Her presenterer vi en modifisert CLIP-seq protokoll kalt FbioCLIP-seq med FLAG-biotin tandem rensing for å bestemme RNA mål av RNA-bindende proteiner (RBPs) i pattedyr celler.
RNA- og RNA-bindende proteiner (RBO-er) kontrollerer flere biologiske prosesser. Det romlige og timelige arrangementet av RNA-er og RBPer ligger til grunn for den delikate reguleringen av disse prosessene. En strategi kalt CLIP-seq (krysskobling og immunforebutning) er utviklet for å fange endogene protein-RNA interaksjoner med UV kryss-linking etterfulgt av immunprecipitation. Til tross for den brede bruken av konvensjonell CLIP-seq-metode i RBP-studien, er CLIP-metoden begrenset av tilgjengeligheten av antistoffer av høy kvalitet, potensielle forurensninger fra de copurified RBPs, kravet om isotopmanipulasjon og potensielt tap av informasjon under en kjedelig eksperimentell prosedyre. Her beskriver vi en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq ved hjelp av FLAG-biotin tag tandem rensing. Gjennom tandemrensing og strenge vaskeforhold fjernes nesten alle de interagerende RNA-bindende proteinene. Dermed reduseres RNA-ene som samhandler indirekte mediert av disse kopurifiserte RBP-ene også. Vår FbioCLIP-seq-metode muliggjør effektiv påvisning av direkte proteinbundne RNA-er uten SDS-PAGE- og membranoverføringsprosedyrer på en isotopfri og proteinspesifikk antistofffri måte.
RNAs og RNA-bindende proteiner (RBPs) kontrollerer ulike cellulære prosesser, inkludert skjøting, oversettelse, ribosombiogenese, epigenetisk regulering og celleskjebneovergang1,2,3,4,5,6. De delikate mekanismene i disse prosessene avhenger av det unike romlige og timelige arrangementet av RNAer og RBPer. Derfor er et viktig skritt mot å forstå RNA-regulering på molekylært nivå å avsløre posisjonsinformasjon om de bindende stedene til RBPs.
En strategi referert til som kryss-linking og immunprecipitation (CLIP-seq) er utviklet for å fange protein-RNA interaksjoner med UV kryss-linking etterfulgt av immunforutslettelse av protein av interesse7. Hovedtrekket ved metodikken er induksjon av kovalente kryssforbindelser mellom et RNA-bindende protein og dets direkte bundne RNA-molekyler (innen ~ 1 Å) ved UV-bestråling8. RBP-fotavtrykkene kan bestemmes av CLIP-kodeklynging og toppsamtaler, som vanligvis har en oppløsning på 30-60 nt. Alternativt kan det omvendte transkripsjonstrinnet i CLIP føre til indels (innsettinger eller slettinger) eller erstatninger til krysskoblingsstedene, noe som gjør det mulig å identifisere proteinbindingssteder på RNA-ene ved en enkeltkjerneotidoppløsning. Rørledninger som Novoalign og CIMS er utviklet for analyse av sekvenseringsresultatene med høy gjennomstrømning av CLIP-seq8. Flere modifiserte CLIP-seq metoder har også blitt foreslått, inkludert individuell-nukleotid oppløsning kryss-linking og immunoprecipitation (iCLIP), forbedret CLIP (eCLIP), irCLIP, og fotoaktiv ribonucleoside-forbedret kryss-linking og immunoprecipitation (PAR-CLIP)9,10,11,12.
Til tross for den brede bruken av tradisjonelle CLIP-seq metoder i studien av RBPs, har CLIP-metodene flere ulemper. For det første kan den kjedelige denaturerte gelelektroforese og membranoverføringsprosedyren føre til tap av informasjon, og forårsake begrenset sekvenskompleksitet. For det andre kan den proteinspesifikke antistoffbaserte CLIP-metoden trekke ned et proteinkompleks i stedet for et enkelt målprotein, noe som kan føre til falske positive protein-RNA-interaksjoner fra de copurified RBPs. For det tredje krever den antistoffbaserte strategien en stor mengde antistoffer av høy kvalitet, noe som gjør anvendelsen av disse metodene utilstrekkelig for studiet av RBPs uten antistoffbaserte antistoffer tilgjengelige. For det fjerde krever den tradisjonelle CLIP-metoden radiomerket ATP for å merke de proteinbundne RTA-ene.
Den høye affiniteten til streptavidin til biotinylererte proteiner gjør det til en svært kraftig tilnærming for å rense spesifikke proteiner eller proteinkomplekser. Effektiv biotinylering av proteiner som bærer en kunstig peptidsekvens ved ektopisk uttrykt bakteriell BirA biotin ligase i pattedyrceller gjør det til en effektiv strategi for å utføre biotinrensing in vivo13. Vi utviklet en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq(FLAG-Biotinn-mediert Cross-linking og jegmmunoprecipitation etterfulgt av høy gjennomstrømning sekvensering) ved hjelp av FLAG-biotin tag tandem rensing14 (Figur 1). Gjennom tandemrensing og strenge vaskeforhold fjernes nesten alle de interagerende RBPs (figur 2). De strenge vaskeforholdene gjør det også mulig å omgå SDS-PAGE og membranoverføring, som er arbeidsintensiv og teknisk utfordrende. Og i likhet med eCLIP og irCLIP, er FbioCLIP-seq-metoden isotopfri. Hoppe gel kjører og overføring trinn unngår tap av informasjon, holder autentisk protein-RNA interaksjoner intakt, og øker biblioteket kompleksitet. Videre gjør den høye effektiviteten av merkesystemet det til et godt valg for RBPs uten høykvalitets antistoffer tilgjengelig.
