Summary
Aquí presentamos un protocolo CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq con purificación en tándem FLAG-biotina para determinar los objetivos de ARN de proteínas de unión al ARN (RPP) en células de mamíferos.
Abstract
Las proteínas de unión al ARN y al ARN (RBP) controlan múltiples procesos biológicos. La disposición espacial y temporal de los ARN y los PBP subyace a la delicada regulación de estos procesos. Se ha desarrollado una estrategia llamada CLIP-seq (reticulación e inmunoprecipitación) para capturar interacciones endógenas entre proteínas y ARN con la reticulación UV seguida de inmunoprecipitación. A pesar del amplio uso del método CLIP-seq convencional en el estudio RBP, el método CLIP está limitado por la disponibilidad de anticuerpos de alta calidad, contaminantes potenciales de los PBP copurificados, requisito de manipulación de isótopos y posible pérdida de información durante un procedimiento experimental tedioso. Aquí describimos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq usando la purificación en tándem de etiqueta flag-biotina. A través de la purificación en tándem y las condiciones de lavado estrictas, se eliminan casi todas las proteínas de unión al ARN que interactúan. Por lo tanto, los ARN que interactúan indirectamente mediados por estos PBP copurificados también se reducen. Nuestro método FBIoCLIP-seq permite la detección eficiente de ARN directos unidos a proteínas sin procedimientos de transferencia de membrana y SDS-PAGE de una manera libre de anticuerpos sin isótopos y específica de proteínas.
Introduction
Los ARN y las proteínas de unión al ARN (RRP) controlan diversos procesos celulares, incluyendo empalme, traducción, biogénesis ribosoma, regulación epigenética y transición del destino celular1,2,3,4,5,6. Los delicados mecanismos de estos procesos dependen de la disposición espacial y temporal única de los ARN y los RRP. Por lo tanto, un paso importante hacia la comprensión de la regulación del ARN a nivel molecular es revelar la información posicional sobre los sitios de unión de los PBP.
Se ha desarrollado una estrategia denominada reticulación e inmunoprecipitación (CLIP-seq) para capturar las interacciones proteína-ARN con la reticulación UV seguida de la inmunoprecipitación de la proteína de interés7. La característica clave de la metodología es la inducción de enlaces cruzados covalentes entre una proteína de unión al ARN y sus moléculas de ARN directamente unidas (dentro de 1o) por irradiación UV8. Las huellas de RBP se pueden determinar mediante la agrupación en clústeres de etiquetas CLIP y las llamadas de pico, que suelen tener una resolución de 30 a 60 nt. Alternativamente, el paso de transcripción inversa de CLIP puede conducir a indels (inserciones o eliminaciones) o sustituciones a los sitios de enlace cruzado, lo que permite la identificación de sitios de unión a proteínas en los ARN con una resolución de un solo nucleótido. Se han desarrollado tuberías como Novoalign y CIMS para el análisis de los resultados de secuenciación de alto rendimiento de CLIP-seq8. También se han propuesto varios métodos CLIP-seq modificados, entre ellos la transenlace y la inmunoprecipitación (iCLIP) con resolución de nucleótidos individuales, CLIP mejorado (eCLIP), irCLIP y fotoactivatable con reticulación y inmunoprecipitación (PAR-CLIP)9,10,11,12.
A pesar del amplio uso de los métodos tradicionales CLIP-seq en el estudio de los PBP, los métodos CLIP tienen varios inconvenientes. En primer lugar, la tediosa electroforesis de gel desnaturalizante y el procedimiento de transferencia de membrana pueden conducir a la pérdida de información y causar una complejidad de secuencia limitada. En segundo lugar, el método CLIP basado en anticuerpos específicos de proteínas puede derribar un complejo proteico en lugar de una sola proteína diana, lo que puede dar lugar a interacciones de ARN proteico-proteína falsos de los RBP copurificados. En tercer lugar, la estrategia basada en anticuerpos requiere una gran cantidad de anticuerpos de alta calidad, lo que hace que la aplicación de estos métodos sea inadecuada para el estudio de los RMP sin anticuerpos de alta calidad disponibles. En cuarto lugar, el método CLIP tradicional requiere ATP radiomarcado para etiquetar los ARN unidos a proteínas.
