆转录底转，在70°C加热2分钟，立即在冰上冷却。
- 使用 4 μL 的 5 倍逆转录缓冲液、1 μL 的 10 mM dNTP、1 μL 的 0.1 M DTT、1 μL 的 RNase 抑制剂和 0.5 μL 的逆转录酶（材料表 ） 进行逆转录混合。总体积为每反应7.5μL。
- 将7.5μL的逆转录混合物加入RNA中，在50°C下孵育30分钟，在70°C下孵育10分钟。在 4 °C 下离开。
16. PCR 扩增
- 使用步骤 15.4 起 5 μL 的 cDNA放大混合物，使用 15 μL 的 2x PCR 主混合物（材料表），5 μL 的 cDNA， 0.6 μL 的 10 μM 前向底转1 （表 2），0.6 μL 的 10 μM 反向底转 1 （表 2）， 和 8.8 μL 的 H2O.总体积为 30 μL。
- 使用以下设置放大 cDNA：98 °C 30 s、98 °C 10 s、60 °C 30 s、72 °C 30 s（15~20 周期重复步骤 2+4）、72 °C 2 分钟，并保持 4 °C。 在 2±3% 的加糖凝胶上运行 PCR 产品。切出±100±150 bp的DNA，用凝胶提取试剂盒（材料表）提取DNA，用20μL的水提取DNA。
- 以净化PCR产品的3μL，用前底像2（表2）放大，用反向底转2放大（指数底转; 表2）如步骤 16.2 中所述，用于引入索引序列的五个周期。如步骤 16.2 所述，净化 PCR 产品。
- 使用高吞吐量测序平台对库进行测序。
17. 生物信息学分析
- 使用商业程序执行数据分析，如前所述。
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Representative Results
FbioCLIP-seq 程序的示意图表示图如图1 所示。与 FLAG 中继或链球菌素的一步亲和力纯化相比，FLAG-biotin 串联纯化几乎去除了所有共纯蛋白，避免了间接蛋白-RNA相互作用的污染（图2）。图3和图 4 中描述了 LIN28 和 WDR43 的FbioCLIP-seq代表性结果。我们用 ESCS 表演了 LIN28 或 WDR43 FbioClip - seq。图 3A显示了 LIN28 和 WDR43 FbioCLIP-seq 在预让-7g 中的轨迹视图。图3B中报告了前7g的GGAG图案和FbioCLIP-seq标识的交叉链接站点。CIMS算法调用的突变位点分类表明，LIN28倾向于与G核苷酸结合和交链（图3C）。LIN28 FbioCLIP-seq 结合位点中丰富的RNA图案如图3D所示。图3E中显示了LIN28和HNRNPU上Fbio CLIP-seq的更具代表性的曲目。WDR43和LIN28 FbioCLIP-seq的比较显示了它们在Rn45前rRNA位点的不同结合模式（图4）。图5显示了细胞系构造后 FLAG和生物素标记验证的代表性结果。图6显示了高效（图6A）或不成功（图6B）FLAG-IP和 FLAG-生物素串联纯化的代表性结果。
图 1：FbioCLIP的示意图。UV交叉链接细胞（步骤1）在解解缓冲液（步骤2）中解解。 FBRBP-RNA 复合物是使用抗 FLAG 树脂（步骤 3+4）免疫沉淀的。洗涤蛋白-RNA复合物被进一步纯化与链球菌珠和严格的洗涤条件用于去除蛋白质-蛋白质相互作用（步骤5~6）。RNA被MNase部分消化，非蛋白结合RNA片段通过进一步洗涤（步骤7~8）去除。然后，使用 3' 链接器（步骤 9）对 RNA 进行脱磷和连接。然后RNA被磷酸化，并通过蛋白酶K处理洗清（步骤10）。纯化RNA与含有6nt随机条形码的5'RNA链接器连接（步骤11）。逆转录（步骤12）后，使用PCR扩增cDNA库，并执行高通量测序（步骤13~15）。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：FLAG-生物素串联纯化去除共纯蛋白。FBWDR43 的银染色表明，在严格清洗串联纯化后，FLAG-或生物素中位一步纯化中呈现的几乎所有相互作用的蛋白质都被淘汰。旗： FLAG 的亲和纯化， SA： 斯特雷普他汀中筛选的生物素纯化， 串联： FLAG- 生物素串联纯化。请单击此处查看此图的较大版本。
图3：LIN28 FbioCLIP-seq 的代表性结果。（A） LIN28 FbioCLIP-seq 标记和突变读取的轨迹视图，由 CIMS 在 7g 前 RNA 中调用。显示的标签是 FbioCLIP-seq 的唯一读取。在删除冗余读取后，共检索了 770 万英镑的 LIN28 FbioCLIP-seq 唯一读取和 220 万英镑的 WDR43 FbioCLIP-seq 的唯一读取。（B） LIN28 FbioCLIP-seq 预放 7g RNA 的 GGG 图案上的交叉链接网站。箭头指示交叉链接的站点。（C） 不同类型突变中突变核苷酸的百分比。G 是最常见的交链和变异核苷酸。随机：四个核苷酸的随机分布。（D） 预测LIN28结合图案由 FbioCLIP-seq与荷马算法。（E） 跟踪 LIN28 FbioCLIP-seq 在 LIN28 和 HNRNPU mRNA 上的视图。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：WDR43和LIN28 FbioCLIP-seq在Rn45S位点的代表结果。在 Rn45S 轨迹上跟踪 WDR43 和 LIN28 FbioClip-seq。WDR43和LIN28在预rRNA上显示出不同的结合模式。 请单击此处查看此图的较大版本。
图5：FLAG和生物素标签验证的代表性结果。FLAG 或生物素西部印迹验证细胞系的标记。克隆#1、#2和#4显示标签的高效表达和生物#3，而标记蛋白的表达很差。 请单击此处查看此图的较大版本。
