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Bioengineering

बायोमटेरियल झिल्ली पर मानव और भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल परतों का विकास

Published: February 6, 2020 doi: 10.3791/60762
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,3,4,5,6,7,8, 1,3,4
1Queensland Eye Institute, 2King Faisal University, 3School of Biomedical Sciences, Faculty of Health, Queensland University of Technology, 4Institute of Health and Biomedical Innovation, Queensland University of Technology, 5Science and Engineering Faculty, Queensland University of Technology, 6Faculty of Medicine, University of Queensland, 7Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology, University of Queensland, 8Faculty of Science, University of Western Australia

Summary

यह प्रोटोकॉल मानव या भेड़ ऊतकों के एक्सप्लांटसे कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों को स्थापित करने और विकसित करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करता है। झिल्लीदार बायोमैटेरियल्स पर कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं को सबकुलेट करने के लिए एक विधि भी प्रस्तुत की जाती है।

Abstract

कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों में सेल-टू-सेल संपर्क के नुकसान के बाद विशेषण-से-मेसेनचिमल संक्रमण (ईएमटी) से गुजरना पड़ता है। ईएमटी कोशिकाओं के लिए हानिकारक है क्योंकि यह एक परिपक्व और कार्यात्मक परत बनाने की उनकी क्षमता को कम करता है। यहां, हम मानव और भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों की स्थापना और अधीन करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं जो सेल-टू-सेल संपर्क के नुकसान को कम करता है। कॉर्नियल एंडोथेलियम/डेसमेट की झिल्ली के एक्सप्लांट्स को दाता कॉर्निया से लिया जाता है और उन परिस्थितियों में ऊतक संस्कृति में रखा जाता है जो कोशिकाओं को सामूहिक रूप से संस्कृति की सतह पर स्थानांतरित करने की अनुमति देते हैं । एक बार एक संस्कृति स्थापित किया गया है, explants ताजा प्लेटों को हस्तांतरित करने के लिए नई संस्कृतियों शुरू कर रहे हैं । Dispase II का उपयोग धीरे-धीरे ऊतक संस्कृति प्लेटों से कोशिकाओं के झुरमुटों को उपात्रूप करने के लिए उठाने के लिए किया जाता है। कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियां जो इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके स्थापित की गई हैं, पशु परीक्षणों में प्रत्यारोपण के लिए ऊतक-इंजीनियर कोशिका परतों का उत्पादन करने के लिए जैव सामग्री झिल्ली में स्थानांतरित करने के लिए उपयुक्त हैं। ऊतक संस्कृति के दौरान जैव सामग्री झिल्ली का समर्थन करने के लिए एक कस्टम-निर्मित डिवाइस का वर्णन किया गया है और कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक परत से बना ऊतक-इंजीनियर भ्रष्टाचार का एक उदाहरण है और कोलेजन प्रकार के दोनों ओर कॉर्नियल स्ट्रोमल कोशिकाओं की एक परत प्रस्तुत की जाती है।

Introduction

कॉर्निया एक पारदर्शी ऊतक है जो आंख के सामने स्थित है। यह तीन प्रमुख परतों से बना है: बाहरी सतह पर एक एपिथेलियल परत, एक मध्य स्ट्रोमा परत, और कॉर्नियल एंडोथेलियम नामक एक आंतरिक परत। कॉर्नियल एंडोथेलियम कोशिकाओं का एक मोनोलेयर है जो डेसेमेट की झिल्ली नामक तहखाने झिल्ली पर बैठता है और यह अंतर्निहित जलीय हास्य से स्ट्रोमा में प्रवेश करने वाले तरल पदार्थ की मात्रा को विनियमित करके कॉर्निया की पारदर्शिता को बनाए रखता है। स्ट्रोमा के भीतर बहुत अधिक तरल पदार्थ कॉर्नियल सूजन, अस्पष्टता और दृष्टि हानि का कारण बनता है। इसलिए दृष्टि बनाए रखने के लिए एंडोथेलियम महत्वपूर्ण है ।

