نمو الإنسان والأغنام القرنية خلايا الخلايا الانبذيلية على الأغشية الحيوية
Summary
يصف هذا البروتوكول الخطوات الحرجة المطلوبة لإنشاء وتنمية ثقافات الخلايا البُلية القرنية من النباتات المنفّزة للأنسجة البشرية أو الأغنام. كما يتم تقديم طريقة لباطن القرنية الخلايا الفرعية على المواد الحيوية الميمبية.
Abstract
الخلايا الانجيلية القرنية الثقافات لديها ميل للخضوع للانتقال الظهاري إلى mesenchymal (EMT) بعد فقدان الاتصال من خلية إلى خلية. EMT هو ضار للخلايا لأنه يقلل من قدرتها على تشكيل طبقة ناضجة ووظيفية. هنا، نقدم طريقة لإنشاء وsubculturing الإنسان والأغنام الخلايا القرنية الخلايا البُنالتي ة التي تقلل من فقدان الاتصال من خلية إلى خلية. تؤخذ النباتات الإكسابيتية لبطانة القرنية/غشاء ديسميت من القرنيات المانحة وتوضع في زراعة الأنسجة في ظل ظروف تسمح للخلايا بالهجرة الجماعية على سطح الثقافة. وبمجرد تأسيس ثقافة ما، يتم نقل النباتات الجديدة إلى أطباق جديدة لبدء ثقافات جديدة. يستخدم Dispase II لرفع كتل من الخلايا بلطف من لوحات زراعة الأنسجة للاستزراع الفرعي. تعتبر ثقافات الخلايا البُلية القرنية التي تم تأسيسها باستخدام هذا البروتوكول مناسبة لنقلها إلى أغشية المواد الحيوية لإنتاج طبقات خلايا مصممة على الأنسجة لزرعها في التجارب على الحيوانات. يتم وصف جهاز مصنوع خصيصًا لدعم الأغشية الحيوية أثناء زراعة الأنسجة ، ويتم تقديم مثال على الكسب غير المشروع المهندس بالأنسجة المكون من طبقة من الخلايا البطانة القرنية وطبقة من الخلايا النجمية القرنية على جانبي غشاء الكولاجين من النوع الأول.
Introduction
القرنية هي نسيج شفاف يقع في الجزء الأمامي من العين. وهو يتألف من ثلاث طبقات رئيسية: طبقة ظهارية على السطح الخارجي، طبقة ستروما الأوسط، وطبقة داخلية تسمى بطانة القرنية. بطانة القرنية هو طبقة أحادية من الخلايا التي تقع على غشاء الطابق السفلي يسمى غشاء Descemet ويحافظ على شفافية القرنية من خلال تنظيم كمية السوائل التي تدخل ستروما من الفكاهة المائية الكامنة. الكثير من السوائل داخل ستروما يسبب تورم القرنية, التعتيم وفقدان البصر. وبالتالي فإن البطانة أمر حيوي للحفاظ على الرؤية.
يمكن أن يصبح بطانة القرنية مختلة لعدد من الأسباب بما في ذلك الشيخوخة والمرض والإصابة ، والعلاج الحالي الوحيد هو جراحة زرع الأعضاء. خلال هذه الجراحة ، تتم إزالة البطانية وغشاء Descemet من قرنية المريض واستبدالها بطعم البطانة وغشاء Descemet الذي تم الحصول عليه من القرنية المانحة. العديد من الطعوم بطانة تحتوي أيضا على طبقة رقيقة من الأنسجة سترومال للمساعدة في التعامل مع وتعلق القرنيةالمضيفة 1.
في جميع أنحاء العالم ، فإن الطلب على أنسجة القرنية المانحة لعمليات زرع الأعضاء أكبر من الكمية التي يمكن توفيرها من قبل بنوك العيون2. لذلك كان هناك دافع لتطوير زرع بطانة القرنية المهندسة الأنسجة التي يمكن استخدامها لتخفيف هذا النقص3. ويستند الأساس المنطقي لذلك على حقيقة أنه في الوقت الحالي ، لا يمكن نقل البطانة من القرنية الفردية إلا إلى مريض واحد ، ومع ذلك ، إذا تم توسيع الخلايا البطانية القرنية أولاً ونمت على السقالات الحيوية في زراعة الأنسجة ، يمكن استخدامها لعلاج مرضى متعددين.
التحديات الرئيسية التي تحتاج إلى معالجة قبل زرع بطانة القرنية المهندسة الأنسجة تصبح خيارا ممكنا للجراحين وتشمل: (1) إنشاء تقنيات لتوسيع خلايا بطانة القرنية ذات جودة عالية ولإنتاج ناضجة و طبقات الخلايا البطانية القرنية الوظيفية في المختبر، و (2) إنشاء تقنيات لزراعة الخلايا على السقالات الحيوية لإنتاج الطعوم المهندسة الأنسجة التي تساوي، أو أفضل من، الطعوم المشتقة من القرنية المانحة التي تستخدم حاليا.
الخلايا القبطانية القرنية لديها إمكانات التكاثر منخفضة جدا في الجسم الحي ولكن يمكن تحفيزها لتقسيم في المختبر4. ومع ذلك ، لديهم ميل قوي للخضوع في المختبر الظهارية إلى mesenchymal الانتقال (EMT) ، مما يقلل من قدرتها على تشكيل ناضجة ، طبقة البطانية وظيفية. مشغلات معروفة لEMT في الخلايا البُنفية القرنية تشمل التعرض لعوامل نمو معينة وفقدان الاتصال من خلية إلى خلية5. وبالتالي فمن المحتم تقريبا أن ثقافات الخلايا البطانة القرنية التي هي الانزيمية المنفصلة خلال الثقافة الفرعية سوف تخضع للتغييرات المرتبطة EMT. هنا ، نقدم طريقة زراعة الخلايا للخلايا البُنَية القرنية البشرية أو الخرافية التي تم تصميمها لتقليل اضطراب الاتصالات من خلية إلى خلية أثناء مراحل العزل والتوسع والثقافة الفرعية ، للحد من احتمال ية حدوث EMT. وعلاوة على ذلك، فإننا نبين كيف يمكن إنتاج الطعوم المهندسة من الأنسجة التي تشبه البطانة المشتقة من القرنية المانحة/الطعوم النسيجية/الأنسجة النجمية من خلال نمو طبقات الخلايا المستزرعة على جانبي غشاء المادة الحيوية في جهاز تركيب مصنوع خصيصًا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك تحد تقني كبير المرتبطة إنشاء وتوسيع الخلايا البُنْدِية القرنية البشرية هو منع EMT من الحدوث في الثقافات. يمكن أن يتم تشغيل EMT في الخلايا البطانة القرنية عن طريق فقدان الاتصال من خلية إلى خلية، ولكن معظم بروتوكولات ثقافة الخلية لهذه الخلايا تنطوي على التفكك الأنزيمي لخلايا واحدة أثنا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بفضل نويمي غالوريني على مساعدتها أثناء إعداد الشكل 7. وقد دعم هذا العمل منحة مشروع ممنوحة إلى وزارة الصحة من المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية في أستراليا (منحة المشروع 1099922)، وبتمويل تكميلي تلقته مؤسسة معهد كوينزلاند للعيون.
Materials
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
