Summary
여기서 우리는 포유류 세포에서 RNA 결합 단백질 (RBPs)의 RNA 표적을 결정하기 위하여 플래그 비오틴 탠덤 정제를 가진 FbioCLIP-seq에게 불린 수정된 CLIP-seq 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
RNA 및 RNA 결합 단백질 (RBP)은 다중 생물학적 과정을 제어합니다. RNA 및 RBP의 공간 적 및 시간적 배열은 이러한 프로세스의 섬세한 조절에 기초합니다. CLIP-seq(교차 연결 및 면역 침전)라는 전략은 면역 강수량 다음으로 UV 교차 연결과 내인성 단백질-RNA 상호 작용을 포착하기 위해 개발되었습니다. RBP 연구에서 기존의 CLIP-seq 방법의 광범위한 사용에도 불구하고, CLIP 방법은 고품질 항체의 가용성, 코퓨화된 RBP의 잠재적 오염 물질, 동위원소 조작 요구 사항 및 지루한 실험 절차 중 정보의 잠재적 손실에 의해 제한됩니다. 여기서 우리는 플래그 비오틴 태그 탠덤 정화를 사용하여 FbioCLIP-seq라는 수정 된 CLIP-seq 방법을 설명합니다. 탠덤 정화 및 엄격한 세척 조건을 통해 거의 모든 상호 작용하는 RNA 결합 단백질이 제거됩니다. 따라서 이러한 공동화된 RBP에 의해 간접적으로 상호 작용하는 RNA도 감소된다. 우리의 FbioCLIP-seq 방법은 동위원소 가없고 단백질 특정 항체가 없는 방식으로 SDS-PAGE 및 멤브레인 이송 절차 없이 직접 단백질 바운드 RNA를 효율적으로 검출할 수 있습니다.
Introduction
RNA 및 RNA 결합 단백질(RBP)은 접합, 번역, 리보솜 생물발생, 후생유전학 적 조절 및 세포 운명 전이1,2,3,4,5,6을포함한 다양한 세포공정을제어한다. 이러한 프로세스의 섬세한 메커니즘은 RNA 및 RBP의 고유한 공간 및 측두화 배열에 따라 달라집니다. 따라서, 분자 수준에서 RNA 조절을 이해하는 중요한 단계는 RBP의 결합 부위에 대한 위치 정보를 공개하는 것이다.
교차 연결 및 면역 강수량(CLIP-seq)이라고 하는 전략은UV교차 연결과 단백질-RNA 상호 작용을 포착하고 관심 있는 단백질7의 면역 침전을 통해 개발되었다. 방법론의 주요 특징은 RNA 결합 단백질과 UV 조사8에의해 직접 결합된 RNA 분자(~1Å 내)사이의 공유 교차 링크유도이다. RBP 발자국은 일반적으로 30-60 nt의 해상도를 갖는 CLIP 태그 클러스터링 및 피크 호출에 의해 결정될 수 있습니다. 대안적으로, CLIP의 역전사 단계는 단일 뉴클레오티드 해상도에서 RNA에 단백질 결합 부위를 식별할 수 있는 교차 연결 부위에 대한 인델(삽입 또는 삭제) 또는 대체로 이어질 수 있다. Novoalign 및 CIMS와 같은 파이프라인은 CLIP-seq8의고처리량 시퀀싱 결과를 분석하기 위해 개발되었습니다. 몇몇 수정된 CLIP-seq 방법은 또한 개별-뉴클레오티드 분해능 교차 연결 및 면역 침전(iCLIP), 향상된 CLIP(eCLIP), irCLIP 및 광액활성 리보뉴클레오시드-향상된 상호 연결 및 면역침전(PAR-CLIP)9,10,11,12를포함하는 제안되었다.
RBP 연구에서 기존의 CLIP-seq 방법을 광범위하게 사용했음에도 불구하고 CLIP 메서드에는 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 지루한 변성 젤 전기포고및 멤브레인 전달 절차는 정보의 손실로 이어질 수 있으며, 제한된 서열 복잡성을 야기할 수 있다. 둘째, 단백질 특이적 항체 기반 CLIP 방법은 단일 표적 단백질 대신 단백질 복합체를 당기고, 이는 코퓨화된 RBP로부터 거짓 양성 단백질-RNA 상호작용으로 이어질 수 있다. 셋째, 항체 기반 전략은 고품질 항체없이 RBP의 연구에 적합하지 않은 이러한 방법의 적용을 가능하게 하는 고품질 항체의 다량이 필요하다. 넷째, 기존의 CLIP 방법은 단백질 바운드 RNA에 라벨을 붙이기 위해 무선 라벨ATP가 필요합니다.