La alta afinidad de la estreptavidina con las proteínas biotiniladas hace que sea un enfoque muy potente para purificar proteínas específicas o complejos proteicos. La biotinilación eficiente de proteínas que llevan una secuencia de péptidos artificiales por ligasa de biotina birA bacteriana expresada ectópicamente en células de mamíferos hace que sea una estrategia eficiente para realizar la purificación de biotina in vivo13. Desarrollamos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq (FLAG-Biotin-mediated Cross-linking and Immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing) using FLAG-biotin tag tandem purification14 (Figura 1). Mediante la purificación en tándem y las estrictas condiciones de lavado, se eliminan casi todos los PBP que interactúan(Figura 2). Las estrictas condiciones de lavado también permiten eludir la transferencia de membranas y SDS-PAGE, que es intensiva en mano de obra y técnicamente difícil. Y al igual que eCLIP e irCLIP, el método FBIoCLIP-seq está libre de isótopos. Saltarse los pasos de funcionamiento y transferencia del gel evita la pérdida de información, mantiene intactas las interacciones proteína-ARN de proteínas y aumenta la complejidad de la biblioteca. Además, la alta eficiencia del sistema de etiquetado hace que sea una buena opción para los PBP sin anticuerpos de alta calidad disponibles.
Aquí proporcionamos una descripción paso a paso del protocolo FBIoCLIP-seq para células de mamíferos. En resumen, las células están reticuladas por UV de 254 nm, seguidas de la lelisis celular y la inmunoprecipitación FLAG (FLAG-IP). A continuación, los complejos de ARN proteico se purifican aún más mediante la captura de afinidad de biotina y los ARN se fragmentan por digestión parcial con MNase. Luego, el ARN unido a proteínas se desfosforila y ligado con un vinculador de 3'. Se añade un enlace de ARN de 5' después de que el ARN se fosforila con PNK y se eluda por la digestión de la proteinasa K. Después de la transcripción inversa, las señales de ARN unidas a proteínas son amplificadas por PCR y purificadas por purificación de gel de agarosa. Dos PBP fueron elegidos para ejemplificar el resultado de FBIoCLIP-seq. LIN28 es una proteína de unión al ARN bien caracterizada implicada en la maduración del microARN, la traducción de proteínas y la reprogramación celular15,16,17. WDR43 es una proteína que contiene dominios WD40 que se cree que coordina la biogénesis ribosoma, la transcripción eucariota y el control de pluripotencia de células madre embrionarias14,18. De acuerdo con los resultados reportados previamente para LIN28 con CLIP-seq, FbioCLIP-seq revela sitios de unión de LIN28 en motivos "GGAG" en el microRNA mir-let7g y mRNAs16,19 (Figura 3). WDR43 FBIoCLIP-seq también identificó la preferencia vinculante de WDR43 con espaciadores transcritos externos de 5' (5'-ETS) de pre-rRNAs20 (Figura 4). Estos resultados validan la fiabilidad del método FBIoCLIP-seq.
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Protocol
1. Construcción de líneas celulares
- Clonar el gen de interés en un plásmido pPiggyBac-FLAG-flag-bio-[cDNA de interés]-(resistente a la higromicina) que lleva un epitótopo FLAG-biotina13,21 para expresar una etiqueta FLAG-biotina fusionada RBP (FBRBP).
- Cotransfect the FBRBP express vector with the pBase vector into a cell line expressing the BirA enzyme22.
NOTA: En este estudio, el gen FBRBP fue trans infectado en células madre embrionarias de ratón (mESC) llevando un vector de expresión BirA integrado21. Alternativamente, el vector de expresión FBRBP puede ser cotrans infectado en células con pBase y pPiggyBac-BirA-V5 juntos. - Cultivar las células en mESC en platos gelatinizados y mantener en medio de cultivo mES (Tabla de Materiales) en 5% CO2 a 37oC. Seleccione las células trans infectadas con higromicina b (100 g/ml) durante 1 semana.
