Summary
פרוטוקול זה מתאר את הצעדים הקריטיים הנדרשים כדי ליצור ולגדל תרביות תאים של הקרנית מפני הצמח של רקמת האדם או הכבשים. שיטה לתאי הקרנית משנית של תאים אנדותל על קרומי ביוארילים מוצג גם.
Abstract
לתרביות תאים של הקרנית אנדותל יש נטייה לעבור מעבר אפיתל-אל-mesenchymal (חובש) לאחר אובדן של קשר תא לתאים. צוות החירום מקטין את התאים כאשר הוא מפחית את יכולתם ליצור שכבת בוגרת ופונקציונלית. כאן, אנו מציגים שיטה להקמת ולתת האנושית וכבשים הקרנית מתרביות תאים אנדותל ממזער את אובדן של מגע תא אל התא. הקרום של ממברנה של הקרנית אנדותל/הורד באמת נלקח מקרניות תורמות וממוקמות בתוך התרבות הרקמה בתנאים המאפשרים לתאים להגר באופן קולקטיבי אל משטח התרבות. לאחר הקמת תרבות, האקסוצמחים מועברים לצלחות טריות כדי ליזום תרבויות חדשות. Dispase II משמש כדי להרים בעדינות גושים של תאים מתוך לוחיות התרבות רקמות עבור subculturing. תרביות תאים של הקרנית אנדותל אשר הוקמו באמצעות פרוטוקול זה מתאימים להעברת לממברנות ביואטימי כדי לייצר שכבות תא רקמות מהונדסים להשתלה בניסויים בבעלי חיים. מכשיר בהזמנה מותאמת אישית לתמיכה ביואגמי-ממברנות במהלך תרבות הרקמה מתואר ודוגמה של השתלת רקמה מהונדסים מורכב שכבה של תאי הקרנית אנדותל ושכבה של תאים סטרומה הקרנית משני צדי סוג של קולגן אני הממברנה מוצג.
Introduction
הקרנית היא רקמה שקופה הממוקמת בקדמת העין. הוא מורכב משלוש שכבות עיקריות: שכבת אפיתל על המשטח החיצוני, שכבת משתית אמצעית, ושכבה פנימית בשם הקרנית אנדותל. אנדותל הקרנית הוא מונייר של תאים היושבים על קרום מרתף בשם הקרום של הספר, והוא שומר על השקיפות של הקרנית על ידי ויסות כמות הנוזל המוסיפה את הסטרומה מההומור המשמש כבסיס. יותר מדי נוזל בתוך משתית גורם נפיחות הקרנית, אטימות אובדן ראייה. לכן האנדותל חיוני לשמירה על הראייה.
האנדותל הקרנית יכולה להיות מתפקדת בגלל מספר סיבות, כולל הזדקנות, מחלה ופציעה, והטיפול הנוכחי היחיד הוא ניתוח השתלה. במהלך ניתוח זה, מסירים האנדותל והממברנה של המטופל את הקרנית ומוחלפים בשתל של אנדותל והקרום של האישה המתקבלת מקרנית של התורם. שתלי אנדותל רבים מכילים גם שכבה דקה של רקמת סטרומה כדי לסייע לטיפול המצורף הקרנית המארחת1.
ברחבי העולם, הביקוש של רקמת תורם הקרנית לניתוחי השתלה גדול יותר מהכמות שניתן לספק על ידי בנקים עין2. יש אפוא כונן לפתח השתלות רקמה הנדסה אנדותל שיכול לשמש כדי להקל על הגרעון הזה3. הרציונל של זה מבוסס על העובדה כיום, אנדותל מן הקרנית הפרט יכול להיות רק מועבר לחולה יחיד, עם זאת, אם התאים האנדותל הקרנית התרחבו הראשון וגדל על ביוקפלי החומר בתרבית רקמות, הם יכולים לשמש לטיפול בחולים מרובים.
האתגרים העיקריים כי צריך להיות ממוען לפני השתלת רקמות מהונדסים הקרנית אנדותל להפוך אופציה אפשרית עבור מנתחים כוללים: (1) הקמת טכניקות להרחבת תאים אנדותל הקרנית באיכות גבוהה להפקת בוגרת ו הקרנית פונקציונלי שכבות תא אנדותל מבחנה, ו (2) הקמת טכניקות לגידול התאים על מקפלים ביוטומטל לייצר שתלי רקמות מהונדסים כי הם שווים, או טוב יותר, שתלי קרנית נגזר התורם המשמשים כיום.