생물학적 단백질에 대한 연쇄상 구도가 높기 때문에 특정 단백질이나 단백질 복합체를 정화하는 매우 강력한 접근법이 됩니다. 포유류 세포에서 자궁극피발성 세균비라 비오틴 리구아제에 의해 인공 펩티드 서열을 운반하는 단백질의 효율적인 생체자극화는 생체내13에서비오틴 정화를 수행하는 효율적인 전략이다. 플래그-비오틴 태그 탠덤정화(도 1)를이용하여 페토클립-세크(FLAG-Bio틴 매개 Cross-linking 및 Immunop회수 후 고처리량 시퀀싱)라는 수정된 CLIP-seq 방법을 개발하였다. 탠덤 정화 및 엄격한 세척 조건을 통해 거의 모든 상호 작용하는 RBP가 제거됩니다(그림2). 엄격한 세척 조건은 또한 SDS 페이지 와 멤브레인 전송을 우회 할 수 있습니다, 이는 노동 집약적이고 기술적으로 도전이다. 그리고 eCLIP 및 irCLIP과 유사, Fbio클립 - 세크 방법은 동위원소가 없습니다. 젤 실행 및 이송 단계를 건너뛰면 정보의 손실을 방지하고, 정통 단백질-RNA 상호 작용을 그대로 유지하며, 라이브러리 복잡성이 증가합니다. 또한, 태그 시스템의 높은 효율은 고품질 항체가 없는 RBP에 적합합니다.
여기서 우리는 포유류 세포에 대한 FbioCLIP-seq 프로토콜에 대한 단계별 설명을 제공합니다. 간략하게, 세포는 세포 용해 및 FLAG 면역 침전물 (FLAG-IP)에 선행된 254 nm UV에 의해 교차 연결됩니다. 다음으로, 단백질-RNA 복합체는 비오틴 친화성 포획에 의해 더욱 정제되고 RNA는 MNase와의 부분 소화에 의해 단편화된다. 이어서, 단백질 바운드 RNA는 3'링커로 탈포및 결찰된다. RNA가 PNK로 인포화되고 단백질제 K 소화에 의해 용출된 후에 5' RNA 링클러가 첨가됩니다. 역전사 후, 단백질 바운드 RNA 신호는 PCR에 의해 증폭되고 아가로즈 겔 정화에 의해 정제된다. 두 개의 RBP는 FbioCLIP-seq 결과를 예시하기 위해 선택되었습니다. LIN28은 마이크로RNA 성숙, 단백질 번역 및 세포 재프로그래밍15,16,17에관여하는 잘 특징적인 RNA 결합 단백질이다. WDR43은 리보솜 생체 발생, 진핵 전사 및 배아 줄기 세포 편성대조군(14,18)을조정하기 위해 생각되는 WD40 도메인 함유 단백질이다. 클립-세크와 LIN28에 대한 이전에 보고된 결과와 일치하여, FbioCLIP-seq는 마이크로RNA 미르-let7g 및 mRNAs16, 19 (그림 3)에서"GGAG"모티브에 LIN28의 결합 부위를 공개합니다. WDR43 FbioCLIP-seq는 또한 WDR43의 결합 선호도를 5' 외부 전사 스페이서(5'-ETS)로 확인하였다(도4). 이러한 결과는 FbioCLIP-seq 메서드의 신뢰성을 검증합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 셀라인 건설
- 관심 유전자를 PPiggyBac-FLAG-bio-[cDNA 의 관심]-(히그로마이신 내성) 플라스미드로 복제하여 플래그-비오틴에피토프(13,21)를 탑재하여 플래그-비오틴 태그 융합 RBP(FB RBP)를 발동한다.
- PBase 벡터를 가진 벡터를 비라효소(22)를발현하는 세포주로 의FBRBP 발현 벡터를 코트랜스펙트한다.
참고: 본 연구에서, FBRBP 유전자는 통합BirA 발현벡터(21)를운반하는 마우스 배아 줄기세포(mESC)로 전염되었다. 대안적으로, FBRBP 발현 벡터는 pBase 및 pPiggyBac-BirA-V5를 함께 세포로 결합할 수 있다. - 젤라틴화된 접시에 mESC에서 세포를 성장시키고 mES 배양배지(재료표)에서37°C에서 5%CO2로 유지한다. 1주일 동안 히그로마이신 b(100 μg/mL)를 가진 감염된 세포를 선택한다.
- 약물 선택 후, SDS 로딩버퍼(표 1)에의한 수확 세포를 수확하고, 각각 FLAG 항체 및 스트렙타비딘-HRP를 사용하여 유전자의 태그 및 발현을 확인하기 위해 서양블롯(23)을 사용한다.
2. 교차 연결
- 플레이트 ~3 x 106 mES 세포는 실험 1일 전에 10cm 플레이트에 있으므로 수확시 세포가 70-90%로 증가하도록 합니다(샘플당 5~1000만 세포).
- 진공 상태에서 매체를 제거합니다. 실온(RT)에서 2분 동안 2mL의 트립신-EDTA를 2mL로 처리하고 신선한 mESC 배지의 4mL로 트립신을 담금질한다. 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 이송합니다. 4°C에서 3분 동안 300 x g에서 원심분리로 세포를 회전시키고 상체를 제거합니다.