- Después de la selección del fármaco, cosecha las células por el tampón de carga SDS (Tabla 1) y utiliza una mancha occidental23 para confirmar el etiquetado y la expresión del gen con un anticuerpo FLAG y streptavidin-HRP, respectivamente.
2. Enlace cruzado
- Placa de 3 x 10 célulasde 6 mES en una placa de 10 cm 1 día antes del experimento para que las células crezcan a 70 x 90% de confluencia cuando se cosechan (5 a 10 millones de células por muestra).
- Retire el medio con un vacío. Tratar las células con 2 ml de 0,25% de trippsina-EDTA durante 2 minutos a temperatura ambiente (RT) y apagar la tripina en 4 ml de medio mESC fresco. Transfiera las células a un tubo centrífugo de 15 ml. Gire hacia abajo las células por centrifugación a 300 x g durante 3 min a 4 oC y retire el sobrenadante.
- Suspenda las células con 4 ml de PBS frío y placa las células de nuevo a la placa de 10 cm para la reticulación. Cruzar las células por radiación con luz UV de 254 nm (establecer el enlace transversal UV con un parámetro de 400 mJ/cm2).
NOTA: Para las monocapas celulares, las células se pueden reticular con luz UV directamente en la placa antes del tratamiento con la trippsina. - Transfiera las células reticuladas a un tubo de 15 ml. Gire hacia abajo por centrifugación a 300 x g durante 3 min a 4 oC y retire el sobrenadante.
NOTA: El pellet de celda reticulado se puede almacenar a -80 oC hasta su uso.
3. Preparación de la lesada celular
- Lyse las células con 500 l de tampón de lavado A (Tabla 1) recién suplementadas con 1 mM de TDT, 1 mM de PMSF, 1/500 cóctel inhibidor de la proteasa y 400 U/mL inhibidor de la RNasa. Transfiera las células a un tubo de 1,5 ml sin RNase. Incubar las células durante 30-60 min en un rotor con rotación suave a 4oC.
- Tratar el izado con 30 l de DNase I a 37 oC durante 10 min. Detenga la reacción añadiendo 4 l de 0,5 M EDTA. Girar hacia abajo el pellet insoluble por 12.000 x g durante 20 min a 4 oC y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo prechilled 1.5 mL.
NOTA: Para uso inmediato, manténgase en hielo. Si el sobrenadante no se utilizará inmediatamente, guárdelo a -80 oC hasta su uso.
4. Preparación de cuentas FLAG
- Agregue 40 ml de perlas FLAG por muestra a un tubo fresco de 1,5 ml.
- Lave rápidamente las perlas con 0,5 ml de tampón de lavado en frío A y gire hacia abajo en 3.000 x g durante 2 min a 4 oC.
- Repita el paso 4.2 una vez. Gire hacia abajo las perlas con 3.000 x g durante 2 min a 4 oC. Retire con cuidado el tampón con una punta de pipeta de extremo estrecho. Evite quitar las perlas.
5. Inmunoprecipitación
- Transfiera el izado de celda del paso 3.2 a las perlas FLAG preequilibadas. Gire todas las muestras en una coctelera de rodillos a 4 oC suavemente. Incubar las perlas FLAG con izado durante 2 a 4 h o durante la noche.
- Centrifugar las perlas durante 2 min a 3.000 x g y retire el sobrenadante.
- Lavar las perlas con 0,5 ml de tampón de lavado prechilled A por incubación durante 5 min en un rotador a 4oC, girar las perlas con 3.000 x g durante 2 min y quitar el sobrenadante. Repita el lavado 1x.
- Repita el lavado 2x como se describe en el paso 5.3 con 0,5 ml de tampón de lavado prechilled B (Tabla 1).
6. Elución con 3x péptido FLAG
- Preparar 3x solución de elución FLAG disolviendo 1 mg de péptido FLAG 3x con 5 ml de tampón de lavado A a una concentración final de 200 ng/ml.
- Gire hacia abajo las perlas FLAG del paso 5.4 con 3.000 x g durante 2 min. Retire el sobrenadante con cuidado. Asegúrese de que la mayor parte del sobrenadante se elimina utilizando una punta de pipeta de extremo estrecho.