תאים הקרנית אנדותל יש פוטנציאל מתרבים נמוך מאוד vivo אבל יכול להיות מגורה כדי לחלק בתוך מבחנה4. למרות זאת, יש להם נטייה חזקה לעבור במעבר האפיתל-אל-מסנצ'יאל (חובש), המפחית את יכולתם ליצור שכבת אנדותל בוגרת ופונקציונלית. הגורמים המוכרים לחובשים בתאי הקרנית של הקרניות כוללים חשיפה לגורמי גדילה מסויימים ואובדן של מגע תא-אל-תא5. זה כמעט בלתי נמנע כי הקרנית התרביות התאים האנדותל כי הם מנוכה אנזימטי במהלך תת-תרבות יעברו שינויים הקשורים פרמדיק. כאן, אנו מציגים שיטה של תרבות התא עבור תאים אנושיים או כבשים הקרנית לתאי שנועד למזער את ההפרעה של הקשר תא אל התא במהלך בידוד, בשלבים הרחבה ותת-בית, כדי להפחית את הפוטנציאל של חובש. יתר על כן, אנו מדגימים כיצד רקמות הנדסה שתלים הדומות לקרנית הנגזרת של ממברנה/שתלי רקמת העור/מסטרומה של הרקמה ניתן לייצר על ידי גידול שכבות התא מתורבת בשני הצדדים של קרום ביומטריה במכשיר מותאם אישית הרכבה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הקרנית האנושית עם הסכמת התורם למחקר התקבלו מהבנק עין קווינסלנד ובשימוש עם אישור האתיקה מתחנת המטרו דרום החולים וועדת המחקר האנושי של שירות הבריאות (HREC/07/QPAH/048). קרניות כבשים הושגו בעלי חיים מורדמים במכון המחקר הרפואי הראסטון של אוניברסיטת קווינסלנד תחת הסכם שיתוף רקמות.
1. הכנת כלי ניתוח
- לחטא שני זוגות של מלקחיים מספר 4 השען על ידי לספוג אותם בפתרון של 70% אתנול עבור 5 דקות או על ידי אוטוקלינג אותם.
2. הכנת צלחות תרבות בינונית ורקמה
- הכינו 100 mL של מדיום התרבות המכיל Opti-הזיכרון 1 (1x) + גלוטמקס-1, 5% סרום העובר העוברי ו 100 U/mL עט/דלקת. זה בינוני התרבות הוא מתאים לתרבויות הקרנית כבשים בתאי האנדותל, עם זאת, עבור תרבויות תא הקרנית האדם המדיום צריך להיות שיושלם עם 50 μg/mL בלוטת יותרת הבלוטת הפרה, 0.08% כונדרויטין סולפט, 200 μg/mL סידן כלוריד ו 0.3 מ"מ חומצה אסקורבית 2-פוספט. ניתן לאחסן את בינוני התרבות בחשכה ב-4 ° c לשבועיים.
- לחלוק את הבארות של לוחית 6-היטב התרבות רקמה עם קובץ מצורף פקטור באמצעות הוראות היצרן ולאחר מכן להוסיף 1 מ ל של התרבות הבינונית כל באר מצופה. . הכינו באר אחת לקרנית
3. לחקור ניתוח והליכי התרבות של התא
- מניחים את הקרנית, מעלה האנדותל, לתוך צלחת פטרי סטרילית על הבמה של מיקרוסקופ מבתר. התאימו את התאורה כך שמשטח הקרניות יהיה מואר היטב בניגוד מספיק כדי להדגיש את שכבת האנדותל. התאימו את הזום כך שהקצה ומספר הקרניות המרכזיות יהיו בתצוגה.
- השתמש מלקחיים השען מעוקר כדי להרים בעדינות ולקרוע את הקרום של הורד הרחק מן הסטרומה הבסיסית (איור 1). הקרום יהיה להתנתק מסטרומה כמו רצועה כי מיד התלתלים. מניחים את הרצועה לתוך באר אחת של לוחית התרבות של 6-היטב עם רקמה שהיתה מצופה בפקטור מצורף ומכילה 1 מ ל של תרבות בינונית. את המכסה של צלחת התרבות רקמה יש לשמור על כל הזמן, למעט כאשר explants מתווספים אליו, כדי להפחית את הסיכון לזיהום.
- הסירו רצועות מקרום הממברנה מהפריפריה הקיצונית של האנדותל קודם ולאחר מכן מאזורים מרכזיים מאוחר יותר. מניחים את כל הרצועות מקרנית אחת לבאר אחת בתוך צלחת 6-הבאר.
