Summary
该协议描述了从人类或绵羊组织外植植物中建立和生长角膜内皮细胞培养的关键步骤。提出了一种在膜状生物材料上对角膜内皮细胞进行亚培养的方法。
Abstract
角膜内皮细胞培养体在细胞与细胞失去接触后有发生上皮到中皮过渡（EMT）的倾向。EMT对细胞是有害的，因为它降低了细胞形成成熟和功能层的能力。在这里，我们提出了一种建立和亚培养人类和绵羊角膜内皮细胞培养的方法，以尽量减少细胞与细胞接触的损失。角膜内皮/Descemet膜的外部从供体角膜中取走，在允许细胞集体迁移到培养表面的条件下放入组织培养中。一旦文化建立，外植物被转移到新鲜的板块，以启动新的文化。去巴塞II用于轻轻地将细胞团从组织培养板上提起，用于亚培养。使用该协议建立的角膜内皮细胞培养物适用于转移到生物材料膜，以产生组织工程细胞层，用于动物试验中的移植。介绍了一种在组织培养过程中支持生物材料膜的定制装置，并举例说，由一层角膜内皮细胞和胶原蛋白I型膜两侧的角膜基质细胞组成的组织工程移植物。
Introduction
角膜是位于眼睛前面的透明组织。它由三个主要层组成：外表面的上皮层、中间的频闪层和称为角膜内皮的内层。角膜内皮是一个单层细胞，位于称为Descemet膜的基底膜上，通过调节从底层水性幽默进入频闪的液体量来保持角膜的透明度。频闪内过多的液体会导致角膜肿胀、不理想和视力丧失。因此，内皮内皮对维持视力至关重要。
角膜内皮可能由于多种原因（包括衰老、疾病和损伤）而功能失调，目前唯一的治疗是移植手术。在这次手术中，内皮和Descemet的膜从患者的角膜上去除，代之以从供体角膜获得的内皮和Descemet膜的移植物。许多内皮移植物也含有一层薄薄的基质组织，以帮助处理和附着到宿主角膜1。
在全球范围内，移植手术对角膜供体组织的需求大于眼库2所能提供的量。因此，人们一直在推动开发组织工程的角膜内皮移植，可用于缓解这一不足3。其依据是，目前，单个角膜的内皮只能转移到单个患者，但是，如果角膜内皮细胞首先在组织培养的生物材料支架上扩张和生长，它们可用于治疗多个患者。
在组织工程的角膜内皮移植成为外科医生的可行选择之前需要解决的主要挑战包括：（1） 建立扩展高质量角膜内皮细胞和生产成熟和功能性角膜内皮细胞层在体外，和（2）建立技术，在生物材料支架上生长细胞，以产生组织工程移植物，等于或优于目前使用的供体角膜衍生移植物。
角膜内皮细胞在体内具有非常低的增殖潜力，但可以刺激在体外分裂4。然而，他们有强烈的倾向，经历体外上皮到中皮过渡（EMT），这降低了他们的能力，形成一个成熟的，功能内皮层。角膜内皮细胞中EMT的已知诱因包括接触某些生长因子和细胞与细胞接触的丧失5。因此，在亚培养过程中酶分离的角膜内皮细胞培养物几乎是不可避免的，这种变化与EMT相关。在这里，我们提出了一种用于人类或绵羊角膜内皮细胞的细胞培养方法，该方法旨在最大限度地减少在隔离、扩张和亚培养阶段细胞与细胞接触的中断，以降低EMT的可能性。此外，我们演示了如何通过在定制安装装置中生物材料膜两侧生长培养细胞层来生成类似于供体角膜衍生内皮/Descemet 膜/体组织移植物的组织工程移植物。
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Protocol
经捐赠者同意进行研究的人类角膜从昆士兰眼库获得，并经地铁南方医院和卫生服务部人类研究伦理委员会（HREC/07/QPAH/048）的道德认证使用。根据组织共享协议，在昆士兰大学赫斯顿医学研究设施从安乐死动物身上获得羊角膜。
1. 准备解剖工具
- 将两对 4 号制表匠钳浸泡在 70% 乙醇溶液中 5 分钟或高压灭菌，使其消毒。
2. 培养培养基板和组织培养板的制备
- 准备含有Opti-MEM 1 （1x） + GlutaMAX-1、5%胎儿牛血清和100 U/mL笔/链球菌的培养基100 mL。这种培养基培养基足以用于羊角膜内皮细胞培养，然而，对于人类角膜内皮细胞培养基，该培养基应辅以50μg/mL牛脑垂体提取物、0.08%软骨素硫酸盐、200微克/mL氯化钙和0.3 mM L-磷酸2-磷酸盐。培养基可以在黑暗中储存在4°C下两周。