- Añadir 200 l de solución de elución FLAG 3x a cada muestra. Incubar las muestras con rotación suave durante 30 min a 4oC. Gire hacia abajo las perlas FLAG durante 2 min a 3.000 x g. Transfiera los sobrenadantes a tubos frescos.
- Repita la elución 2x como se describe en los pasos 6.2 y 6.3 y agrupe a los eluyentes. Ahorre el 5% de los eluyentes para el análisis de manchas occidentales o tinción de plata para comprobar la eficiencia de FLAG-IP.
7. Preparación de cuentas de estreptavidina
- Preparar 50 l de una suspensión de perlas de estreptavidina para cada muestra. Recoger las perlas con un soporte magnético durante 30 s y quitar el sobrenadante con una punta de pipeta.
- Lave rápidamente las perlas con 0,5 ml de tampón de lavado en frío A y recoja las perlas con un soporte magnético durante 30 s.
- Repita el lavado 1x. Retire el sobrenadante después del lavado.
8. Purificación de afinidad de biotina
- Transfiera los eluyentes agrupados del paso 6.4 a las perlas de estreptavidina del paso 7.3 y gire suavemente las muestras a 4 oC durante 1 a 3 h o durante la noche.
- Recoger las perlas con un soporte magnético durante 30 s y quitar el sobrenadante. Lavar las perlas 2x con 500 s de tampón de lavado C (Tabla 1) por rotación suave a RT durante 5 min.
- Recoger las perlas con el soporte magnético y quitar el sobrenadante. Lavar las perlas 2x con 500 s de tampón de lavado D (Tabla 1) girando a RT durante 5 min.
- Recoger las perlas con el soporte magnético y quitar el sobrenadante. Lavar rápidamente las perlas 2x con 500 ml de tampón PNK helado(Tabla 1).
9. Digestión parcial del ARN
- Hacer una dilución de10 5veces de MNase con Tampón de reacción MNase (Tabla 1). Agregue 100 l de solución MNase a cada muestra. Vortex las perlas a 37 oC con un mezclador térmico establecido a 1.200 rpm (5 s de carrera, 30 s de parada) durante 10 min, recoger las perlas con un soporte magnético para 30 s y quitar el sobrenadante.
NOTA: La concentración de MNase debe optimizarse para diferentes proteínas de unión al ARN. La concentración de MNase que puede digerir los ARN en fragmentos de 30 a 50 nt (determinada por el tamaño de la inserción de la biblioteca final) es óptima. - Lavar rápidamente las perlas 2x con 500 ml de tampón PNK+EGTA helado(Tabla 1). Recoger las perlas con un soporte magnético y quitar el sobrenadante entre cada paso de lavado.
- Lavar las perlas 2x con 500 s de tampón de lavado C por rotación suave durante 5 minutos en RT. A continuación, lave rápidamente las perlas 2x con 500 ml de tampón PNK helado.
10. Desfosforilación del ARN
- Hacer una mezcla de reacción de fosfatasa del intestino de la pantorrilla (CIP) con 8 l de tampón CIP de 10x(Tabla de materiales),3 l de enzima CIP y 69 l de agua. El volumen total es de 80 ml por reacción.
- Recoger las perlas con un soporte magnético y quitar el tampón. Agregue la mezcla de reacción CIP a las cuentas. Vortex las perlas a 37 oC con un mezclador térmico establecido a 1.200 rpm (5 s de carrera, 30 s de parada) durante 10 min.
- Lave rápidamente las perlas 2x con 500 ml de tampón PNK+EGTA helado. Lave rápidamente las perlas 2x con 500 ml de tampón PNK helado.
11. 3' ligadura del eslabón
- Haga una mezcla de 3' de enlacer con 4 l de 20 m 3' linkr, 4 l de 10x T4 tampón de ARN ligasa, 4 l de 50% PEG8000, 2 l de T4 ARN ligasa 2 (truncado), y 26 l de agua. El volumen total es de 40 ml por reacción.
- Recoger las perlas del paso 10.3 con un soporte magnético y quitar el búfer. Agregue 40 l de la mezcla de ligadura del ligador del eslabón de 3' a las perlas. Vortex las perlas a 16oC con un mezclador térmico a 1.200 rpm (5 s de carrera, 30 s de parada) durante 3 h o durante la noche.