- מודלת את האקסוצמחים בחממה תרבותית מחולל לחות הגדר ב 5% CO2 ו 37 ° c. להשאיר את התרבות ללא הפרעה במשך יומיים כדי לאפשר explants להתיישב ולצרף למשטח הצלחת. בדרך כלל, עד שליש מהשתילים. לא מצליחים להתחבר ללוחית
- הסר את המדיום ואת כל ההרחבות מחובר מהתרבות לאחר 4 ימים בעדינות להוסיף 2 מ ל של התרבות הטרייה בינונית לוקח טיפול לא להפריע explants מצורפים. יש לשנות את התרבות בינונית פעמיים בשבוע.
4. הפקה רציפה של תאי הקרנית על ידי תרבות ההסבר הטורית
הערה: ניתן להעביר את האקכורים ללוחות של תרבית רקמות טריות לאחר 10 ימים להקמת תרביות תאים נוספות של הקרנית.
- מניחים את תרבות ההסבר על הבמה של מיקרוסקופ מבתר ומתאימים את התאורה והזום כך שניתן לראות את האקסוצמחים.
- באמצעות מלקחיים שען מעוקר, לקטוף בעדינות כל לחקור את לוחית התרבות שלה ולהעביר אותו היטב טרי של צלחת התרבות 6-גם רקמה כי כבר מצופה עם מקדם קובץ מצורף ומכיל 1 mL של מדיום התרבות.
- אפשר explants להתיישב על פני השטח של הצלחת החדשה שלהם במשך 4 ימים לפני החלפת מדיום התרבות עם 2 מ ל של מדיום תרבות טרייה. שנה את בינונית התרבות השתנתה פעמיים בשבוע.
5. הגדלת תאים אנדותל הקרנית על שמיכות זכוכית עבור ניתוח מאימונוללואונציה
הערה: תרביות תאים שנועדו להיות מנותח באמצעות immunofluorescence יש להקים על שמיכות זכוכית שניתן לרכוב על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית בעקבות הליך הצביעת.
- לחטא חפיסה של שמיכות זכוכית עגולות של קוטר 13 מ"מ ב החיטוי או על ידי הטבילה ב 70% אתנול עבור 15 דקות ואחריו שלושה טיפות מלוחים באגירה פוספט (PBS).
- המקום שמיכות בודדות לתוך הבארות של לוח 24-היטב של תרבות הרקמה, לחלוק אותם עם מקדם קובץ מצורף, ולאחר מכן להוסיף 0.5 mL של התרבות בינונית לכל טוב.
- באמצעות מלקחיים שען מעוקר להסיר explants מלוחות התרבות שלהם רקמה ולהעביר אותם בארות המכילות coverslips. אפשר explants להתיישב על הכיסויים 4 ימים לפני שינוי המדיום.
- לאחר תקופת הדגירה הנדרשת, לתקן ולהכתים את התרבויות שמיכות בתוך בארות התרבות שלהם. הר הוכתם שמיכות על מיקרוסקופ זכוכית שקופיות לניתוח תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטית.
6. תת-תרבות של תאי הקרנית באמצעות Dispase השני
הערה: תאים fibroblastic גדולים ניתן להסיר באופן סלקטיבי מתרבויות ההסבר ב 6-היטב צלחות לפני subculturing באמצעות הליך זה. אם כל התאים יהיו משניים, אל תבצע את השלבים 6.2 עד 6.4. מטרת הליך זה היא להעביר את התאים ללוחות טריים תוך שמירה על אנשי הקשר שלהם לתא-לתא ככל האפשר. התאים צריכים להיות מטופלים בעדינות. בארות שוטפת לחלוטין צריך להיות מיושן ביחס של 1:2, בעוד בארות subconfluent צריך להיות מיושן ביחס של 1:1 או פחות.
- הסר את המדיום מן התרבות ולשטוף בקצרה עם DPBS.
- הוסף 1 מ ל של Versene. . בטמפרטורת החדר במשך 30 ס מ
- הסר את הversene והוסף 1 מ ל של טרילול. מודטה ב 37 ° c בחממה לתרבות רקמות במשך 3 דקות.
- צפו בתרבות בעזרת מיקרוסקופ לעומת פאזה. הקש בעדינות על התרבות כדי להוציא תאים מהצלחת. ברגע שהתאים הfibroblastic הגדולים מנותקים מהצלחת להסיר אותם ואת הטרילה באמצעות הפיפטה 1 mL. שטוף טרילול שיורית את התאים הנותרים על ידי שטיפה פעמיים עם 2 מ ל של DPBS.
- הוסף 1 מ ג של 1 מ"ג/mL Dispase II אל התרבות, הדגירה בחממה תרבות הרקמה עבור 1 עד 2 h או עד כל התאים התנתק מן הצלחת. התאים צריכים לרחף בהדרגה מן הצלחת במקבצים.