- 감기 PBS의 4mL로 세포를 중단하고 교차 연결을 위해 세포를 10cm 플레이트로 다시 플레이트로 플레이트한다. 254nm UV 광(400mJ/cm2의파라미터로 UV 크로스 링커설정)을 방사선으로 교차 연결합니다.
참고: 세포 단층의 경우, 세포는 트립신 치료 전에 플레이트에서 직접 UV 빛과 교차 연결할 수 있습니다. - 교차 연결된 셀을 15mL 튜브로 이송합니다. 4°C에서 3분 동안 300 x g에서 원심분리로 회전하고 상체를 제거합니다.
참고: 교차 연결된 세포 펠릿은 사용 전까지 -80°C로 저장할 수 있습니다.
3. 세포 리자테 준비
- 500 μL의 세척 버퍼 A(표 1)를가진 세포를 lyse 갓 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1/500 프로테아제 억제제 칵테일, 400 U /mL RNase 억제제. 세포를 RNase 가 없는 1.5 mL 튜브로 전송합니다. 4°C에서 부드러운 회전을 가진 로터에 30-60 분 동안 세포를 배양하십시오.
- 37°C에서 30 μL의 DNase I로 10분 동안 리세이트를 처리합니다. 0.5 M EDTA의 4 μL을 추가하여 반응을 중지합니다. 불용성 펠릿을 4°C에서 20분 동안 12,000x g로 회전시키고 상체를 새로운 프리킬드 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
참고: 즉시 사용하십시오, 얼음에 보관하십시오. 상체가 즉시 사용되지 않으면 사용 전까지 -80 °C에 보관하십시오.
4. 플래그 비즈 준비
- 샘플당 40 μL의 슬러리 플래그 비드를 신선한 1.5mL 튜브에 추가합니다.
- 0.5mL의 얼음 냉세척 버퍼 A로 구슬을 빠르게 씻고 4°C에서 2분 동안 3,000xg씩 회전합니다.
- 한 번 4.2 단계를 반복합니다. 4°C에서 2분 동안 3,000 x g로 구슬을 회전시합니다. 좁은 끝 파이펫 팁으로 버퍼를 조심스럽게 제거합니다. 구슬을 제거하지 마십시오.
5. 면역 침전
- 셀 용양을 3.2 단계에서 미리 평형된 플래그 비즈로 옮기습니다. 롤러 셰이커의 모든 샘플을 4°C에서 부드럽게 회전시합니다. 2-4 h 또는 하룻밤 동안 lysate와 플래그 구슬을 배양.
- 3,000 x g에서 2 분 동안 구슬을 원심 분리하고 상체를 제거합니다.
- 4°C에서 회전기에서 5분 동안 배양하여 0.5mL의 미리 냉각된 세척 버퍼 A로 구슬을 씻고, 구슬을 3,000 x g로 2분 동안 스핀다운하고 상복부을 제거합니다. 세척을 1x반복합니다.
- 전냉장 세척 버퍼B(표 1)의0.5mL로 5.3 단계에서 설명된 대로 세척 2x를 반복한다.
6. 3x 플래그 펩타이드를 장착한 용출
- 3x 플래그 용출 용액을 3x 플래그 용출 용액을 5mL의 워시 버퍼 A로 1 mg의 3x 플래그 펩타이드를 용해하여 최종 농도200 ng/mL로 준비합니다.
- 2 분 동안 3,000 x g로 5.4 단계에서 플래그 구슬을 회전합니다. 상체를 조심스럽게 제거합니다. 좁은 끝 파이펫 팁을 사용하여 대부분의 상체가 제거되었는지 확인합니다.
- 각 샘플에 3x FLAG 용출 용액의 200 μL을 추가합니다. 4°C에서 30분 동안 부드러운 회전으로 샘플을 배양합니다. 3,000 x g에서2 분 동안 플래그 구슬을 아래로 회전합니다. 수퍼네티를 신선한 튜브로 옮기.
- 6.2 및 6.3 단계에 설명된 대로 용출 2x를 반복하고 용출을 함께 풀을 놓습니다. 플래그 IP의 효율성을 확인하기 위해 서양 블롯 분석 또는 실버 염색용 용액의 5%를 저장합니다.
7. 스트렙타비딘 비즈 준비
- 각 샘플에 대해 스트렙타비딘 비드 슬러리의 50 μL을 준비합니다. 30s용 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 파이펫 팁으로 상퍼를 제거합니다.
- 0.5mL의 얼음 냉세척 버퍼 A로 구슬을 빠르게 씻고 30초간 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집합니다.
- 세척을 1x반복합니다. 세척 후 상체를 제거합니다.
8. 비오틴 친화성 정화
- 풀이 된 용용액을 6.4 단계에서 스트렙타비딘 구슬로 7.3 단계에서 옮기고 샘플을 4°C에서 1-3h 또는 하룻밤 동안 부드럽게 회전시로 옮기다.