- Lave rápidamente las perlas 2x con 500 ml de tampón PNK+EGTA helado. Lave rápidamente las perlas 2x con 500 ml de tampón PNK helado.
12. Tratamiento PNK
- Haga una mezcla de PNK con 4 ml de tampón de PNK de 10x, 2 ml de enzima T4 PNK, 1 l de ATP de 10 mM y 33 ml de agua. El volumen total es de 40 ml por reacción.
- Recoger las perlas con un soporte magnético y quitar el tampón. Agregue 40 l de mezcla de PNK a las perlas. Vortex las perlas suavemente a 37 oC con un mezclador térmico establecido a 1.200 rpm (5 s de carrera, 30 s de parada) durante 10 min.
- Lave rápidamente las perlas con 500 ml de tampón PNK+EGTA helado.
- Lave rápidamente las perlas con 500 ml de tampón PNK helado. Ahorre un 5% de las perlas para el análisis de tinción occidental o plateada para confirmar la eficiencia de la inmunoprecipitación.
13. Aislamiento de ARN
- Recoger las perlas del paso 12.4 con un soporte magnético y quitar el búfer. Añadir 200 l de tampón de digestión de la proteína K (Tabla 1). Vórtice las perlas durante 30 min a 37oC con un mezclador térmico a 1.200 rpm (5 s de carrera, 30 s de parada). Aísle magnéticamente las perlas y tome el sobrenadante para el experimento.
- Añadir 400 l de reactivo de aislamiento de ARN(Tabla de materiales)al sobrenadante del paso 13.1, mezclar a fondo e incubar sobre hielo durante 5 min. Añadir 80 l de cloroformo y mezclar bien y luego incubar sobre hielo durante 5 min. Girar hacia abajo con 12.000 x g durante 10 min 4 oC.
NOTA: Este paso debe realizarse en una campana química. - Tome el sobrenadante (500 l) y agregue dos volúmenes de isopropanol:mezcla de etanol (1:1), 1/10 volumen de acetato de sodio de 3 M (pH a 5,5) y 1 l de glucógeno. Congelar a -20oC durante 2 h. Centrífuga a 4oC con 12.000 x g durante 20 min.
- Lavar el pellet 2x con etanol helado 70%. Gire hacia abajo el pellet a 4 oC con 12.000 x g durante 5 min. Retire el sobrenadante y seque el pellet. Disolver los ARN en 5 l de H2O libre de RNase.
14. 5' Ligadura del vinculador de ARN
- Haga una mezcla de ligadura de ARN de 5', con 1 l de tampón de ARN 10x, 0,5 l de BSA (1 g/L), 1 l de 10 mM de ATP, 1 ml de inhibidor de la ARNa y 0,5 l de ligasa de T4. El volumen total es de 4 ml por reacción.
- Añadir 1 l de 5' 20 m de enlace de ARN al ARN del paso 13.4, desnaturalizar el ARN calentando a 70 oC durante 2 min, y enfriar sobre hielo inmediatamente.
- Agregue la mezcla de ligadura de ARN de 5' al ARN del paso 14.2. Incubar a 16oC durante la noche.
15. Transcripción inversa
- Purifique los ARN como se describe en la sección 13 y disuelva el ARN con 11,5 l de agua libre de RNase.
- Añadir 1 l de imprimación de transcripción inversa de 10 m al ARN purificado, calentar a 70 oC durante 2 min y enfriar sobre hielo inmediatamente.
- Hacer una mezcla de transcripción inversa con 4 l de tampón de transcripción inversa de 5x, 1 l de dNTP de 10 mM, 1 l de 0,1 M de TDT, 1 l de inhibidor de la rena medida y 0,5 l de transcriptasa inversa(Tabla de materiales). El volumen total es de 7,5 ml por reacción.
- Añadir 7,5 l de mezcla de transcripción inversa al ARN, incubar a 50oC durante 30 min y detener la reacción por incubación a 70oC durante 10 min. Dejar a 4oC.