- לאסוף את התאים באמצעות מנקז 1 mL ולהעביר 20 מ ל של DPBS בתוך שפופרת צנטריפוגה 50 mL. צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 300 x g בטמפרטורת החדר.
- הסירו את הסופרנטאנט והשהה בעדינות את הגלולה הסלולרית בעזרת מפית מ-mL ב-1 מ ג של התרבות הבינונית. העבר את ההשעיה התא אל אחת או שתי בארות של צלחת 6-היטב, למעבר ביחס של או 1:1 או 1:2 בהתאמה.
- למעלה את המדיום בכל באר לעשות 2 מ ל ולמקם את התרבויות לתוך החממה תרבות רקמות. החלף את המדיום עם 2 מ ל של מדיום טרי פעמיים בשבוע.
7. צמיחת שכבות של תאי הקרנית על גבי ממברנות
הערה: הפרוצדורה הבאה מתארת את השלבים המעורבים בהרכבה של חומר ביוקרומי במכשיר הרכבה מותאם אישית-הנקרא תא מיקרו-בוידן-לתרבות התא. נאלעיין בפרסום האחרון שלנו לקבלת מידע נוסף על המכשיר ולרכישת פרטים.
- הרכיבו את החדר העליון של חדר המיקרו-בוידן באמצעות הצבת טבעת אדומה למרכזו.
- השתמש בטפין בקוטר 18 מ"מ כדי לחבוט בדיסק מתוך גיליון ביואטי על גבי קרש חיתוך פוליארביואתילן. מניחים את הדיסק מעל הטבעת האדומה בחדר העליון של החדר של מיקרו-בוידן.
- , לעזאזל עם החדר התחתון לחדר העליון. ולאבטח את הדיסקית באמצע
- להשרות את החדר התאספו micro-Boyden ב 70% אתנול עבור 1 h כדי לעקר אותו.
- לטבול לחלוטין את החדר התאספו מיקרו-Boyden ב HBSS סטרילי עבור 10 דקות כדי להסיר את האתנול. חזור על שלב השטיפה פעמיים. בצע כביסה הסופי צעד עבור 10 דקות בינונית תרבות ללא תוספת.
- להעביר את החדר מיקרו-Boyden מעוקר לתווך התרבות בבאר של 6-היטב צלחת להבטיח כי החדר העליון הוא כלפי מעבר. התאימו את רמת התווך התרבותי כך שהוא ייצור קשר עם המשטח התחתון של קרום הרפידה, אך לא יזרום לתוך התא העליון.
- הכן השעיה של תאי הקרנית אנדותל באמצעות ההליך המתואר בסעיף 6. צפיפות תאים מספקת בהשעיה צריך להיות מושגת כדי לאפשר צפיפות הזריעה של לפחות 100,000 תאים לכל ס מ2 על קרום בחדר Micro-boyden. שטח התרבות בתוך החדר מיקרו-Boyden הוא 0.5 ס"מ2 וזה יכול להכיל נפח של 100 μl. לכן, השעיה המכילה 500,000 תאים/mL צריך להיות מוכן.
- פיפטה 100 μL של השעיית תא (50,000 תאים) אל הקרום בחדר מיקרו-Boyden. מודטה בחממה תרבות הרקמה עבור 4 שעות לפני הציפוי בינוני כדי להטביע לחלוטין את החדר. מודאת התרבות לפרק זמן הנדרש, החלפת המדיום פעמיים בשבוע.
