يصف هذا البروتوكول الخطوات الحرجة المطلوبة لإنشاء وتنمية ثقافات الخلايا البُلية القرنية من النباتات المنفّزة للأنسجة البشرية أو الأغنام. كما يتم تقديم طريقة لباطن القرنية الخلايا الفرعية على المواد الحيوية الميمبية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نمو الإنسان والأغنام القرنية خلايا الخلايا الانبذيلية على الأغشية الحيوية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الخلايا الانجيلية القرنية الثقافات لديها ميل للخضوع للانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) بعد فقدان الاتصال من خلية إلى خلية. EMT هو ضار للخلايا لأنه يقلل من قدرتها على تشكيل طبقة ناضجة ووظيفية. هنا، نقدم طريقة لإنشاء وsubculturing الإنسان والأغنام الخلايا القرنية الخلايا البُنالتي ة التي تقلل من فقدان الاتصال من خلية إلى خلية. تؤخذ النباتات الإكسابيتية لبطانة القرنية/غشاء ديسميت من القرنيات المانحة وتوضع في زراعة الأنسجة في ظل ظروف تسمح للخلايا بالهجرة الجماعية على سطح الثقافة. وبمجرد تأسيس ثقافة ما، يتم نقل النباتات الجديدة إلى أطباق جديدة لبدء ثقافات جديدة. يستخدم Dispase II لرفع كتل من الخلايا بلطف من لوحات زراعة الأنسجة للاستزراع الفرعي. تعتبر ثقافات الخلايا البُلية القرنية التي تم تأسيسها باستخدام هذا البروتوكول مناسبة لنقلها إلى أغشية المواد الحيوية لإنتاج طبقات خلايا مصممة على الأنسجة لزرعها في التجارب على الحيوانات. يتم وصف جهاز مصنوع خصيصًا لدعم الأغشية الحيوية أثناء زراعة الأنسجة ، ويتم تقديم مثال على الكسب غير المشروع المهندس بالأنسجة المكون من طبقة من الخلايا البطانة القرنية وطبقة من الخلايا النجمية القرنية على جانبي غشاء الكولاجين من النوع الأول.
المقدمة
القرنية هي نسيج شفاف يقع في الجزء الأمامي من العين. وهو يتألف من ثلاث طبقات رئيسية: طبقة ظهارية على السطح الخارجي، طبقة ستروما الأوسط، وطبقة داخلية تسمى بطانة القرنية. بطانة القرنية هو طبقة أحادية من الخلايا التي تقع على غشاء الطابق السفلي يسمى غشاء Descemet ويحافظ على شفافية القرنية من خلال تنظيم كمية السوائل التي تدخل ستروما من الفكاهة المائية الكامنة. الكثير من السوائل داخل ستروما يسبب تورم القرنية, التعتيم وفقدان البصر. وبالتالي فإن البطانة أمر حيوي للحفاظ على الرؤية.
يمكن أن يصبح بطانة القرنية مختلة لعدد من الأسباب بما في ذلك الشيخوخة والمرض والإصابة ، والعلاج الحالي الوحيد هو جراحة زرع الأعضاء. خلال هذه الجراحة ، تتم إزالة البطانية وغ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم الحصول على القرنيات البشرية بموافقة المانحين للبحث من بنك كوينزلاند للعيون واستخدمت بموافقة أخلاقية من مستشفى مترو ساوث ولجنة أخلاقيات البحوث البشرية التابعة للدائرة الصحية (HREC/07/QPAH/048). تم الحصول على قرنيات الأغنام من الحيوانات المنهوبة في مرفق هيرستون للبحوث الطبية التابع لجامعة كوينزلاند بموجب اتفاق لتقاسم الأنسجة.
1. إعداد أدوات تشريح
- تعقيم اثنين من أزواج من عدد 4 ملقط صانع الساعات إما عن طريق نقع لهم في حل من الإيثانول 70٪ لمدة 5 دقيقة أو عن طريق التعقيم لهم.