- 使用制造商的说明，使用附件因子涂覆 6 孔组织培养板的孔，然后向每个涂布孔添加 1 mL 培养基。为每个角膜准备一口井。
3. 除植物解剖和细胞培养程序
- 将角膜，内皮侧向上，放入无菌培养皿在解剖显微镜的阶段。调整照明，使角膜表面光线充足，对比度足够强，以突出内皮层。调整变焦，使边缘和一些中央角膜内皮在视图中。
- 使用消毒制表机钳轻轻提起并撕裂 Descemet 的膜，使之远离底层频闪（图 1）。膜将从频闪中分离为立即卷曲的条带。将条带放入6孔组织培养板的一个孔中，该孔已涂有附着因子，并含有1 mL培养基。组织培养板的盖子应始终保持，除非在外植中添加外植物，以降低污染风险。
- 先从内皮层的极端外围去除Descemet膜的条带，然后再从中心区域取出。将一个角膜的所有条材放入 6 孔板内的单个孔中。
- 在5%CO2和37°C的加湿细胞培养箱中孵育外植。保持培养层不受干扰2天，让外植沉淀并附着在板面上。通常，多达三分之一的外植无法附着在板上。
- 4天后，从培养物中取出培养基和任何未附着的外植，并轻轻加入2 mL的新鲜培养基，注意不要打扰附着的外植。文化媒介应每周更改两次。
4. 通过连续外植培养连续生产角膜内皮细胞
注：外植植物可在10天后转移到新鲜组织培养板，以建立额外的角膜内皮细胞培养。
- 将外植培养装置放在解剖显微镜的舞台上，并调整照明和缩放，使外植可见。
- 使用消毒制表匠钳，轻轻地从培养板中取出每个出苗，并将其转移到6孔组织培养板的新鲜孔中，该培养板已涂有附着因子，并含有1 mL培养基。
- 让外植植物在新板表面沉降4天，然后用2 mL的新鲜培养基取代培养基。更改区域性介质每周更改两次。
5. 在玻璃盖玻片上生长角膜内皮细胞，用于免疫荧光分析
注：注定要使用免疫荧光分析的细胞培养物应建立在玻璃盖玻片上，这些玻璃盖玻片可在染色程序后安装在玻璃显微镜玻片上。
- 在高压灭菌器中消毒一包直径为 13 mm 的圆形玻璃盖玻片，或浸泡在 70% 乙醇中 15 分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗三次。
- 将单独的盖片放入24孔组织培养板的孔中，涂上附着因子，然后向每口井添加0.5 mL的培养基。
- 使用消毒制表钳将外植从组织培养板中取出，并将其转移到含有盖玻片的井中。在更换介质之前，让外植物在盖玻片上沉淀4天。
- 在规定的潜伏期之后，修复和染色其培养井内的盖玻片培养物。将染色盖玻片安装到玻璃显微镜玻片上，在荧光显微镜下进行分析。
6. 使用Dispase II的角膜内皮细胞的亚培养
注：使用本程序进行分栽培之前，可选择性地从6孔板中的外植培养物中去除大成纤维细胞。如果要对所有单元格进行亚培养，请不要执行步骤 6.2 到 6.4。此过程的目的是将细胞转移到新鲜板中，同时尽可能保持细胞与细胞的接触。细胞应轻轻处理。完全流水井应以 1：2 的比例通过，而分流孔应以 1：1 或更低的比例通过。
- 从培养液中取出培养基，然后用 DPBS 短暂冲洗。
- 添加 1 mL 的 Versene。在室温下孵育30s。
- 取出弗塞恩，并添加 1 mL 的 TrypLE。在组织培养培养箱中孵育37°C3分钟。
- 使用相对比显微镜观察培养。轻轻敲击培养点，将细胞从盘子中移开。一旦大型成纤维细胞从板中分离，就用1mL移液器将其和TrypLE去除。用2 mL的DPBS冲洗两次，洗掉剩余的细胞。
- 将1mL的1mg/mL除脂酶II加入培养，并在组织培养箱中孵育1至2小时，或直到所有细胞从板中分离。细胞应逐渐漂浮在团块中，远离板。
- 使用 1 mL 移液器收集细胞，并在 50 mL 离心管中转移到 20 mL 的 DPBS。在室温下在300 x g下离心5分钟。
- 在1mL培养基中，用1mL移液器进行三聚，取出上清液并轻轻重新悬浮细胞颗粒。将电池悬架转移到 6 孔板的一口或两口井，以 1：1 或 1：2 的比例通过。
- 在每个井中补上介质，使其达到 2 mL，并将培养物放入组织培养箱中。每周两次用 2 mL 的新鲜介质更换介质。