הערה: ברגע שתאי הקרנית של הקרניות מחוברים למשטח העליון של קרום הממברנה, ניתן להפוך את חדר המיקרו-בוידן בתוך התרבות, כך שהחדר התחתון יהיה כלפי מעבר. תאים נוספים ניתן להוסיף לחדר כדי ליזום תרביות תאים על פני השטח השני של קרום. לדוגמה, תאים סטרומה הקרנית ניתן להחיל בקלות על משטח חלופי ובכך לחקות את המיקום היחסי של סוגי תא הקרנית כפי שניתן לראות בתוך הקרנית האחורי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השיטה לבידוד והרחבה של תאי הקרנית מתוך הקרניות האנושיות או הכבשים מסוכמות באיור 1 ובאיור 2. רוב האקכורים הנגזרים מן הקרניות 1 עד 2-בן כבשים או תורמים אנושיים של פחות מ -30 שנים של גיל יהיה לצרף את מארז מצופה לוחיות העור בתוך שבוע, עם זאת, זה לא יוצא דופן לגלות כי עד שליש מהצומח להיכשל לצרף בזמן הזה. אלה "צף" explants ניתן להסיר מן התרבויות. הרחבות של תורמים אנושיים מעל גיל 30 שנים פחות סביר לצרף לצלחת וגם פחות סביר לייצר תרביות תאים. תמונות מייצגות של תרביות תא אנדותל הקרנית שנוצרו מן הכבשים האדם והמין האנושי מוצגים באיור 3 ואיור 4. התאים היוצאים מן האקסוצמחים בדרך כלל להישאר במגע אחד עם השני כאשר הם להגר אל הצלחת. סוג זה של הגירה ידועה כהעברת תאים קיבוציים, והיא תכונה של תאים אפיתל7. על-ידי 2 שבועות של תרבות, טלאים של קטן, תאים ארוזים היטב יצרו מיד ליד רבים של explants מן הכבשים הן הקרנית האנושית8. כתמי תאים אלה אינם מציגים מאפיינים מורפולוגיים של החובשים ומתרחבים באיטיות לאורך זמן. תאים גדולים יותר עם יותר חריגים, צורות fibroblastic ניתן למצוא מחוץ לתיקונים אלה. לאחר התרבויות הוקמו, explants ניתן להסיר באמצעות מלקחיים והניח לתוך לוחות טריים להקים תרבויות חדשות.
תאים קטנים, ארוזים היטב בתוך התרבויות התא אנדותל הקרנית עמידים מאוד לעיכול עם טרידל, בעוד תאים fibroblastic גדול יותר רגישים לזה. הבדל זה בהתנגדות טרילה יכול להיות מנוצל באופן סלקטיבי להסיר תאים גדולים מן התרבויות לפני העברת התאים הקטנים לצלחות חדשות. תמונות מייצגות של תרביות תאים של הקרנית האנושית לאורך תהליך תת-ממדי באמצעות טרילה ו Dispase II מוצגים באיור 4.
מנתח immunofluorescence ניתן לנהל על תרבויות תא הקרנית אנדותל כדי לאתר חלבונים ספציפיים בתאים. דוגמה לכך מוצגת באיור 5. Explants מ כבשים וקרניות האדם הוצבו על קובץ מצורף פקטור-מצופה שמיכות זכוכית בצלחות 24-טוב ותרבותי במשך 4 שבועות. הרחבות הוסרו ולאחר מכן התרבויות נותחו באמצעות immunofluorescence לנוכחות של ZO-1, חלבון הצומת הדוקה, ו-N-קדהרין, חלבון צומת חסידי, על פי הפרוטוקול המפורסם שלנו9. הנוגדנים האנטי-צו-1 והאנטי-נ'-כבשים שימשו הן לתאי הכבשים והן לתאים אנושיים, והתוצאות הראו ששני החלבונים זוהו בקרום הפלזמה של תאים משני המינים. ZO-1 נמצא בדרך כלל כלהקה ברורה בגבול התא אבל הופך חלש או נעדר בתאים שעברו חובש. לכן, הביטוי החזק של ZO-1 בתרבויות אלה הצביע על כך שהתאים לא עברו את החובשים.
לתאי מיקרו-Boyden שלנו מותאם אישית נועדו להשעות את הממברנה ביומטריה בתוך הבאר של לוחית 6-היטב של תרבות רקמה (איור 6). הנוהל להרכבת ממברנה ביומטריה לחדר מיקרו-בוידן מוצג באיור 7. העיצוב של התא micro-Boyden מאפשר שני הצדדים של הקרום מושעה בתוך זה כדי לשמש כמשטחי תרבות התא בו זמנית. כדי להדגים את זה, כבשים סטרומה תאים נגזר רקמת סטרומה הקרנית היו שנזרע בצפיפות של 100,000 תאים/cm2 אל צד אחד של קולגן סוג אני ממברנה ואז 24 שעות מאוחר יותר החדר היה התהפך ותאי הקרנית אנדותל הכבשים היו שופרה בצד השני של קרום בצפיפות של 400,000 תאים/cm2. הרקמה מהונדסים שכבות התא היו מתורבתים במשך 4 שבועות, ולאחר מכן תוקן עם 10% המאגר ניטרלי ומוכתם באמצעות rhodamine phalloidin ו הופסט לצבוע גרעיני 33342. לאחר מכן נבחנו וצולמו בעזרת מיקרוסקופ קונמוקדי (איור 8). השקפה חוצת חתך של בניית התא מהונדסים רקמות חשף שכבה אחת של תאים אנדותל הקרנית על משטח אחד של קרום הקולגן ותרבות רב שכבתית של תאים סטרומה הקרנית על פני השטח השני.