2. إعداد لوحات ثقافة الثقافة المتوسطة والأنسجة
- إعداد 100 مل من وسط الثقافة التي تحتوي على Opti-MEM 1 (1x) + GlutaMAX....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم تلخيص طريقة عزل وتوسيع الخلايا القرنية البُنالتية من القرنيات البشرية أو الأغنام في الشكل 1 والشكل 2. معظم النباتات المشتقة من القرنيات من 1 إلى 2 سنة الأغنام أو المتبرعين الإنسان أقل من 30 سنة من العمر سوف نعلق على لوحات زرع الأنسجة المغلفة عامل المرفق في غضون أسبوع، ومع ذلك، فإنه ليس من غير المألوف أن تجد أن ما يصل إلى ثلث explants تفشل في إرفاق داخل هذا الوقت. يمكن إزالة هذه النباتات "العائمة" من الثقافات. النباتات المجهولة من المتبرعين البشريين الذين تزي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وهناك تحد تقني كبير المرتبطة إنشاء وتوسيع الخلايا البُنْدِية القرنية البشرية هو منع EMT من الحدوث في الثقافات. يمكن أن يتم تشغيل EMT في الخلايا البطانة القرنية عن طريق فقدان الاتصال من خلية إلى خلية، ولكن معظم بروتوكولات ثقافة الخلية لهذه الخلايا تنطوي على التفكك الأنزيمي لخلايا واحدة أثناء العزلة والثقافة الفرعية10. هنا نقدم بروتوكول ثقافة الخلايا البديلة للخلايا البديلية القرنية التي تقلل من خطر فقدان الخلايا الاتصال مع بعضها البعض خلال مراحل العزل والثقافة الفرعية.
ل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
بفضل نويمي غالوريني على مساعدتها أثناء إعداد الشكل 7. وقد دعم هذا العمل منحة مشروع ممنوحة إلى وزارة الصحة من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (منحة المشروع 1099922)، وبتمويل تكميلي تلقته مؤسسة معهد كوينزلاند للعيون.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| عامل التعلق | Gibco | S006100 | محلول معقم 1X يحتوي على الجيلاتين الذي يستخدم لتغطية أسطح زراعة الأنسجة. يخزن في درجة حرارة 4 درجات مئوية. |
| مستخلص الغدة النخامية البقري | Gibco | 13028014 | قارورة واحدة تحتوي على 25 مجم. |
| كلوريد الكالسيوم | Merck | C5670 | يذوب في HBSS لعمل محلول مخزون 1 ملم. تعقيم الفلتر. |
| أنبوب الطرد المركزي ، 50 مل | Labtek | 650.550.050 | |
| كبريتات شوندروتن | مختبرات | LKT C2960 | هذا هو كبريتات شوندروتن البقرية. يذوب في HBSS لعمل محلول مخزون 0.08 جم / مل. تصفية التعقيم والتجميد في الحصص العليا. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | يذوب في DPBS لعمل محلول مخزون 2 مجم / مل. تصفية التعقيم والتجميد في الحصص العليا. |
| يجب تخفيف الإيثانول | Labtek | EA043 | 100٪ الإيثانول غير المشوه بنسبة 70٪ في الماء منزوع الأيونات لتعقيم الأدوات والأسطح. |
| مصل الأبقار الجنيني | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | هذه علامة تجارية HyClone من مصل الأبقار الجنينية. |
| الغطاء الزجاجي رقم 1 ، & Oslash ؛ 13 مم | Proscitech | G401-13 | ضع الغطاء المعقم في 24 لوحا بئر لزراعة الأنسجة. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | محلول الملح المتوازن من هانك ، 1X ، يحتوي على كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم. |
| حمض الأسكوربيك 2-فوسفات | Merck | A8960 | يذوب في HBSS لصنع محلول مخزون 150 ملم. تعقيم الفلتر. |
| Micro-Boyden Chamber | Components Pty. Ltd. | الحلقة العلوية: QUT-0002-0006 ، الحلقة الأساسية: QUT-0002-0007 | كلا المكونين مصنوعان من polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| حلقة O لغرفة Boyden الصغيرة | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | تتكون من مطاط السيليكون. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | وسط مصل منخفض يحتوي على الجلوتامين. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco ، 1X ، بدون كلوريد الكالسيوم وكلوريد المغنيسيوم. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | محلول مضاد حيوي 100X يحتوي على 10,000 وحدة / مل بنسلين و 10,000 ميكرو ؛ جم / مل ستربتومايسين. |
| طبق بتري | Sarstedt | 82.14473.001 | طبق بتري معقم ، 92 × 16 مم ، لتشريح الأنسجة. |
| صفيحة زراعة الأنسجة ، 24 بئر | Corning Incorporated | Costar 3524 | صفيحة تحتوي على 24 بئرا ، تبلغ مساحة سطح كل منها 2 سم < > 2 < / sup>. |
| لوحة زراعة الأنسجة ، 6 آبار | Corning Incorporated | Costar 3516 | صفيحة تحتوي على 6 آبار ، كل منها بمساحة سطح 9 سم < سوب > 2 < / سوب>. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | محلول إنزيم 1X لتفكيك الخلايا. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | حل 1X EDTA لتفكيك الخلايا. |
| ملقط صانع الساعات | Labtek | BWMF4 | ملقط صانع الساعات رقم 4 بشكل جيد لإزالة شرائط البطانة / غشاء Descemet من القرنية. |
المراجع
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