कॉर्नियल एंडोथेलियम उम्र बढ़ने, बीमारी और चोट सहित कई कारणों से बेकार हो सकता है, और केवल वर्तमान उपचार प्रत्यारोपण सर्जरी है। इस सर्जरी के दौरान, एंडोथेलियम और डेसमेट की झिल्ली को रोगी के कॉर्निया से हटा दिया जाता है और एक दाता कॉर्निया से प्राप्त एंडोथेलियम और डेसमेट की झिल्ली के भ्रष्टाचार के साथ प्रतिस्थापित किया जाता है। कई एंडोथेलियम ग्राफ्ट में मेजबान कॉर्निया1से निपटने और लगाव में सहायता करने के लिए स्ट्रोमल ऊतक की एक पतली परत भी होती है।

दुनिया भर में, प्रत्यारोपण सर्जरी के लिए कॉर्नियल दाता ऊतक की मांग राशि है कि नेत्र बैंकों द्वारा आपूर्ति की जा सकती है2से अधिक है । इसलिए ऊतक इंजीनियर कॉर्नियल एंडोथेलियम प्रत्यारोपण विकसित करने के लिए एक अभियान चलाया गया है जिसका उपयोग इस कमी को कम करने के लिए किया जा सकता है। इसके लिए तर्क इस तथ्य पर आधारित है कि वर्तमान में, एक व्यक्ति कॉर्निया से एंडोथेलियम केवल एक ही रोगी को स्थानांतरित किया जा सकता है, हालांकि, यदि कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं को पहले विस्तारित किया गया था और ऊतक संस्कृति में जैव सामग्री मचान पर उगाया जाता है, तो उनका उपयोग कई रोगियों के इलाज के लिए किया जा सकता है।

प्रमुख चुनौतियों है कि ऊतक इंजीनियर कॉर्नियल एंडोथेलियम प्रत्यारोपण से पहले संबोधित करने की जरूरत है सर्जन के लिए एक व्यवहार्य विकल्प बन में शामिल हैं: (1) उच्च गुणवत्ता के कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं के विस्तार के लिए तकनीकों की स्थापना और परिपक्व उत्पादन के लिए और विट्रो में कार्यात्मक कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल परतें, और (2) बायोमटेरियल मचान पर कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए तकनीकों की स्थापना करने के लिए ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट का उत्पादन करने के लिए जो वर्तमान में उपयोग किए जाने वाले दाता कॉर्निया-व्युत्पन्न ग्राफ्ट के बराबर या बेहतर हैं।

कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं में वीवो में बहुत कम प्रोलिजिरेटिव क्षमता होती है लेकिन इसे इन विट्रो4में विभाजित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है । फिर भी, उनमें विट्रो एपिथेलियल-टू-मेसेंचिमल ट्रांजिशन (ईएमटी) से गुजरना एक मजबूत प्रवृत्ति है, जो एक परिपक्व, कार्यात्मक एंडोथेलियल परत बनाने की उनकी क्षमता को कम कर देता है। कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं में ईएमटी के लिए ज्ञात ट्रिगर्स में कुछ विकास कारकों के संपर्क और सेल-टू-सेल संपर्क5का नुकसान शामिल है। इस प्रकार यह लगभग अपरिहार्य है कि कोर्नील एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों जो उपसंस्कृति के दौरान एन्जाइटी रूप से विसंबद्ध हैं, ईएमटी से जुड़े परिवर्तनों से गुजरना होगा। यहां, हम मानव या भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए एक सेल संस्कृति विधि प्रस्तुत करते हैं जो ईएमटी की क्षमता को कम करने के लिए अलगाव, विस्तार और उपसंस्कृति चरणों के दौरान सेल-टू-सेल संपर्कों के व्यवधान को कम करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। इसके अलावा, हम प्रदर्शित कैसे ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट है कि दाता कॉर्निया-व्युत्पन्न एंडोथेलियम/Descemet झिल्ली/स्ट्रोमल ऊतक कलम के समान एक कस्टम में एक जैव सामग्री झिल्ली के दोनों ओर सुसंस्कृत सेल परतों बढ़ रही द्वारा उत्पादित किया जा सकता है बढ़ते डिवाइस ।