- 30s용 자기 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 500 μL의 워시 버퍼 C(표 1)로구슬 2x를 5 분 동안 RT에서 부드러운 회전으로 씻으시다.
- 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 5 분 동안 RT에서 회전하여 워시 버퍼 D(표 1)의500 μL로 구슬 2x를 세척합니다.
- 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 상체를 제거합니다. 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL(표 1)로구슬 2x를 빠르게 세척하십시오.
9. 부분 RNA 소화
- MNase 반응 버퍼(표 1)와MNase의 10-5배 희석을 합니다. 각 샘플에 100 μL의 MNase 솔루션을 추가합니다. 10분 동안 1,200rpm(5s run, 30s stop)으로 설정된 열 믹서로 37°C에서 구슬을 소용돌이시키고, 30초 동안 자기 스탠드로 구슬을 수집하고 상복부을 제거한다.
참고: MNase의 농도는 다른 RNA 결합 단백질에 최적화되어야 합니다. 30-50 nt 단편으로 RNA를 소화할 수 있는 MNase 농도(최종 라이브러리의 삽입 크기에 의해 결정)가 최적입니다. - 얼음 차가운 PNK +EGTA 버퍼(표 1)의500 μL로 구슬 2x를 빠르게 씻으십시오. 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 각 세척 단계 사이의 상체를 제거합니다.
- RT에서 5분 동안 부드러운 회전으로 500 μL의 워시 버퍼 C로 구슬 2x를 씻으실 수 있습니다. 그런 다음 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척합니다.
10. RNA의 탈포시화
- 10x CIP버퍼(재료표),CIP 효소 3μL, 물 69μL의 8μL과 종아리 내장 인산염(CIP) 반응 혼합을 만드십시오. 총 부피는 반응당 80 μL입니다.
- 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 구슬에 CIP 반응 믹스를 추가합니다. 10 분 동안 1,200 rpm (5 s run, 30 s stop)에서 설정된 열 믹서가있는 37 °C에서 구슬을 소용돌이.
- 얼음 차가운 PNK+EGTA 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척합니다. 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척하십시오.
11. 3' 링커 합리화
- 20 μM 3' 링커 4μL, 10x T4 RNA 리구슬 완충제 4μL, 50% PEG8000의 4μL, T4 RNA 리개세 2(잘린) 2μL, 26 μL의 3'링커 믹스를 만듭니다. 총 부피는 반응당 40 μL입니다.
- 마그네틱 스탠드로 10.3 단계에서 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 3' 링커 계향 믹스의 40 μL을 비드에 추가합니다. 16°C에서 구슬을 1,200rpm(5s 런, 30s 스톱)에서 3시간 또는 1박동안 설정하여 구슬을 소용돌이시다.
- 얼음 차가운 PNK+EGTA 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척합니다. 얼음 차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬 2x를 빠르게 세척하십시오.
12. PNK 치료
- 10x PNK 버퍼 4μL, T4 PNK 효소 2μL, 10mM ATP 1μL, 33μL의 물과 함께 PNK 믹스를 만듭니다. 총 부피는 반응당 40 μL입니다.
- 마그네틱 스탠드로 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 비드에 PNK 믹스 40 μL을 추가합니다. 10 분 동안 1,200 rpm (5 s 실행, 30 s 스톱)에서 설정 된 열 믹서와 37 °C에서 부드럽게 구슬을 소용돌이.
- 얼음 차가운 PNK+EGTA 버퍼 500 μL로 구슬을 빠르게 세척합니다.
- 얼음-차가운 PNK 버퍼 500 μL로 구슬을 빠르게 씻으시면 됩니다. 면역 침전의 효율을 확인하기 위해 서양 또는 은 염색 분석을 위한 구슬의 5%를 저장합니다.
13. RNA 격리
- 자기 스탠드로 12.4 단계에서 구슬을 수집하고 버퍼를 제거합니다. 단백질제 K 소화버퍼(표 1)의200 μL을 추가합니다. 1,200 rpm (5 s 실행, 30 s 정지)에서 설정 된 열 믹서와 37 °C에서 30 분 동안 구슬을 소용돌이. 구슬을 자기적으로 분리하고 실험을 위해 상체를 복용합니다.
- RNA 격리 시약(재료표)의400μL을 13.1단계에서 상퍼에 넣고, 철저히 섞고, 얼음 위에서 5분 동안 배양한다. 80 μL의 클로로폼을 넣고 철저히 섞은 다음 얼음에 5분 동안 배양합니다. 10 분 4 °C에 대한 12,000 x g로 아래로 회전합니다.
참고: 이 단계는 화학 적 후드에서 수행해야합니다. - 상체(~500 μL)를 복용하고 이소프로판올 믹스(1:1), 3M 나트륨 아세테이트의 1/10 부피(pH = 5.5), 글리코겐 1μL을 추가합니다. 2 시간 동안 -20 °C에서 동결하십시오. 4°C의 원심분리기와 12,000 x g의 20분.