7. 生物材料膜上角膜内皮细胞层的生长
注：以下步骤描述了在定制的安装设备（称为微型博伊登室）中安装膜状生物材料以用于细胞培养的步骤。有关设备的更多信息和购买详情，请参阅我们最近的出版物6。
- 将红色 O 形环放入其中心，将微型博登室的上室组装。
- 使用直径为 18 mm 的三聚苯乙烯从聚四氟乙烯 （PTFE） 切割板上的生物材料片中冲出圆盘。将光盘放在微型博登室上室的红色 O 形环上。
- 将下腔拧到上腔室上，将生物材料圆盘固定在中间。
- 将组装的微型博伊登室浸泡在70%乙醇中1小时，使其消毒。
- 将组装的微型博登室完全浸入无菌 HBSS 中 10 分钟，以去除乙醇。重复此洗涤步骤两次。在未补充的培养基中执行最后洗涤步骤 10 分钟。
- 将消毒的微博登室转移到 6 孔板的孔中的培养介质，以确保上室位于最上面。调整培养基的级别，使其接触生物材料膜的下表面，但不会流入上腔。
- 使用第6节概述的程序，准备暂停角膜内皮细胞。悬浮液中的细胞密度应达到足够的，使微博伊登室的膜上每cm2的播种密度至少为100，000个。微博伊登室内的培养表面积为0.5 cm2，可容纳100μL的体积。因此，应准备含有500，000个细胞/mL的悬浮液。
- 将100μL的细胞悬浮液（50，000个细胞）移液器放在微博伊登室的膜上。在组织培养培养箱中孵育4小时，然后补充介质以完全淹没腔室。在规定的时间内孵育培养，每周更换两次介质。
注：一旦角膜内皮细胞附着在生物材料膜的上表面，微博登室可以在培养井内翻转，使下腔位于最上层。然后，可以将更多的细胞添加到腔室中，以在膜的另一面启动细胞培养。例如，角膜基质细胞可能很容易应用于交替表面，从而模仿角膜细胞类型的相对位置，如在后角膜中所看到的。
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Representative Results
图1和图2总结了从人或羊角膜中分离和扩大角膜内皮细胞的方法。大多数来自1至2岁绵羊角膜或30岁以下人类捐赠者的外植植物将在一周内附着在附着因子组织培养板上，然而，发现多达三分之一的外科在这段时间内无法附着，这种情况并不罕见。这些"浮动"的外植可以从培养物中去除。超过30年的人类捐赠者的外植不太可能附着在板上，也不太可能产生细胞培养物。从绵羊和人类外植产生的角膜内皮细胞培养物的代表性图像如图3和图4所示。从外植株中产生的细胞在迁移到板体时通常保持相互接触。这种迁移被称为集体细胞迁移，它是上皮细胞7的一个特征。到2周的培养，小块，紧密包装的细胞将形成紧挨着许多外科从绵羊和人类角膜8。这些细胞斑块不表现出EMT的形态特性，并随着时间的推移缓慢扩张。在这些斑块之外，可以发现具有更不规则的成纤维细胞形状的较大细胞。一旦文化建立，可以去除的外植物使用钳子，并放置在新鲜的板，以建立新的文化。
角膜内皮细胞培养物中小而紧密包装的细胞对TrypLE的消化非常耐受，而较大的成纤维细胞对它更敏感。在将较小的细胞转移到新板之前，可以利用TrypLE电阻的这种差异选择性地从培养物中去除大细胞。图4显示了人类角膜内皮细胞在亚培养过程中使用TrypLE和Dispase II的代表性图像。
免疫荧光分析可以进行角膜内皮细胞培养，以定位细胞中的特定蛋白质。图 5中给出了这方面的一个示例。绵羊和人类角膜的外植被放置在24孔板的附着因子涂层玻璃盖上，并养殖4周。根据我们公布的协议9，使用免疫荧光作用对外植物进行分离，以分析存在ZO-1（一种紧密结蛋白）和N-cadherin（一种附着蛋白）。羊和人细胞均使用相同的抗ZO-1和抗N-球蛋白抗体，结果表明，这两种蛋白质在两种细胞的血浆膜中均被检测出来。ZO-1 通常以细胞边界处的一个独特带状存在，但在接受 EMT 的细胞中变得脆弱或不存在。因此，这些培养物中健壮的ZO-1表达表明细胞没有经过EMT。