איור 1: טכניקה להשגת הקרום של הממברנה של האקתל מהקרניות הטריות. (א) הקרנית ממוקמת על הקצה בצלוחית פטרי מתחת למיקרוסקופ מבתר. (ב) סגור את התצוגה של האזור המצוין על-ידי מלבן אדום ב-(א). מלקחיים של שען משמשות כדי לקלף בעדינות את קרום הקליפה מתוך הסטרומה הבסיסית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הליך להקמת והרחבת התרבויות של תאי הקרנית המרתל מקרום הממברנה של האנדותל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: התמונה המייצגת את הדמות של תרבויות התאים האנדותל במהלך ההקמה הראשונית של הקרנית מקרום כבשים של הקרתל. (א) הקרנת כבשים של הממברנה האנדותל של הספר לאחר 3 ימים בתרבות. תאי הקרנית מתחילים. לנדוד אל הצלחת (ב) הכבשים מעוררות תרבות אחרי שבוע אחד. ההסבר מוקף בסדין שוטף של תאים. (ג) כבשה לחקור תרבות אחרי שבועיים. תאים קטנים להקיף את ההסבר בעוד תאים גדולים ממוקמים רחוק יותר. (ד) כבשה לחקור תרבות אחרי 6 שבועות. אזור של תאים קטנים וארוזים בחוזקה נראה ליד אזור של תאים גדולים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: בידוד של תאים קטנים וארוזים בחוזקה של הקרנית האנושית לתרבויות משנה. (א) ממברנה של הקרניות האנושיות של הקרנית לחקור את התרבות לאחר 7 שבועות. תאים קטנים וארוזים היטב נמצאים ליד ההסבר. (ב) אזורים של תאים קטנים וארוזים בחוזקה מתפתחים בתרבויות ההסבר האנושיות באופן דומה לזה שנצפה בתרביות הכבשים. (ג) תרבות החוקר האנושי לאחר הסרת ההסבר ולאחר 20 דקות חשיפה לטרילה. תאים קטנים, ארוזים היטב שמרו על ההחזקה שלהם לצלחת בעוד התאים הגדולים יותר ריחף משם. (ד) תרבות תא של הקרנית האנושית לאחר השעה 13:00 בשנת השנייה. רוב התאים מנותקים מהצלחת כגושים צפים. (ה) תת-תרבות של תא של הקרנית האנושית אחרי יום אחד. תאים הועברו כלפי חוץ מגושי תאים שהיו מבודדים מהתרבות המקורית של ההסבר. (ו) תת-בית של תא של הקרנית האנושית אחרי 12 ימים. התאים יצרו מונאולייר שוטפת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: התאמה לוקליזציה של החלבונים של ZO-1 ו-N-קדהרין בקרומים של כבשים ותאי הקרנית האנושית של הקרניות באמצעות תוויות כפולות. כבשים והקרנית האדם הקרום של הממברנה לחקור את תרבויות הוקמה על הקובץ המצורף מארז מצופה שמיכות זכוכית מנותח לאחר 4 שבועות. הן ZO-1 (כתם ירוק) ו-N-קדהרין (כתם אדום) זוהו בקרומים של כבשים (A ו- B) והאדם (D ו- E) הקרנית התאים האנדותל. ניתוח התמונות הממוזגות חשף ששני החלבונים היו מותאמים מאוד בתוך התרבויות (C ו- F). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תרשים של תא זעיר בוידן המוצג בחתך הרוחב. החדר המותאם למיקרו-בוידן שלנו מורכב מחדר עליון, חדר תחתון וטבעת או. זה יכול לשמש כדי להשעות כל סוג של חומר קרומי בתוך תרבות רקמה היטב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: ההליך להרכבת קרום ביומטריה בחדר מיקרו בוידן לתרבות רקמות. (א) הציוד הנדרש עבור הליך זה כולל קרש חיתוך פוליארבאטאואתילן, זוג מלקחיים, טרפין של 18 מ"מ קוטר, תא מיקרו-boyden מותאם אישית וממברנה ביוצימית. (ב) השתמש בטרפין כדי לחבוט בדיסק מקרום הממברנה. (ג) מניחים את ה-O-ring בחדר העליון של המכשיר ההרכבה ולאחר מכן מניחים את הדיסק באמצעות הרכיב. (ד) לעזאזל עם התא התחתון אל החדר העליון של התקן ההרכבה. (ה) חדר מיקרו-boyden התאספו מוכן