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Protocol

अनुसंधान के लिए दाता सहमति के साथ मानव कॉर्निया क्वींसलैंड नेत्र बैंक से प्राप्त किए गए थे और मेट्रो दक्षिण अस्पताल और स्वास्थ्य सेवा की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति (HREC/07/QPAH/048) से नैतिकता अनुमोदन के साथ इस्तेमाल किया गया । भेड़ कॉर्निया एक ऊतक साझा समझौते के तहत क्वींसलैंड विश्वविद्यालय के हर्स्टन चिकित्सा अनुसंधान सुविधा में इच्छामृत्यु जानवरों से प्राप्त किए गए थे ।

1. विच्छेदन उपकरण की तैयारी

  1. संख्या 4 वॉचमेकर के दो जोड़े या तो उन्हें 5 मिन के लिए 70% इथेनॉल के समाधान में भिगोकर या उन्हें ऑटोक्लेव करके मजबूर करें।

2. संस्कृति माध्यम और ऊतक संस्कृति प्लेटों की तैयारी

  1. ऑप्टी-एमईएम 1 (1x) + ग्लूटामैक्स-1, 5% भ्रूण गोजातीय सीरम और 100 यू/एमएल पेन/स्ट्रेप युक्त कल्चर मीडियम का 100 मीटर तैयार करें। यह संस्कृति माध्यम भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों के लिए पर्याप्त है, हालांकि, मानव कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों के लिए माध्यम को 50 μg/mL गोजातीय पिट्यूटरी एक्सट्रैक्ट, 0.08% कॉन्ड्रोइटिन सल्फेट, 200 μg/mL कैल्शियम क्लोराइड और 0.3 m एल-एस्कोबिक एसिड 2-फॉस्फेट के साथ पूरक किया जाना चाहिए। संस्कृति माध्यम को दो सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. निर्माता के निर्देशों का उपयोग करके अटैचमेंट फैक्टर के साथ 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के कुओं को कोट करें और फिर प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम का 1 मिलील जोड़ें। प्रत्येक कॉर्निया के लिए एक अच्छी तरह से तैयार करें।

3. निष्कासन विच्छेदन और सेल संस्कृति प्रक्रिया

  1. कॉर्निया, एंडोथेलियम साइड को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के चरण पर एक बाँझ पेट्री डिश में रखें। रोशनी को समायोजित करें ताकि कॉर्नियल सतह एंडोथेलियल परत को उजागर करने के लिए पर्याप्त विपरीत के साथ अच्छी तरह से जलाई जाए। जूम को एडजस्ट करें ताकि एज और कुछ सेंट्रल कॉर्नियल एंडोथेलियम देखने में आए।
  2. अंतर्निहित स्ट्रोमा(चित्रा 1)से दूर डेसमेट की झिल्ली को धीरे से उठाने और फाड़ने के लिए निष्फल वॉचमेकर संदंश का उपयोग करें। झिल्ली स्ट्रोमा से एक पट्टी के रूप में अलग हो जाएगी जो तुरंत ऊपर कर्ल करती है। एक 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के एक अच्छी तरह से पट्टी रखें जिसे अटैचमेंट फैक्टर के साथ लेपित किया गया है और इसमें संस्कृति माध्यम का 1 मिलील शामिल है। टिश्यू कल्चर प्लेट के ढक्कन को हर समय चालू रखना चाहिए, सिवाय इसके कि जब इसमें एक्सप्लांट ्स जोड़े जा रहे हैं, प्रदूषण के खतरे को कम करने के लिए।
  3. पहले एंडोथेलियम की चरम परिधि से डेसमेट की झिल्ली की स्ट्रिप्स निकालें और फिर बाद में मध्य क्षेत्रों से। एक कॉर्निया से सभी स्ट्रिप्स को 6-वेल प्लेट के भीतर एक अच्छी तरह से रखें।
  4. 5% सीओ2 और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक आर्द्र सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में एक्सप्लांट्स इनक्यूबेट करें। पौधों को व्यवस्थित करने और प्लेट की सतह से जुड़ने की अनुमति देने के लिए संस्कृति को 2 दिनों के लिए अव्यवस्थित छोड़ दें। आमतौर पर, एक तिहाई तक एक्सप्लांट प्लेट से जुड़ने में विफल हो जाते हैं।
  5. 4 दिनों के बाद संस्कृति से मध्यम और किसी भी असंबद्ध एक्सप्लांट को हटा दें और धीरे-धीरे संलग्न एक्सप्लांट्स को परेशान न करने के लिए ताजा संस्कृति माध्यम के 2 मिलील जोड़ें। संस्कृति माध्यम प्रति सप्ताह दो बार बदला जाना चाहिए ।