- 얼음 차가운 70 % 에탄올로 펠릿 2x를 씻으십시오. 펠릿을 4°C에서 5분 동안 12,000 x g로 회전시합니다. 상체를 제거하고 펠릿을 건조. RNA가 없는 H2O의 5μL로 RNA를 용해하십시오.
14. 5' RNA 링커 합리화
- 10x T4 RNA 리구효소 버퍼 1μL, BSA의 0.5 μL(1 μg/μL), 10mM ATP1 μL, RNase 억제제 1μL, T4 RNA 리게아제 0.5 μL의 RNA 결찰 혼합물을 만듭니다. 총 부피는 반응당 4μL입니다.
- 5' 20 μM RNA 링커의 1μL을 1단계13.4에서 RNA에 추가하고, RNA를 70°C에서 2분 동안 가열하여 건조시키고, 얼음에 즉시 냉각한다.
- 단계 14.2에서 RNA 결찰 믹스를 RNA에 추가합니다. 하룻밤 동안 16 °C에서 배양하십시오.
15. 역전사
- 섹션 13에 설명된 대로 RNA를 정화하고 RNase 가 없는 물의 11.5 μL로 RNA를 용해한다.
- 10 μM 역전사 프라이머의 1μL을 정제된 RNA에 넣고 70°C에서 2분 동안 가열하고 얼음에 즉시 식힙니다.
- 역전사 혼합을 5배 역전사 버퍼 4개, μL 10mDNTP 1μL, 0.1M DTT 1μL, RNase 억제제 1μL, 역전사 0.5μL(재료표)로역전전사 믹스를 만듭니다. 총 부피는 반응당 7.5 μL입니다.
- RNA에 역전사 믹스의 7.5 μL을 추가하고, 50°C에서 30분 동안 배양하고, 10분 동안 70°C에서 인큐베이션에 의한 반응을 중지한다. 4 °C에서 둡니다.
16. PCR 증폭
- PCR 증폭 믹스는 2x PCR 마스터 믹스(재료표), 10μM 전방 프라이머 1(표 2), 0.6 μL 10μM 역프라이머1(표 2),H2O의8.8 μL에서 15μL(재료표), 5μL의 cDNA를 15.4, 0.6 μL로 만듭니다. 총 부피는 30 μL입니다.
- 다음 설정으로 cDNA를 증폭: 98°C 30, 98°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s(15-20 사이클에 대한 2-4반복 단계), 72°C 2분, 4°C에서 유지. PCR 제품을 2-3% 아가로즈 젤로 실행합니다. ~100-150 bp의 DNA를 잘라내고, 젤 추출키트(재료 표)로 DNA를추출하고, 20 μL의 물로 DNA를 엘루트합니다.
- 정제된 PCR 제품의 3μL을 복용하고, 앞으로 프라이머2(표 2)및 역프라이머 2(인덱스 프라이머)로 증폭; 표 2) 인덱스 시퀀스를 도입하기 위해 5주기에 대해 16.2 단계에 설명된 바와 같이. 16.2 단계에서 설명된 대로 PCR 제품을 정화합니다.
- 처리량이 높은 시퀀싱 플랫폼으로 라이브러리를 시퀀싱합니다.
17. 생물정보학 분석
- 이전에 설명된8과같이 상용 프로그램을 사용하여 데이터 분석을 수행합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FbioCLIP-seq 절차의 회로도 표현은 그림 1에표시됩니다. 플래그 매개 또는 스트렙타비딘 매개 1단계 친화성 정화와 비교하여, FLAG-biotin 탠덤 정제는 거의 모든 코퓨화된 단백질을 제거하여 간접 단백질-RNA 상호작용의 오염을 피하였다(도2). LIN28 및 WDR43의 FbioCLIP-seq의 대표적인 결과는 그림 3과 그림 4에묘사되어 있습니다. 우리는 MESC와 LIN28 또는 WDR43 Fbio클립 - 세크를 수행했다. 그림 3A는 사전 렛-7g에서 LIN28 및 WDR43 FbioCLIP-seq의 트랙 뷰를 나타낸다. 보고된 GGAG 모티프는 7g 전과 FbioCLIP-seq에 의해 확인된 교차 연결된 사이트가 도 3B에표시됩니다. CIMS 알고리즘에 의해 불린 돌연변이 사이트의 분류는 LIN28가 G 뉴클레오티드에 결합하고 교차 연결하는 것을 선호하는 것을 보여주었다(도 3C). LIN28 FbioCLIP-seq 결합 부위의 농축 RNA 모티브는 도 3D에표시됩니다. LIN28과 HNRNPU의 FbioCLIP-seq의 대표 트랙은 그림 3E에표시됩니다. WDR43 및 LIN28 FbioCLIP-seq의 비교는 Rn45 프리 rRNA 궤적(도4)에서상이한 결합 패턴을 보였다. 도 5는 셀주 시공 후 플래그 및 비오틴 태그 유효성 검사의 대표적인 결과를 나타낸다. 도 6은 효율적(도6A)또는 실패(그림6B)플래그-IP 및 플래그-비오틴 탠덤 정제의 대표적인 결과를 나타낸다.