להיות מעוקר עם 70% אתנול. (ו) לטבול את החדר מיקרו-Boyden מעוקר במדיום תרבות הרקמה בבאר של לוחית 6-היטב התרבות רקמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: הקרנית כבשים אנדותל תאים סטרומה בצדדים מנוגדים של סוג קולגן אני קרום. התאים היו מוכתמים בפלאידין רומדנין כדי להמחיש את אקטין (אדום) והואכסט להמחיש גרעינים (כחול). סוג הקולגן אני קרום לא היה מוכתם ולכן הוא לא נראה בתמונות אלה שנאספו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלית. (א) הגדלה נמוכה, תצוגת חתך רוחב של מבנה הרקמה מהונדסים. שכבה דקה של אקטין המייצג תרבות תא הקרנית אנדותל הוא גלוי על פני השטח העליון של קרום, ושכבה עבה יותר של אקטין המייצג תרבות תא סטרומה נמצא על פני השטח התחתון של קרום. גרעיני כחול אינם מוצגים בתמונה זו. (ב) En מבט לפנים של שכבת התא אנדותל הקרנית מראה הן אקטין וכתמים גרעינים. (ג) En מבט לפנים של שכבת הקרנית סטרומה התא מראה הן אקטין וכתמים גרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אתגר טכני משמעותי הקשור להקמת והרחבת תאי הקרנית האנושית של הקרניות מונע מצוות החירום להתרחש בתרבויות. החובשים יכולים להיות מופעלות בתאי הקרנית בתוך התאים על ידי אובדן מגע תא אל התא, אך רוב הפרוטוקולים של תרבות התא עבור תאים אלה כרוך דיסוציאציה אנזימטית לתאים בודדים במהלך בידוד ותת-תרבות10. כאן אנו מציגים פרוטוקול אלטרנטיבי של תרבות התאים עבור תאי הקרניות הרתל, המקטינה את הסיכון לתאים מאבדים קשר אחד עם השני במהלך הבידוד ושלבי תת-תרבות.
השיטה שלנו להקמת תרביות תאים של הקרנית כרוכה בהצבת ממברנה של הקרום של הממברנה של אנדותל/הורד מן הקרניות התורמות לתוך לוחות תרבות הרקמה בתנאים המאפשרים לתאים לנדוד באופן קולקטיבי מהקרומים וללוחות. כדי שדבר זה יצליח, ההסבר חייב ליצור חיבור צמוד ללוח התרבות של הרקמה, וזה מושגת בצורה הטובה ביותר בכך שהוא לא מפריע לצלחת כמה ימים לאחר הקמת התרבויות. גורם קריטי נוסף בהקמת מוצלח של תרביות תאים של הקרניות מבני האדם הוא גיל התורם. שיעורי הצלחה גבוהים יותר נוטים להיות מושגת מתורמים צעירים יותר מגיל 30.
חיסרון של שימוש בשיטת תרבות ההסבר להקמת תרביות תאים של הקרניות, היא התקופה הארוכה יחסית שקיימת בין הקמת התרבויות וקבלת מספר גדול של תאים. השיטות הנקראות "קילוף ומעכל" כוללות התפשטות האנדותל מקרניות תורמות ומעכל אותה באנזימים לשחרור התאים לתרבות11. סוגים אלה של שיטות היה לייצר תרבויות המכילות תאים יותר בהתחלה מאשר אלה הקימו explants.
שיטת תרבות ההסבר שלנו לתאי הקרניות מייצרת תרבויות המכילות תאים קטנים, קומפקטיים ובוגרים באיכות גבוהה. עם זאת, התרבויות מכילות גם תאים גדולים ופחות אידיאליים לקראת הפריפריה של הצלחת. את התאים הגדולים ניתן להסיר על ידי עיכול עם טרילה ונמחק אם הצורך, אבל זה מפחית את מספר התאים הזמינים עבור תת-תרבות. עם זאת, explants שיזמו בהצלחה את תרביות התא הראשי כמעט תמיד מסוגלים ליזום תרבויות תאים נוספות, ויכולת זו יכולה להיות מנוצלת כדי להשיג מספר גדול של תאים באיכות גבוהה.
שיטת תת-תרבות שלנו עבור תאים אנדותל הקרנית כרוך באמצעות Dispase II כדי להרים בעדינות את גושי התאים הרחק מן הלוח תרבות הרקמה להעברת לוחות טריים, ולמרות שיטה זו נועדה למזער את האפשרות של מטפל המתרחשים במעבר תאים, יש לציין כי הוא אינו מקטין את הסיכון לאפס.