4. धारावाहिक एक्सप्लांट संस्कृति द्वारा कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं का निरंतर उत्पादन

नोट: Explants अतिरिक्त कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए 10 दिनों के बाद ताजा ऊतक संस्कृति प्लेटों को हस्तांतरित किया जा सकता है ।

  1. एक्सप्लांट संस्कृति को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के चरण पर रखें और रोशनी और ज़ूम को समायोजित करें ताकि एक्सप्लांट दिखाई दे।
  2. निष्फल वॉचमेकर संदंश का उपयोग करना, धीरे-धीरे अपनी संस्कृति प्लेट से प्रत्येक एक्सप्लांट को बांधना और इसे 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के एक ताजा कुएं में स्थानांतरित करें जिसे अटैचमेंट फैक्टर के साथ लेपित किया गया है और इसमें संस्कृति माध्यम का 1 मिलील शामिल है।
  3. एक्सप्लांट्स को ताजा संस्कृति माध्यम के 2 मिलील के साथ संस्कृति माध्यम की जगह से पहले 4 दिनों के लिए अपनी नई प्लेट की सतह पर बसने की अनुमति दें। परिवर्तन संस्कृति माध्यम प्रति सप्ताह दो बार बदल गया ।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण के लिए ग्लास कवरस्लिप पर कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाएं बढ़ना

नोट: कोशिका संस्कृतियों कि प्रतिकार का उपयोग कर विश्लेषण किया जाना किस्मत में है कांच कवरस्लिप पर स्थापित किया जाना चाहिए कि कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर घुड़सवार धुंधला प्रक्रिया के बाद किया जा सकता है ।

  1. एक ऑटोक्लेव में 13 मिमी व्यास के गोल ग्लास कवरस्लिप के एक पैक को स्टरलाइज करें या 15 मिन के लिए 70% इथेनॉल में भिगोकर और इसके बाद फॉस्फेट-बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) में तीन कुल्ला।
  2. एक 24 अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के कुओं में व्यक्तिगत कवरस्लिप प्लेस, उन्हें लगाव कारक के साथ कोट, और फिर प्रत्येक अच्छी तरह से संस्कृति माध्यम के ०.५ mL जोड़ें ।
  3. निष्फल वॉचमेकर का उपयोग करना मजबूर करना अपने ऊतक संस्कृति प्लेटों से एक्सप्लांट को हटा देता है और उन्हें कवरस्लिप वाले कुओं में स्थानांतरित कर देता है। एक्सप्लांट्स को माध्यम बदलने से पहले 4 दिनों के लिए कवरस्लिप पर व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
  4. आवश्यक ऊष्मायन अवधि के बाद, अपनी संस्कृति कुओं के भीतर कवरस्लिप संस्कृतियों को ठीक और दाग दें। एक फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप के तहत विश्लेषण के लिए ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड पर दाग कवरस्लिप माउंट।

6. डिस्पास II का उपयोग करके कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की उपसंस्कृति