Her gir vi en trinnvis beskrivelse av FbioCLIP-seq-protokollen for pattedyrceller. Kort sagt, celler er krysskoblet av 254 nm UV, etterfulgt av cellelysis og FLAG immunprecipitation (FLAG-IP). Deretter blir protein-RNA-kompleksene ytterligere renset av biotin affinitetsfangst og RNA-er fragmentert av delvis fordøyelse med MNase. Deretter er den proteinbundne RNA defosforylert og ligated med en 3’linker. En 5′ RNA linker tilsettes etter at RNA er fosforylert med PNK og eluted av proteinase K fordøyelsen. Etter omvendt transkripsjon forsterkes de proteinbundne RNA-signalene av PCR og renses ved agarose gelrensing. To RBPs ble valgt til å eksemplifisere FbioCLIP-seq resultatet. LIN28 er et godt karakterisert RNA-bindende protein involvert i microRNA modning, proteinoversettelse og celleomprogrammering15,16,17. WDR43 er et WD40-domeneholdig protein som antas å koordinere ribosometbiogenese, eukaryotisk transkripsjon og embryonal stamcellepuripotencykontroll14,18. I samsvar med tidligere rapporterte resultater for LIN28 med CLIP-seq, avslører FbioCLIP-seq bindende nettsteder av LIN28 på “GGAG” motiver i microRNA mir-let7g og mRNAs16,19 ( Figur3). WDR43 FbioCLIP-seq identifiserte også den bindende preferansen til WDR43 med 5′ eksterne transkriberte avstandssyr (5′-ETS) av pre-rRNAs20 (figur 4). Disse resultatene validerer påliteligheten til FbioCLIP-seq-metoden.
Her introduserer vi en modifisert CLIP-seq metode kalt FbioCLIP-seq, dra nytte av FLAG-biotin dobbel merking system for å utføre tandem rensing av protein-RNA komplekser. FLAG-biotin dobbelt merking systemet har vist seg å være kraftig i å identifisere protein-protein og protein-DNAinteraksjoner 13,21. Her demonstrerer vi den høye spesifisiteten og bekvemmeligheten til dette systemet i å identifisere RNAs som samhandler med proteiner. Gjennom ta…
The authors have nothing to disclose.
Grant støtte er fra National Basic Research Program of China (2017YFA0504204, 2018YFA0107604), National Natural Science Foundation of China (31630095), og Center for Life Sciences ved Tsinghua University.
Equipment | |||
UV crosslinker | UVP | HL-2000 HybrilLinker | |
Affinity Purification Beads | |||
ANTI-FLAG beads | Sigma-Aldrich | A2220 | |
Streptavidin beads | Invitrogen | 112.06D | |
Reagents | |||
10x PBS | Gibco | 70013032 | |
3 M NaOAc | Ambion | AM9740 | |
3 x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
ATP | Sigma-Aldrich | A6559 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | |
CIP | NEB | M0290S | CIP buffer is in the same package. |
DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
Gel purification kit | QIAGEN | 28704 | |
Glycogen | Ambion | AM9510 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 449172 | |
MNase | NEB | M0247S | |
NP-40 | Amresco | M158-500ML | |
PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
Porteinase K | TAKARA | 9033 | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | 0492S | |
reverse trancriptase (SupperScriptIII) | Invitrogen | 18080093 | |
RNA isolation reagent (Trizol) | Invitrogen | 15596018 | |
RNase Inhibitor | ThermoFisher | EO0381 | |
RNaseOUT | Invitrogen | 10777019 | |
RQ1 Dnase | Promega | M6101 | |
SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
T4 PNK | NEB | M0201S | PNK buffer is in the same package. |
T4 RNA ligaes | ThermoFisher | EL0021 | T4 RNA ligase buffer and BSA are in the same package. |
T4 RNA ligase2, truncated | NEB | M0242S | T4 RNA ligase buffer and 50% PEG are in the same package. |
Trypsin-EDTA | ThermoFisher | 25200072 | |
Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | |
mESC culture medium | |||
DMEM (80%) | Gibco | 11965126 | |
2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | |
FCS (15%) | Hyclone | ||
Glutamax (1%) | Gibco | 35050061 | |
LIF | purified recombinant protein; 10,000 fold dilution | ||
NEAA (1%) | Gibco | 11140050 | |
Nucleoside mix (1%) | Millipore | ES-008-D | |
Penicillin-Streptomycin (1%) | Gibco | 15140122 | |
Kit | |||
DNA gel extraction kit | QIAGEN | 28704 |