그림 1: FbioCLIP의 회로도 표현. UV 교차 연결 셀(1단계)은 용해 완충(2단계)에서 용해된다. FBRBP-RNA 복합체는 안티 플래그 수지(단계 3-4)를 사용하여 면역 절전을 한다. 발출 된 단백질 RNA 복합체는 스트렙타비딘 구슬로 더 정제되고 엄격한 세척 조건은 단백질 단백질 상호 작용을 제거하는 데 사용됩니다 (단계 5-6). RNA는 MNase에 의해 부분적으로 소화되고 비 단백질 바운드 RNA 단편은 추가 세척에 의해 제거됩니다 (단계 7-8). RNA는 3'링커 (단계 9)로 변조 및 결찰된다. 그런 다음 RNA는 인광을 증정하고 단백질AE K 처리 (단계 10)에 의해 용출된다. 정제 된 RNA는 6 nt 무작위 바코드를 포함하는 5' RNA 링커로 계각된다 (단계 11). 역전사(12단계)를 마친 후, cDNA 라이브러리는 PCR로 증폭되고 고처리량 시퀀싱이 수행된다(13-15단계). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 플래그-비오틴 탠덤 정제는 코퓨화된 단백질을 제거합니다. FBWDR43의 실버 염색은 플래그 또는 비오틴 매개 1단계 정제에 제시된 거의 모든 상호 작용 단백질이 탠덤 정화에서 엄격한 세척 후 제거된 것으로 나타났다. 플래그: 플래그 매개 친화성 정화, SA: 스트렙타비딘 매개 비오틴 정제, 탠덤: 플래그-비오틴 탠덤 정제. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: LIN28 FbioCLIP-seq의 대표적인 결과. (A)LIN28 FbioCLIP-seq 태그 및 돌연변이 판독을 사전 7g RNA에서 CIMS에 의해 호출된 추적보기. 표시된 태그는 FbioCLIP-seq의 고유한 읽기입니다. LIN28 FbioCLIP-seq에 대한 총 770만 개의 고유 읽기와 WDR43 FbioCLIP-seq에 대한 220만 개의 고유 읽기가 중복 읽기를 제거한 후 검색되었습니다. (B)LIN28 FbioCLIP-seq에 의해 사전 let7-g RNA의 GGAG 모티프에 교차 연결 된 사이트. 화살표는 교차 연결된 사이트를 나타냅니다. (C)돌연변이의 다른 모형에 있는 돌연변이된 뉴클레오티드의 백분율. G는 가장 빈번한 교차 연결 및 돌연변이 뉴클레오티드입니다. 무작위: 네 개의 뉴클레오티드의 무작위 분포. (D)호머 알고리즘을 가진 FbioCLIP-seq에 의해 예상 LIN28 바인딩 모티브. (E)LIN28 및 HNRNPU mRNAs의 LIN28 FbioCLIP-seq의 트랙 뷰. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: Rn45S 궤적에 대한 WDR43 및 LIN28 FbioCLIP-seq의 대표적인 결과. Rn45S 궤적에서 WDR43 및 LIN28 FbioCLIP-seq의 트랙 뷰. WDR43 및 LIN28은 rRNA 전형에 대해 상이한 결합 패턴을 보였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 플래그 및 비오틴 태그 유효성 검사의 대표적인 결과. 플래그 또는 비오틴 웨스턴 블롯은 세포주의 태그 지정을 검증합니다. 클론 #1, #2, #4 태그의 효율적인 발현 및 생체 자극을 보였으며 #3 태그된 단백질의 발현이 좋지 않습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 플래그 면역 침전 및 탠덤 정화 효율 검증의 대표적인 결과. (A)플래그 및 비오틴 친화성 정화에 의한 태그단백질의 효율적인 정제의 예. (b)플래그 및 비오틴 친화성 정화에 의한 태그단백질의 비효율적인 정제의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 버퍼 | 구성 |
| SDS 로드 버퍼 | 50 mM Tris pH 6.8, 2% SDS, 0.1% 브로모페놀블루, 10% 글리세롤, 100mMM DTT |
| 워시 버퍼 A | 1x PBS, 0.5% NP-40, 0.5% 디옥시콜레이트 나트륨, 0.1% SDS |
| 워시 버퍼 B | PBS 5배, NP-40 0.5%, 탈옥산나트륨 0.5%, SDS 0.1% |
| 워시 버퍼 C | 50 mM Tris pH 7.4, 2% SDS |
| 워시 버퍼 D | 5x PBS, 0.5% NP-40, 0.5% SDS, 1M 우레아 |
| PNK 버퍼 | 50 mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 10 mM MgCl2 |
| MNase 반응 버퍼 | 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM CaCl2 |
| PNK+EGTA 버퍼 | 50mM Tris pH 7.4, 0.5% NP-40, 10m EGTA |
| 프로틴아제 K 소화 버퍼 | 50mM Tris pH 7.4, 10mM EDTA, 50mM NaCl, 0.5% SDS, 단백질라제 K 20 μg |
표 1: 이 스터디에 사용되는 버퍼의 구성입니다.