नोट: इस प्रक्रिया का उपयोग करके अलग करने से पहले 6-अच्छी प्लेटों में बड़ी फाइब्रोब्लास्टिक कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से हटाया जा सकता है। यदि सभी कोशिकाओं को उपसंस्कार किया जाना है, तो 6.2 से 6.4 कदम न उठाएं। इस प्रक्रिया का उद्देश्य कोशिकाओं को ताजा प्लेटों में स्थानांतरित करना है, जबकि उनके सेल-टू-सेल संपर्कों को यथासंभव बनाए रखना है। कोशिकाओं को धीरे-धीरे संभाला जाना चाहिए। पूरी तरह से अनुकूल कुओं को 1:2 के अनुपात में पारित किया जाना चाहिए, जबकि पनडुब्बी कुओं को 1:1 या उससे कम के अनुपात में पारित किया जाना चाहिए।

  1. संस्कृति से माध्यम निकालें और संक्षिप्त रूप से डीपीबीएस के साथ कुल्ला।
  2. वर्सेर्न के 1 mL जोड़ें। 30 एस के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
  3. वर्ने निकालें और ट्रिपल के 1 mL जोड़ें। 3 मिन के लिए टिश्यू कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
  4. एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग कर संस्कृति का निरीक्षण करें। धीरे-धीरे प्लेट से कोशिकाओं को उखाड़ फेंकने के लिए संस्कृति को टैप करें। जैसे ही बड़ी फाइब्रोब्लास्टिक कोशिकाएं प्लेट से अलग हो जाती हैं, उन्हें हटा दें और 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके ट्रिपल। डीपीबीएस के 2 mL के साथ दो बार रिंसिंग करके शेष कोशिकाओं से अवशिष्ट ट्रिपल को धोएं।
  5. 1 मिलीग्राम/mL Dispase द्वितीय के 1 मिलीग्राम जोड़ें और 1 से 2 घंटे के लिए ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर या जब तक सभी कोशिकाओं को थाली से अलग है । कोशिकाओं को धीरे-धीरे झुरमुट में प्लेट से दूर तैरना चाहिए।
  6. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को इकट्ठा करें और 50 मीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में डीपीबीएस के 20 एमएल में स्थानांतरित करें। कमरे के तापमान पर 300 x ग्राम पर 5 न्यूनतम के लिए सेंट्रलाइज।
  7. अधिनायक को हटा दें और संस्कृति माध्यम के 1 मिलील में 1 मिलील पिपेट के साथ त्रितुमेद्वारा सेल पैलेट को धीरे से फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन को 6-अच्छी प्लेट के या तो एक या दो कुओं में स्थानांतरित करें, क्रमशः 1:1 या 1:2 के अनुपात में पारित होने के लिए।
  8. 2 mL बनाने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से माध्यम ऊपर और ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में संस्कृतियों जगह है । प्रति सप्ताह दो बार ताजा माध्यम के 2 mL के साथ माध्यम की जगह ।

7. बायोमटेरियल झिल्ली पर कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल परतों का विकास

नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया एक कस्टम-निर्मित बढ़ते डिवाइस में एक झिल्लीदार बायोमटेरियल को बढ़ाने में शामिल कदमों का वर्णन करती है- जिसे सेल संस्कृति के लिए माइक्रो-बॉयडन चैंबर कहा जाता है। कृपया डिवाइस के बारे में अधिक जानकारी के लिए और विवरण खरीदने के लिए हमारे हाल के प्रकाशन6 का उल्लेख करें ।

