बायोमटेरियल झिल्ली पर मानव और भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल परतों का विकास
Summary
यह प्रोटोकॉल मानव या भेड़ ऊतकों के एक्सप्लांटसे कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों को स्थापित करने और विकसित करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करता है। झिल्लीदार बायोमैटेरियल्स पर कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं को सबकुलेट करने के लिए एक विधि भी प्रस्तुत की जाती है।
Abstract
कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों में सेल-टू-सेल संपर्क के नुकसान के बाद विशेषण-से-मेसेनचिमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरना पड़ता है। ईएमटी कोशिकाओं के लिए हानिकारक है क्योंकि यह एक परिपक्व और कार्यात्मक परत बनाने की उनकी क्षमता को कम करता है। यहां, हम मानव और भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों की स्थापना और अधीन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो सेल-टू-सेल संपर्क के नुकसान को कम करता है। कॉर्नियल एंडोथेलियम/डेसमेट की झिल्ली के एक्सप्लांट्स को दाता कॉर्निया से लिया जाता है और उन परिस्थितियों में ऊतक संस्कृति में रखा जाता है जो कोशिकाओं को सामूहिक रूप से संस्कृति की सतह पर स्थानांतरित करने की अनुमति देते हैं । एक बार एक संस्कृति स्थापित किया गया है, explants ताजा प्लेटों को हस्तांतरित करने के लिए नई संस्कृतियों शुरू कर रहे हैं । Dispase II का उपयोग धीरे-धीरे ऊतक संस्कृति प्लेटों से कोशिकाओं के झुरमुटों को उपात्रूप करने के लिए उठाने के लिए किया जाता है। कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियां जो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्थापित की गई हैं, पशु परीक्षणों में प्रत्यारोपण के लिए ऊतक-इंजीनियर कोशिका परतों का उत्पादन करने के लिए जैव सामग्री झिल्ली में स्थानांतरित करने के लिए उपयुक्त हैं। ऊतक संस्कृति के दौरान जैव सामग्री झिल्ली का समर्थन करने के लिए एक कस्टम-निर्मित डिवाइस का वर्णन किया गया है और कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक परत से बना ऊतक-इंजीनियर भ्रष्टाचार का एक उदाहरण है और कोलेजन प्रकार के दोनों ओर कॉर्नियल स्ट्रोमल कोशिकाओं की एक परत प्रस्तुत की जाती है।
Introduction
कॉर्निया एक पारदर्शी ऊतक है जो आंख के सामने स्थित है। यह तीन प्रमुख परतों से बना है: बाहरी सतह पर एक एपिथेलियल परत, एक मध्य स्ट्रोमा परत, और कॉर्नियल एंडोथेलियम नामक एक आंतरिक परत। कॉर्नियल एंडोथेलियम कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जो डेसेमेट की झिल्ली नामक तहखाने झिल्ली पर बैठता है और यह अंतर्निहित जलीय हास्य से स्ट्रोमा में प्रवेश करने वाले तरल पदार्थ की मात्रा को विनियमित करके कॉर्निया की पारदर्शिता को बनाए रखता है। स्ट्रोमा के भीतर बहुत अधिक तरल पदार्थ कॉर्नियल सूजन, अस्पष्टता और दृष्टि हानि का कारण बनता है। इसलिए दृष्टि बनाए रखने के लिए एंडोथेलियम महत्वपूर्ण है ।
कॉर्नियल एंडोथेलियम उम्र बढ़ने, बीमारी और चोट सहित कई कारणों से बेकार हो सकता है, और केवल वर्तमान उपचार प्रत्यारोपण सर्जरी है। इस सर्जरी के दौरान, एंडोथेलियम और डेसमेट की झिल्ली को रोगी के कॉर्निया से हटा दिया जाता है और एक दाता कॉर्निया से प्राप्त एंडोथेलियम और डेसमेट की झिल्ली के भ्रष्टाचार के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है। कई एंडोथेलियम ग्राफ्ट में मेजबान कॉर्निया1से निपटने और लगाव में सहायता करने के लिए स्ट्रोमल ऊतक की एक पतली परत भी होती है।
दुनिया भर में, प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए कॉर्नियल दाता ऊतक की मांग राशि है कि नेत्र बैंकों द्वारा आपूर्ति की जा सकती है2से अधिक है । इसलिए ऊतक इंजीनियर कॉर्नियल एंडोथेलियम प्रत्यारोपण विकसित करने के लिए एक अभियान चलाया गया है जिसका उपयोग इस कमी को कम करने के लिए किया जा सकता है। इसके लिए तर्क इस तथ्य पर आधारित है कि वर्तमान में, एक व्यक्ति कॉर्निया से एंडोथेलियम केवल एक ही रोगी को स्थानांतरित किया जा सकता है, हालांकि, यदि कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं को पहले विस्तारित किया गया था और ऊतक संस्कृति में जैव सामग्री मचान पर उगाया जाता है, तो उनका उपयोग कई रोगियों के इलाज के लिए किया जा सकता है।
प्रमुख चुनौतियों है कि ऊतक इंजीनियर कॉर्नियल एंडोथेलियम प्रत्यारोपण से पहले संबोधित करने की जरूरत है सर्जन के लिए एक व्यवहार्य विकल्प बन में शामिल हैं: (1) उच्च गुणवत्ता के कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं के विस्तार के लिए तकनीकों की स्थापना और परिपक्व उत्पादन के लिए और विट्रो में कार्यात्मक कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल परतें, और (2) बायोमटेरियल मचान पर कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए तकनीकों की स्थापना करने के लिए ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट का उत्पादन करने के लिए जो वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले दाता कॉर्निया-व्युत्पन्न ग्राफ्ट के बराबर या बेहतर हैं।
कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं में वीवो में बहुत कम प्रोलिजिरेटिव क्षमता होती है लेकिन इसे इन विट्रो4में विभाजित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है । फिर भी, उनमें विट्रो एपिथेलियल-टू-मेसेंचिमल ट्रांजिशन (ईएमटी) से गुजरना एक मजबूत प्रवृत्ति है, जो एक परिपक्व, कार्यात्मक एंडोथेलियल परत बनाने की उनकी क्षमता को कम कर देता है। कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं में ईएमटी के लिए ज्ञात ट्रिगर्स में कुछ विकास कारकों के संपर्क और सेल-टू-सेल संपर्क5का नुकसान शामिल है। इस प्रकार यह लगभग अपरिहार्य है कि कोर्नील एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों जो उपसंस्कृति के दौरान एन्जाइटी रूप से विसंबद्ध हैं, ईएमटी से जुड़े परिवर्तनों से गुजरना होगा। यहां, हम मानव या भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए एक सेल संस्कृति विधि प्रस्तुत करते हैं जो ईएमटी की क्षमता को कम करने के लिए अलगाव, विस्तार और उपसंस्कृति चरणों के दौरान सेल-टू-सेल संपर्कों के व्यवधान को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसके अलावा, हम प्रदर्शित कैसे ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट है कि दाता कॉर्निया-व्युत्पन्न एंडोथेलियम/Descemet झिल्ली/स्ट्रोमल ऊतक कलम के समान एक कस्टम में एक जैव सामग्री झिल्ली के दोनों ओर सुसंस्कृत सेल परतों बढ़ रही द्वारा उत्पादित किया जा सकता है बढ़ते डिवाइस ।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की स्थापना और विस्तार से जुड़ी एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती ईएमटी को संस्कृतियों में होने से रोक रही है। ईएमटी को सेल-टू-सेल संपर्क के नुकसान से कॉर्नियल एंडोथेलियल …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
चित्रा 7की तैयारी के दौरान उसकी सहायता के लिए Noémie गैलोरिनी के लिए धन्यवाद। इस काम को ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (परियोजना अनुदान 1099922) द्वारा डीएच को दिए गए एक परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और क्वींसलैंड नेत्र संस्थान फाउंडेशन से प्राप्त अनुपूरक वित्तपोषण द्वारा।
Materials
| Attachment factor | Gibco | S006100 | A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C. |
| Bovine pituitary extract | Gibco | 13028014 | A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots. |
| Calcium chloride | Merck | C5670 | Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Centrifuge tube, 50 ml | Labtek | 650.550.050 | |
| Chondroitin sulphate | LKT Laboratories | C2960 | This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Dispase II | Gibco | 17105-041 | Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots. |
| Ethanol | Labtek | EA043 | 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces. |
| Foetal bovine serum | GE Healthcare Australia Pty Ltd | SH30084.03 | This is a HyClone brand of foetal bovine serum. |
| Coverglass No. 1, Ø 13 mm | Proscitech | G401-13 | Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture. |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride. |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Merck | A8960 | Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise. |
| Micro-Boyden chamber | CNC Components Pty. Ltd. | Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 | Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE). |
| O-ring for micro-Boyden chamber | Ludowici Sealing Solutions | RSB012 | Composed of silicon rubber. |
| Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 | Gibco | 51985-034 | A reduced serum medium containing glutamine. |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride. |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin. |
| Petri dish | Sarstedt | 82.14473.001 | Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections. |
| Tissue culture plate, 24 well | Corning Incorporated | Costar 3524 | A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2. |
| Tissue culture plate, 6 well | Corning Incorporated | Costar 3516 | A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2. |
| TrypLE Select | Gibco | 12563-011 | A 1X enzyme solution for dissociating cells. |
| Versene | Gibco | 15040-066 | A 1X EDTA solution for dissociating cells. |
| Watchmaker forceps | Labtek | BWMF4 | Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas. |
References
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