| 올리고 이름 | 시퀀스 | 노트 | ||||
| 3' 링커 | 라파가트가가가카크CT-NH2 | |||||
| 5' RNA 링커 | 구카가구쿠아카쿠아케구카크가CGUCNNNNNNNNNNNNNNNN | |||||
| RT 프라이머 | AGACGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| 포워드 프라이머 1 | GTTCAGAGTTCC가그가CGATC | |||||
| 역프라이머 1 | AGACGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| 포워드 프라이머 2 | 아가타카가그타카가그타크타카가크타카가크타카그타카GTCCGAC | |||||
| 역프라이머 2 | CAAGGAAGAGGGAGGAGATCGGATGTGGACTGGAGTTCAGACGTGTTGTTCCGATC-S-T | 빨간색 및 밑줄 이면 은 일루미나 인덱스 시퀀스를 나타냅니다. | ||||
표 2: 이 연구에서 사용되는 올리고뉴클레오티드.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
여기서는 플래그-비오틴 이중 태깅 시스템을 활용하여 단백질-RNA 복합체의 탠덤 정제를 수행하기 위해 FbioCLIP-seq라는 수정된 CLIP-seq 방법을 소개합니다. FLAG-biotin 이중 태깅 시스템은 단백질 단백질 및 단백질-DNA 상호 작용13,21을식별하는 데 강력한 것으로 나타났습니다. 여기서 우리는 단백질과 상호 작용하는 RNA를 식별하는 이 시스템의 높은 특이성과 편리성을 보여줍니다. 탠덤 정화및 엄격한 세척 조건을 통해, 우리는 더 많은 단백질-RNA 상호 작용이 보존되고 동일한 복합체에서 RBP에 의해 매개되는 오염된 RNA 신호를 피하기 위하여 도전적인 SDS-PAGE 및 막 전달 단계를 건너뛰었습니다. 게다가, 이 단계의 우회는 방사선 표지ATP를 가진 RNA의 표시를 방지합니다. 이렇게 하면 절차가 훨씬 쉬워집니다. 우리의 출판을 준비하는 동안 uvCLAP라는 유사한 방법도24제안되었습니다.
프로토콜의 성공에 는 몇 가지 단계가 중요합니다. 첫째, 태그된 단백질의 생체자극의 효율은 실험 전에 서양 블롯에 의해 확인되어야한다(도 5). 둘째, RNA 신호의 성공적인 증폭을 위해서는 3x FLAG 펩타이드에 의한 정제 단백질의 효율적인 용출이 요구된다. 12.4단계의 구슬은 적당한 양의 표적 단백질이 회수될 수 있도록 서양 얼룩 또는 은 얼룩으로 분석되어야한다(도 6). 효율을 높이기 위해, 3 x FLAG 펩티드 농도를 최대 500 ng/mL 단계로 증가시키거나 용출 단계를 여러 번 반복하여 더 나은 생산을 얻습니다. 셋째, 첫 번째 시험에서 각 단백질에 대한 MNase 농도를 적정화하는 것이 최적입니다. 과다 소화 또는 불충분 한 처리 는 부적절한 크기의 RNA 단편으로 이어질 수 있습니다. 마지막으로, 프로토콜에는 두 차례의 친화 정화와 매우 엄격한 세척이 포함되어 있습니다. 소량의 정제 된 RNA만 검색됩니다. 시약은 RNase가 없어야하며 MNase 치료 단계 후 RNA 분해를 피해야합니다.
이 방법의 용이성에도 불구하고, 여전히 개선 할 수있는 몇 가지 측면이 있습니다. 예를 들어, RNA에 대한 5' 어댑터의 결찰은 역전사의 상당 부분이 잔류 교차 연결 펩티드에 의해 종료되기 때문에 신호의 회복을 직접 제한할 수 있다. 우리의 현재 연구는 주로 단백질 과발현으로 인해 일부 유물로 이어질 수 있는 태그가 붙은 단백질의 자궁 외 발현에 기초합니다. 내인성 궤적에 태그를 도입하여 방법을 개선할 가치가 있습니다. CRISPR/Cas9 시스템은 세포주 건설을 훨씬 쉽고 쉽게 만듭니다. 일부 연구는 마우스 조직에 eCLIP-seq 실험을 적용(25). 이중 태그로 노크인 마우스의 파생은 또한 FbioCLIP-seq 방법의 개선 및 적용에 있는 잠재력 및 유망한 방향이다. 더욱이, 자궁극기적으로 발현된 세균비라 리개스는 생체 내에서 예상치 못한 생체자극성 사건으로 이어질 수 있다. 단백질의 태깅은 또한 그것의 생물학 기능에 영향을 미칠 수 있습니다.