16. Amplificación de PCR
- Hacer una mezcla de amplificación de PCR con 15 l de mezcla maestra de PCR 2x(Tabla de materiales),5 l de ADNc de los pasos 15,4, 0,6 l de 10 m de imprimación directa 1(Tabla 2), 0,6 l de imprimación inversa de 10 m (Tabla 2), y 8,8 l de H.2. El volumen total es de 30 l.
- Amplificar el CDNA con los siguientes ajustes: 98oC 30 s, 98oC 10 s, 60oC 30 s, 72oC 30 s (repetir los pasos 2x4 para 15 a 20 ciclos), 72oC 2 min y mantener a 4oC. Ejecute el producto PCR con un gel de agarosa del 2%. Cortar el ADN de 100 a 150 bp, extraer ADN con kit de extracción de gel(Tabla de materiales)y eluir el ADN con 20 l de agua.
- Tomar 3 l del producto de PCR purificado, amplificar con la imprimación delantera 2 (Tabla 2) y la imprimación inversa 2 (imprimación de índice; Tabla 2) como se describe en el paso 16.2 durante cinco ciclos para introducir secuencias de índice. Purifique el producto PCR como se describe en el paso 16.2.
- Secuencia la biblioteca con una plataforma de secuenciación de alto rendimiento.
17. Análisis bioinformático
- Realizar análisis de datos utilizando programas comerciales como se describió anteriormente8.
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Representative Results
La representación esquemática del procedimiento FBIoCLIP-seq se muestra en la Figura 1. En comparación con la purificación de afinidad de un solo paso mediada por FLAG o extiptavidina, la purificación en tándem FLAG-biotina eliminó casi todas las proteínas copuradas, evitando la contaminación de las interacciones indirectas proteína-ARN (Figura 2). Los resultados representativos de FbioCLIP-seq para LIN28 y WDR43 se muestran en la Figura 3 y la Figura 4. Realizamos LIN28 o WDR43 FbioCLIP-seq con mESC. La Figura 3A muestra la vista de pista de LIN28 y WDR43 FbioCLIP-seq en pre-let-7g. El motivo GGAG reportado en pre-let-7g y los sitios reticulados identificados por FbioCLIP-seq se muestran en la Figura 3B. La clasificación de los sitios de mutación llamados por el algoritmo CIMS mostró que LIN28 prefiere unirse y enlazar a nucleótido G (Figura 3C). Los motivos de ARN enriquecidos en los sitios de enlace LIN28 FBIoCLIP-seq se muestran en la Figura 3D. Las pistas más representativas de FbioCLIP-seq en LIN28 y HNRNPU se muestran en la Figura 3E. La comparación de WDR43 y LIN28 FbioCLIP-seq mostró sus diferentes patrones de encuadernación en Rn45 pre-rRNA locus (Figura 4). La Figura 5 muestra los resultados representativos de la validación de etiquetas FLAG y biotina después de la construcción de la línea celular. La Figura 6 muestra los resultados representativos de la purificación en tándem eficiente (Figura 6A) o sin éxito (Figura 6B) FLAG-IP y FLAG-biotina.