我们定制的微型博登室设计用于将生物材料膜悬浮在6孔组织培养板的井内（图6）。将生物材料膜安装到微型博伊登室的过程如图7所示。微型博伊登室的设计允许膜的两侧悬浮在其中同时用作细胞培养表面。为了证明这一点，从角膜基质组织衍生出来的羊基质细胞以10万个细胞/cm2的密度播种到胶原蛋白I型膜的一侧，然后24小时后，室被翻转过来，绵羊角膜内皮细胞被播种到膜的另一侧，密度为40万细胞/厘米2。组织工程细胞层培养4周，然后用10%中性缓冲形式固定，并使用罗达明噬菌体素和Hoechst核染料33342染色。然后，他们使用共聚焦显微镜进行检查和拍照（图8）。组织工程细胞结构的横截面视图显示胶原膜的一个表面有一层角膜内皮细胞，另一面是角膜基质细胞的多层培养。
图1：从新鲜角膜获得内皮/脱皮膜外植技术。（A） 角膜在解剖显微镜下，将内皮侧放在培养皿中。（B） 以红色矩形表示的区域的特写视图 （A. ）制表师钳子用于轻轻地从底层频闪中剥离 Descemet 的膜。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：从内皮内皮/Descemet膜外植建立和扩大角膜内皮细胞培养的过程。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：羊角膜内皮膜外植在初始建立过程中内皮细胞培养的代表性相对比图像。（A） 绵羊角膜内皮/德塞米特的膜在培养3天后脱植。角膜内皮细胞已经开始迁移到板上。（B） 羊在1周后放养。外植物被一张细胞的汇流片包围着。（C） 羊在2周后放养。小细胞包围植物，而较大的细胞位于更远的地方。（D） 6周后放养绵羊。在较大细胞区域旁边可以看到一个小而紧密包装的细胞区域。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：分离小，紧密包装的人类角膜内皮细胞的亚培养。（A） 人类角膜内皮/德塞米特膜在7周后的膜外植培养。许多小，紧密包装的细胞是存在旁边的植物。（B） 在人类外植培养物中发育的小、紧密包装的细胞区域，其发展方式与绵羊外植培养物中观察到的相似。（C） 去除外植植物后和20分钟后接触TrypLE后，人类外植的培养。小，紧密包装的细胞保留了其附着板，而较大的细胞已经飘离。（D） 在Dispase II中1小时后，人类角膜内皮细胞培养。大多数细胞作为自由浮动团块从板中分离。（E） 人类角膜内皮细胞亚培养后1天。细胞从从原始外植培养体中分离出来的细胞团群向外迁移。（F） 人类角膜内皮细胞亚培养后12天。细胞已经形成了一个汇合的单层。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：通过双标记免疫荧光，将ZO-1和N-卡塞林蛋白定位在绵羊和人类角膜内皮细胞的膜中。绵羊和人类角膜内皮/Descemet的膜外植培养物在附着因子涂层玻璃盖上建立，并在4周后进行分析。ZO-1（绿色染色）和N-卡塞林（红色染色）在绵羊膜（A和B）和人（D和E）角膜内皮细胞中均被检测出来。对合并图像的分析表明，这两种蛋白质在培养物（C和F）中高度共结合。请点击此处查看此图的较大版本。
图6：横截面所示的微博伊登室图。我们定制的微型博登室由上室、下腔和 O 型环组成。它可用于在组织培养井内悬浮任何类型的膜状物质。请点击此处查看此图的较大版本。
图7：在微博伊登室中安装生物材料膜用于组织培养的程序。（A） 本程序所需的设备包括聚四氟乙烯切割板、一对钳子、直径为 18 mm 的三聚苯乙烯、一个定制的微型博登室和一个生物材料膜。（B） 用颤音从生物材料膜中打出一个圆盘。（C） 将 O 型环放入安装装置的上腔室，然后将生物材料圆盘放在上面。（D） 将下腔螺钉拧到安装装置的上腔室上。（E） 组装的微型博伊登室已准备好用70%乙醇进行灭菌。（F） 将消毒的微博登室浸入组织培养基中，浸入6孔组织培养板的井中。请点击此处查看此图的较大版本。