많은 연구는 세포의 유전자 발현 및 후성 유전체가 완전히 균일한 대신 이질적인 것으로 나타났으며, 이는 단일 세포 수준에서 상호 작용 네트워크를 연구하는 것이 중요하다는 것을 시사합니다. 단일 세포의 전사와 후성 유전체를 연구하기 위한 몇 가지 전략이 개발되었습니다. 그러나, 단일 세포 수준에서 단백질-RNA 상호작용을 분석하기 위한 전략은 보고되지 않았다. 변성 젤 실행 및 멤브레인 전송 단계 없이, FbioCLIP-seq 는 더 많은 신호를 보존할 수 있습니다., 단일 세포 수준에서 단백질-RNA 상호 작용을 연구 하는 잠재적인 전략.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
보조금 지원은 중국 국립 기초 연구 프로그램 (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), 중국 국립 자연 과학 재단 (31630095), 칭화 대학의 생명 과학 센터에서 입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
| Affinity Purification Beads | |||
| ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
| Reagents | |||
| 10x PBS | Gibco | 70013032 | |
| 3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
| 3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
| Glycogen | Ambion | AM9510 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
| MNase | NEB | M0247S | |
| NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
| reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
| RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
| RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
| RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
| T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
| T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
| Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
| mESC culture medium | |||
| DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
| FCS (15%) | Hyclone | ||
| Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
| LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
| NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
| Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
| Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
| Kit | |||
| DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates. Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).
- Guallar, D., et al. RNA-dependent chromatin targeting of TET2 for endogenous retrovirus control in pluripotent stem cells. Nature Genetics. 50 (3), 443-451 (2018).
- Holmqvist, E., Li, L., Bischler, T., Barquist, L., Vogel, J. Global Maps of ProQ Binding In Vivo Reveal Target Recognition via RNA Structure and Stability Control at mRNA 3' Ends. Molecular Cell. 70 (5), 971-982 (2018).
- Wei, C., et al. RBFox2 Binds Nascent RNA to Globally Regulate Polycomb Complex 2 Targeting in Mammalian Genomes. Molecular Cell. 62 (6), 875-889 (2016).
- Kim, D. S., et al. Activation of PARP-1 by snoRNAs Controls Ribosome Biogenesis and Cell Growth via the RNA Helicase DDX21. Molecular Cell. 75 (6), 1270-1285 (2019).
- Yao, R. W., et al. Nascent Pre-rRNA Sorting via Phase Separation Drives the Assembly of Dense Fibrillar Components in the Human Nucleolus. Molecular Cell. 76 (5), 767-783 (2019).
- Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
- Moore, M. J., et al. Mapping Argonaute and conventional RNA-binding protein interactions with RNA at single-nucleotide resolution using HITS-CLIP and CIMS analysis. Nature Protocols. 9 (2), 263-293 (2014).
- Konig, J., et al. iCLIP--transcriptome-wide mapping of protein-RNA interactions with individual nucleotide resolution. Journal of Visualized Experiments. (50), e2638 (2011).
- Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein-RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
- Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
- Hafner, M., et al. PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins. Journal of Visualized Experiments. (41), e2034 (2010).
- de Boer, E., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Bi, X., et al. RNA Targets Ribogenesis Factor WDR43 to Chromatin for Transcription and Pluripotency Control. Molecular Cell. 75 (1), 102-116 (2019).
- Heo, I., et al. TUT4 in concert with Lin28 suppresses microRNA biogenesis through pre-microRNA uridylation. Cell. 138 (4), 696-708 (2009).
- Cho, J., et al. LIN28A Is a Suppressor of ER-Associated Translation in Embryonic Stem Cells. Cell. 151 (4), 765-777 (2012).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Zhao, C., et al. Tissue specific roles for the ribosome biogenesis factor Wdr43 in zebrafish development. PLoS Genetics. 10 (1), 1004074 (2014).
- Wilbert, M. L., et al. LIN28 binds messenger RNAs at GGAGA motifs and regulates splicing factor abundance. Molecular Cell. 48 (2), 195-206 (2012).
- Hunziker, M., et al. UtpA and UtpB chaperone nascent pre-ribosomal RNA and U3 snoRNA to initiate eukaryotic ribosome assembly. Nature Communications. 7, 12090 (2016).
- Kim, J., Cantor, A. B., Orkin, S. H., Wang, J. L. Use of in vivo biotinylation to study protein-protein and protein-DNA interactions in mouse embryonic stem cells. Nature Protocols. 4 (4), 506-517 (2009).
- Li, Z., Michael, I. P., Zhou, D., Nagy, A., Rini, J. M. Simple piggyBac transposon-based mammalian cell expression system for inducible protein production. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (13), 5004-5009 (2013).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods in Molecular Biology. 1318, 87-96 (2015).
- Aktas, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
- Xu, Q., et al. Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59681 (2019).