זה כבר המטרה של קבוצות רבות כדי לפתח רקמות מהונדסים הקרנית שכבות התא למטרות השתלת. חומרים שונים רבים שימשו כנשאים לתאים ומגוון של שיטות שונות השתמשו כדי לרסן את החומר מלהסתובב בלוח התרבות במהלך תרבות התא. רוב השיטות כרוכות עיגון החומר על פני השטח של לוחית התרבות רקמה איכשהו, הגבלת צמיחת תאים למשטח העליון של הקרום בלבד. בעוד שיטות אלו יכולות לשמש להפקת שכבות בודדות של אנדותל הקרנית מהונדסים רקמות, כי יהיה שווה ערך לשתלים הממברנה של הספק (DMEK שתלי), לא ניתן להשתמש בהם כדי לייצר מהונדסים רקמות המקבילה של הממברנה/משתית שתלי הספק/מסטרומה (DMEK או DSAEK שתלי) כי הם הנפוצים ביותר על ידי מנתחים כיום. לפיכך פיתחנו מכשיר הרכבה ממברנה הנקרא תא מיקרו-Boyden המאפשר לתאים בו גדל על שני משטחים של קרום ביומטריה מושעה, והשתמשו בו כדי לייצר רקמות הנדסה שתלי כולל תאים אנדותל הקרנית ותאים סטרומה על משטחים מנוגדים של סוג קולגן אני ממברנות. אלה שכבתית רקמת שכבות שתלים מהונדסים יכול לשמש כדי להחליף את שתלי קרנית הנגזר של התורם של אנדותל ורקמת סטרומה משני צדדיו של קרום של הממברנה (DSEK או שתלי DSAEK).
לסיכום, השיטות המוצגות במאמר זה נועדו למי שרוצה להשיג תאים בעלי הקרנית העיקרית באיכות גבוהה לשימוש במחקרים הנדסת רקמות. שיטות התרבות העדינות מתוארות, שנועדו להפחית את הסיכון של התאים העוברים באמצעות החובשים ושיטה לגידול התאים באמצעות ממברנות מושעה. אנו מקווים כי שיטות אלה עשוי לסייע לאחרים לקראת המטרות שלהם להפקת השתלת רקמה אנדותל הקרנית מהונדסים רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
תודות לנעמי גאורני לעזרתה במהלך הכנת איור 7. עבודה זו נתמכת על ידי מענק הפרויקט הוענק DH על ידי המועצה הלאומית לבריאות ומחקר רפואי של אוסטרליה (פרויקט גרנט 1099922), ועל ידי מימון המשלים שהתקבל קרן מכון העין קווינסלנד.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
- Güell, J. L., El Husseiny, M. A., Manero, F., Gris, O., Elies, D. Historical Review and Update of Surgical Treatment for Corneal Endothelial Diseases. Ophthalmology and Therapy. 3, 1-15 (2014).
- Tan, D. T. H., Dart, J. K. G., Holland, E. J., Kinoshita, S. Corneal transplantation. The Lancet. 379 (9827), 1749-1761 (2012).
- Soh, Y. Q., Peh, G. S. L., Mehta, J. S. Translational issues for human corneal endothelial tissue engineering. Journal of Tissue Engineering and Regnerative Medicine. 11 (9), 2425-2442 (2017).
- Senoo, T., Joyce, N. C. Cell Cycle Kinetics in Corneal Endothelium from Old and Young Donors. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 41 (3), 660-667 (2000).
- Roy, O., Leclerc, V. B., Bourget, J. M., Thériault, M., Proulx, S. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology, Visual Science. 56, 1228-1237 (2015).
- Harkin, D. G., et al. Mounting of Biomaterials for Use in Ophthalmic Cell Therapies. Cell Transplantation. 26 (11), 1717-1732 (2017).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K. Cell migration. Comprehensive Physiology. 2 (4), 2369-2392 (2012).
- Walshe, J., Harkin, D. G. Serial explant culture provides novel insights into the potential location and phenotype of corneal endothelial progenitor cells. Experimental Eye Research. 127, 9-13 (2014).
- Al Abdulsalam, N. K., Barnett, N. L., Harkin, D. G., Walshe, J. Cultivation of corneal endothelial cells from sheep. Experimental Eye Research. 173, 24-31 (2018).
- Parekh, M., Ferrari, S., Sheridan, C., Kaye, S., Ahmad, S. Concise Review: An Update on the Culture of Human Corneal Endothelial Cells for Transplantation. Stem Cells Translational Medicine. 5 (2), 258-264 (2016).
- Peh, G. S., Toh, K. P., Wu, F. Y., Tan, D. T., Mehta, J. S. Cultivation of human corneal endothelial cells isolated from paired donor corneas. PLoS One. 6 (12), 28310 (2011).