图8：羊角膜内皮和基质细胞在胶原蛋白I型膜的对侧。细胞被染色的phalloidin罗丹，以可视化行为素（红色）和Hoechst可视化核（蓝色）。胶原蛋白I型膜没有染色，因此在使用共聚焦显微镜收集的这些图像中不可见。（A） 组织工程构造的低倍率、横截面视图.代表角膜内皮细胞培养的薄一层活性素在膜的上表面可见，在膜的下表面有代表基质细胞培养的较厚的活性蛋白层。此图中未显示蓝色核。（B） 角膜内皮细胞层的面视图，显示行为素和核染色。（C） 角膜基质细胞层的 En 面视图，显示行为素和核染色。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
与建立和扩大人类角膜内皮细胞相关的一项重大技术挑战是防止EMT在培养物中发生。EMT可以通过细胞与细胞接触的丧失在角膜内皮细胞中触发，然而这些细胞的大多数细胞培养协议在分离和亚培养过程中涉及酶分离到单个细胞。在这里，我们提出了角膜内皮细胞的替代细胞培养方案，将细胞在隔离和亚培养阶段失去接触的风险降至最低。
我们建立角膜内皮细胞培养的方法包括将内皮膜的外植从供体角膜放入组织培养板，使细胞能够从膜中集体迁移到板中。为了取得成功，外植必须形成对组织培养板的紧密附着，这是最好的实现，不干扰板后几天的培养物已经建立。人类成功建立角膜内皮细胞培养的另一个关键因素是供体的年龄。30岁以下的捐助者往往获得较高的成功率。
使用外植培养方法建立角膜内皮细胞培养的缺点是，在建立培养物和获得大量细胞之间存在相对长的时间。所谓的"剥离和消化"方法包括从供体角膜中剥离内皮，用酶消化，以释放细胞进行培养。这些方法最初会产生比从外植中建立的细胞更多的培养物。
我们用于角膜内皮细胞的外植培养方法可产生含有非常小、紧凑、成熟、高质量的细胞的培养物。然而，培养物也含有更大，不太理想的细胞朝向板的外围。较大的细胞可以通过TrypLE消化去除，并根据需要丢弃，但这减少了可用于亚培养的细胞数量。然而，成功启动原细胞培养的外植几乎总是能够启动进一步的细胞培养，并且这种能力可以被利用来获得大量的高质量细胞。
我们对于角膜内皮细胞的亚培养方法包括使用 Dispase II 将细胞团块从组织培养板中轻轻提起，以转移到新鲜板中，尽管此方法旨在将 EMT 在通过中发生的可能性降至最低细胞，应该注意，它不会将风险降低到零。
许多团体的目标一直是为移植目的开发组织工程的角膜内皮细胞层。许多不同的材料被试验为细胞的载体，并使用了各种不同的方法来抑制材料在细胞培养过程中在培养板中移动。大多数方法都以某种方式将材料固定在组织培养板的表面，仅将细胞生长限制在膜的上表面。虽然这些方法可用于生产单层组织工程的角膜内皮，相当于内皮/Descemem的膜移植（DMEK移植），但它们不能用于生产组织工程等效的内皮内膜/德塞梅膜/科玛移植物（DSEK或DSAEK移植），这是目前外科医生最常用的。因此，我们开发了一种称为微型Boyden腔室的膜安装装置，它允许细胞在悬浮生物材料膜的两个表面上同时生长，并用它来生产由角膜内皮细胞和角膜基质细胞组成的组织工程移植物，由胶原蛋白I型膜的相反表面组成。这些双层组织工程移植物可能用于替代Descemet膜两侧（DSEK或DSAEK移植物）内皮内皮和基质组织的供体角膜衍生移植物。
总之，本文介绍的方法是为那些希望获得高质量的原发性角膜内皮细胞用于组织工程研究的人设计的。介绍了旨在降低细胞接受EMT的风险的温和培养方法，并介绍了一种在悬浮生物材料膜上生长细胞的方法。我们希望这些方法可以帮助其他人实现他们生产组织工程的角膜内皮移植的目标。
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Disclosures
提交人宣称，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
感谢诺埃米·加洛尼在编制图7期间给予的帮助。这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（项目赠款1099922）向卫生署提供的项目赠款以及昆士兰眼科基金会提供的补充资金的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
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