Figura 1: Representación esquemática de FbioCLIP. Las celdas cruzadas UV (paso 1) se asignan en el búfer de lelisis (paso 2). El complejo FBRBP-RNA es inmunoprecipitado utilizando resina anti-FLAG (pasos 3-4). El complejo de ARN-proteína eluido se purifica aún más con perlas de estreptavidina y se utilizan condiciones de lavado estrictas para eliminar las interacciones proteína-proteína (pasos 5 a 6). Los ARN son parcialmente digeridos por MNase y los fragmentos de ARN no ligados a proteínas se eliminan mediante un lavado posterior (pasos 7 a 8). Los ARN se desfosforilan y ligan con un vinculador de 3' (paso 9). Luego, los ARN se fosforilan y se eluyen mediante el tratamiento con proteinasa K (paso 10). Los ARN purificados se ligan con un vinculador de ARN de 5' que contiene un código de barras aleatorio de 6 nt (paso 11). Después de la transcripción inversa (paso 12), la biblioteca cDNA se amplifica con PCR y se realiza la secuenciación de alto rendimiento (pasos 13-15). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La purificación en tándem FLAG-biotina elimina las proteínas copuradas. La tinción de plata de FBWDR43 mostró que casi todas las proteínas que interactúan presentadas en la purificación de un solo paso mediada por FLAG o biotina se eliminaron después de un estricto lavado en purificación en tándem. FLAG: Purificación de afinidad mediada por FLAG, SA: purificación de biotina mediada por estreptavidina, tándem: purificación en tándem FLAG-biotina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos de LIN28 FbioCLIP-seq. (A) Vista de pista de las etiquetas y lecturas de mutación LIN28 FBIoCLIP-seq llamadas por CIMS en ARN pre-let-7g. Las etiquetas que se muestran son lecturas únicas de FbioCLIP-seq. En total, se recuperaron 7,7 millones de lecturas únicas para LIN28 FbioCLIP-seq y 2,2 millones de lecturas únicas para WDR43 FbioCLIP-seq después de eliminar las lecturas redundantes. (B) Sitios reticulados sobre el motivo GGAG del ARN pre-let7-g de LIN28 FbioCLIP-seq. Las flechas indican los sitios vinculados. (C) Porcentaje de nucleótidos mutados en diferentes tipos de mutaciones. G es el nucleótido cruzado y mutado más frecuente. Aleatorio: distribución aleatoria de los cuatro nucleótidos. (D) Pronosticado motivos de unión LIN28 por FbioCLIP-seq con algoritmo HOMER. (E) Realizar un seguimiento de las vistas de LIN28 FbioCLIP-seq en los mRNAs LIN28 y HNRNPU. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de WDR43 y LIN28 FbioCLIP-seq en Rn45S locus. Vista de pista de WDR43 y LIN28 FbioCLIP-seq en Rn45S locus. WDR43 y LIN28 mostraron diferentes patrones de unión en pre-rRNA. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Resultados representativos de la validación de etiquetas FLAG y biotina. FLAG o biotina Western blot valida el etiquetado de las líneas celulares. Los clones #1, #2 y #4 mostraron una expresión eficiente y biotinilación de la etiqueta, mientras que #3 mostraron una mala expresión de la proteína etiquetada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Resultados representativos de la inmunoprecipitación FLAG y la validación de la eficiencia de purificación en tándem. (A) Ejemplo de purificación eficiente de proteínas etiquetadas por FLAG y purificación de afinidad de biotina. (B) Ejemplo de purificación ineficiente de proteína etiquetada por FLAG y purificación de afinidad de biotina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Búfer | Composición |
| Búfer de carga SDS | 50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 0.1% bromofenolblue, 10% glicerol, 100 mM TDT |
| Búfer de lavado A | 1x PBS, 0.5% NP-40, 0.5% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS |
| Búfer de lavado B | 5x PBS, 0.5% NP-40, 0.5% desoxicolato de sodio, 0.1% SDS |
| Tampón de lavado C | 50 mM Tris pH 7.4, 2% SDS |
| Tampón de lavado D | 5x PBS, 0.5% NP-40, 0.5% SDS, 1 M urea |
| Búfer PNK | 50 mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 10 mM MgCl2 |
| Búfer de reacción MNase | 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM CaCl2 |
| Buffer PNK+EGTA | 50 mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 10 mM EGTA |
| Tampón de digestión de la proteína K | 50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,5% SDS, 20 g de proteinasa K |
Tabla 1: Composición de los tampones utilizados en este estudio.
| Nombre del oligo | Secuencia | Notas | ||||
| 3' vinculador | rAppAGATCGGAAGAGCACACGTCT-NH2 | |||||
| 5' Enlace de ARN | GUUCAGAGUUCAGUCCGACGUCNNNNNN | |||||
| RT primer | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Entrada delantera 1 | GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC | |||||
| Imprimación inversa 1 | AGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Entrada delantera 2 | AATGATACGGGACCACCGAGATCTACACGTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC | |||||
| Imprimación inversa 2 | CAAGCAGAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTTCTCGTTCGATC-s-T | Las secuencias rojas y subrayadas representan la secuencia de índice de Illumina. | ||||
Tabla 2: Oligonucleótidos utilizados en este estudio.