图6：FLAG免疫沉淀和串联纯化效率验证的代表性结果。（A） FLAG和生物素亲和力纯化有效纯化标记蛋白的例子。（B） FLAG和生物素亲和力纯化标记蛋白低效纯化的例子。 请单击此处查看此图的较大版本。
| 缓冲区 | 组成 |
| SDS 加载缓冲区 | 50 mM Tris pH 6.8， 2% SDS， 0.1% 布罗莫酚蓝， 10% 甘油， 100 mM DTT |
| 洗涤缓冲液 A | 1x PBS，0.5% NP-40，0.5% 脱氧钠，0.1% SDS |
| 洗涤缓冲液 B | 5x PBS，0.5% NP-40，0.5% 脱氧二氧化钠，0.1% SDS |
| 洗涤缓冲液 C | 50 mM 三轮车 pH 7.4，2% SDS |
| 洗涤缓冲器 D | 5x PBS， 0.5% NP-40， 0.5% SDS， 1 M 尿素 |
| PNK 缓冲区 | 50 mM Tris pH 7.4， 0.5% NP-40， 10 mM MgCl2 |
| MNase 反应缓冲液 | 10 mM 三轮车 pH 8.0，1 mM CaCl2 |
| PNK+EGTA 缓冲区 | 50 mM Tris pH 7.4， 0.5% NP-40， 10 mM EGTA |
| 蛋白酶 K 消化缓冲液 | 50 mM Tris pH 7.4， 10 mM EDTA， 50 mM NaCl， 0.5% SDS， 20 μg 蛋白酶 K |
表1：本研究中使用的缓冲区的组成。
| 奥利戈名称 | 序列 | 笔记 | ||||
| 3' 链接器 | 拉普加特加加卡卡格特克 - nh2 | |||||
| 5' RNA 链接器 | 古卡加古库卡古克加克克恩 | |||||
| Rt 底是 | 阿加格特格特克茨克特克加特克特 | |||||
| 前进底向 1 | 格特特卡加特特塔卡加特克切加加特克 | |||||
| 反向底转 1 | 阿加格特格特克茨克特克加特克特 | |||||
| 前进底向 2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCGATACGTTCGTTCTACAGCCAC | |||||
| 反向底面 2 | Caagcagaagacgggatacgagatcgtgactggagttcagacgttgtcttcgatc - s - t | 红色和下划线的序列表示光照索引序列。 | ||||
表2：本研究中使用的寡核苷酸。
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Discussion
在这里，我们介绍一种改进的 CLIP-seq 方法，称为FbioCLIP-seq，利用 FLAG-biotin 双标记系统对蛋白质-RNA 复合物进行串联纯化。FLAG-生物素双标记系统已被证明在识别蛋白质-蛋白质和蛋白质-DNA相互作用13，21方面是强大的。在这里，我们演示了该系统在识别与蛋白质相互作用的RNA方面的高特异性和便利性。通过串联纯化和严格的洗涤条件，我们跳过了具有挑战性的SDS-PAGE和膜转移步骤，以便保留更多的蛋白质-RNA相互作用，并避免被RBC在同一复合物中调出的受污染RNA信号。此外，绕过这些步骤避免使用放射性标记 ATP 标记 RNA。这使得该过程更加容易。请注意，在编写我们的出版物时，还提出了一种类似的方法，称为 uvCLAP。
几个步骤对于协议的成功非常重要。首先，标记蛋白的生物基化效率应在实验前由西方印迹确认（图5）。其次，RNA信号的成功扩增需要用3×FLAG肽有效洗脱纯蛋白。步骤12.4中的珠子应用西印或银染色进行分析，以确保检索到相当数量的靶蛋白（图6）。为了提高效率，要么在步骤 6 中将 3 x FLAG 肽浓度提高至 500 ng/mL，要么多次重复洗脱步骤以获得更好的生产。第三，在第一次试验中对每种蛋白质的MNase浓度进行滴定是最佳的。过度消化或治疗不足可能导致大小不适当的RNA片段。最后，该协议包含两轮亲和力纯化和高度严格的洗涤。仅检索少量纯化的 RNA。试剂应不含 RNase，并在 MNase 治疗步骤后避免RNA降解。
尽管这种方法简单易用，但仍有一些方面可以改进。例如，5'适配器与RNA的连结可能会限制信号的恢复，因为逆转录的很大一部分将被残留的交链肽终止。我们目前的研究主要基于标记蛋白的异位表达，这可能导致一些由于蛋白质过度表达而导致的伪影。通过将标签引入内源性位，值得改进该方法。CRISPR/Cas9 系统使细胞系构造更加容易和可行。一些研究已经应用了eCLIP-seq实验的小鼠组织25。具有双标记的敲击小鼠的衍生也是Fbio CLIP-seq 方法改进和应用的一个潜在和有希望的方向。此外，异位表达的细菌BirA连体可能导致体内意外的生物素化事件。蛋白质的标记也可能影响其生物功能。
大量研究表明，细胞的基因表达和表观基因组是异质的，而不是完全均匀的，这表明在单细胞水平上研究相互作用网络是有价值的。已制定几种策略来研究单细胞的转录组和表观基因组。然而，没有报告在单细胞水平上分析蛋白质-RNA相互作用组的策略。如果没有变性凝胶的运行和膜转移步骤 ，FbioCLIP-seq 可以保留更多的信号，这使得它成为在单细胞水平上研究蛋白质-RNA相互作用的潜在策略。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
资助资金来自国家基础研究计划（2017YFA0504204、2018YFA0107604）、中国国家自然科学基金（31630095）和清华大学生命科学中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
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