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Discussion
Aquí presentamos un método CLIP-seq modificado llamado FbioCLIP-seq, aprovechando el sistema de doble etiquetado FLAG-biotina para realizar la purificación en tándem de los complejos de proteína-ARN. El sistema de doble etiquetado FLAG-biotina ha demostrado ser potente en la identificación de las interacciones proteína-proteína y proteína-ADN13,21. Aquí demostramos la alta especificidad y conveniencia de este sistema en la identificación de los ARN que interactúan con las proteínas. A través de la purificación en tándem y las estrictas condiciones de lavado, nos saltamos el desafiante paso de transferencia de membrana y SDS-PAGE, de modo que se conservaron más interacciones entre proteínas y ARN y para evitar señales de ARN contaminadas mediadas por RPP en el mismo complejo. Además, el bypass de estos pasos evita el etiquetado del ARN con ATP radiomarcado. Esto hace que el procedimiento sea mucho más fácil. Tenga en cuenta que durante la preparación de nuestra publicación, también se ha propuesto un método similar llamado uvCLAP24.
Varios pasos son importantes para el éxito del protocolo. En primer lugar, la eficiencia de la biotinilación de la proteína etiquetada debe ser confirmada por Western blot antes del experimento (Figura 5). En segundo lugar, se requiere la elución eficiente de proteína purificada por 3 x péptido FLAG para la amplificación exitosa de las señales de ARN. Las perlas del paso 12.4 deben analizarse con manchas de plata o manchas occidentales para garantizar que se recupera una cantidad decente de proteína diana(Figura 6). Para aumentar la eficiencia, aumente la concentración de péptidos FLAG de 3 x en el paso 6 hasta 500 ng/ml o repita el paso de elución varias veces para obtener una mejor producción. En tercer lugar, es óptimo valorar la concentración de MNase para cada proteína en el primer ensayo. La sobredigestión o el tratamiento insuficiente pueden conducir a fragmentos de ARN de tamaños inapropiados. Por último, el protocolo contiene dos rondas de purificación de afinidad y lavado altamente estricto. Solo se recupera una pequeña cantidad de ARN purificados. El reactivo debe estar libre de ARN y evitar la degradación del ARN después de la etapa de tratamiento con MNase.
A pesar de la facilidad de este método, todavía hay algunos aspectos que se pueden mejorar. Por ejemplo, la ligadura de un adaptador de 5' al ARN directamente puede limitar la recuperación de las señales porque una porción significativa de transcripción inversa será terminada por péptidos residuales reticulados. Nuestro estudio actual se basa principalmente en la expresión ectópica de proteínas etiquetadas, lo que puede conducir a algunos artefactos debido a la sobreexpresión de proteínas. Vale la pena mejorar el método mediante la introducción de la etiqueta en el locus endógeno. El sistema CRISPR/Cas9 hace que la construcción de la línea celular sea mucho más fácil y factible. Algunos estudios han aplicado el experimento eCLIP-seq a los tejidos de ratón25. La derivación de ratones knock-in con la etiqueta doble es también una dirección potencial y prometedora en la mejora y aplicación del método FBIoCLIP-seq. Además, la ligasa bacteriana de BirA expresada ectópicamente puede conducir a eventos inesperados de biotinilación in vivo. El etiquetado de la proteína también puede afectar sus funciones biológicas.
Un gran número de estudios han demostrado que la expresión génica y el epigenóma de las células son heterogéneos en lugar de totalmente homogéneos, lo que sugiere que es valioso estudiar la red de interacción a un nivel de una sola célula. Se han desarrollado varias estrategias para estudiar el transcriptoma y el epigenoma de células individuales. Sin embargo, no se han divulgado estrategias para analizar el interacto de ARN proteico a un nivel de una sola célula. Sin el funcionamiento del gel desnaturalado y los pasos de transferencia de membrana, FbioCLIP-seq puede preservar más señales, lo que lo convierte en una estrategia potencial para estudiar las interacciones proteína-ARN a nivel de una sola célula.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El apoyo a las subvenciones es del Programa Nacional de Investigación Básica de China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31630095) y el Centro de Ciencias de la Vida de la Universidad de Tsinghua.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
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