  1. माइक्रो-बॉयडन चैंबर के ऊपरी कक्ष को अपने केंद्र में लाल ओ-रिंग रखकर इकट्ठा करें।
  2. पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन (पीटीएफई) कटिंग बोर्ड पर बायोमटेरियल शीट से डिस्क को पंच करने के लिए 18 मिमी व्यास के ट्रेफिन का उपयोग करें। इस डिस्क को माइक्रो-बॉयडन चैंबर के ऊपरी कक्ष में लाल ओ-रिंग के ऊपर रखें।
  3. ऊपरी कक्ष पर निचले कक्ष पेंच, बीच में जैव सामग्री डिस्क हासिल ।
  4. इकट्ठे माइक्रो-बॉयडन चैंबर को 1 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में भिगोकर स्टरलाइज करें।
  5. इथेनॉल को हटाने के लिए 10 मिन के लिए बाँझ एचबीएसएस में इकट्ठे माइक्रो-बॉयडन चैंबर को पूरी तरह से विसर्जित करें। इस वॉश स्टेप को दो बार दोहराएं। अपूरक संस्कृति माध्यम में 10 मिन के लिए एक अंतिम धोने कदम प्रदर्शन करते हैं।
  6. एक 6-अच्छी तरह से प्लेट के कुएं में निष्फल माइक्रो-बॉयडन चैंबर को संस्कृति माध्यम में स्थानांतरित करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऊपरी कक्ष ऊपरवाला है। संस्कृति माध्यम के स्तर को समायोजित करें ताकि यह जैव सामग्री झिल्ली की निचली सतह से संपर्क करे लेकिन ऊपरी कक्ष में प्रवाहित न हो।
  7. धारा 6 में उल्लिखित प्रक्रिया का उपयोग करके कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं का निलंबन तैयार करें। निलंबन में पर्याप्त सेल घनत्व माइक्रो-बॉयडन कक्ष में झिल्ली पर प्रति सेमी2 कम से कम 100,000 कोशिकाओं के सीडिंग घनत्व की अनुमति देने के लिए प्राप्त किया जाना चाहिए। माइक्रो-बॉयडन चैंबर के भीतर संस्कृति सतह क्षेत्र 0.5 सेमी2 है और यह 100 माइक्रोन की मात्रा रख सकता है। इसलिए, 500,000 कोशिकाओं/mL वाले निलंबन को तैयार किया जाना चाहिए।
  8. माइक्रो-बॉयडन कक्ष में झिल्ली पर सेल निलंबन (50,000 कोशिकाओं) का पिपेट 100 माइक्रोन। कक्ष को पूरी तरह से जलमग्न करने के लिए माध्यम को टॉपिंग करने से पहले 4 घंटे के लिए ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में इनक्यूबेटर। प्रति सप्ताह दो बार माध्यम की जगह, समय की आवश्यक अवधि के लिए संस्कृति को इनक्यूबेट करें।
    नोट: एक बार कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं जैव सामग्री झिल्ली की ऊपरी सतह से जुड़ा है माइक्रो Boyden चैंबर संस्कृति के भीतर अच्छी तरह से फ़्लिप किया जा सकता है ताकि निचले कक्ष ऊपरवाला है । झिल्ली की अन्य सतह पर कोशिका संस्कृतियों को शुरू करने के लिए कक्ष में अधिक कोशिकाओं को जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, कॉर्नियल स्ट्रोमल कोशिकाओं को वैकल्पिक सतह पर आसानी से लागू किया जा सकता है इस प्रकार कॉर्नियल सेल प्रकारों के सापेक्ष स्थान की नकल करते हुए, जैसा कि पीछे कॉर्निया के भीतर देखा गया है।

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Representative Results

मानव या भेड़ कॉर्निया से कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं को अलग करने और विस्तारित करने की विधि को चित्र ा 1 और चित्रा 2में संक्षेप में बताया गया है । अधिकांश एक्सप्लांट जो 1 से 2 साल की भेड़ या 30 साल से कम उम्र के मानव दानदाताओं के कॉर्निया से प्राप्त होते हैं, एक सप्ताह के भीतर अटैचमेंट फैक्टर-लेपित ऊतक संस्कृति प्लेटों को संलग्न करेंगे, हालांकि, यह जानना असामान्य नहीं है कि एक तिहाई तक एक्सप्लांट इस समय के भीतर संलग्न करने में विफल रहते हैं। इन 'फ्लोटिंग' एक्सप्लांट्स को संस्कृतियों से हटाया जा सकता है। 30 साल से अधिक उम्र के मानव दाताओं से Explants कम थाली को संलग्न करने की संभावना है और भी कम सेल संस्कृतियों का उत्पादन होने की संभावना है । भेड़ और मानव एक्सप्लांटसे उत्पन्न कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों की प्रतिनिधि छवियां चित्र 3 और चित्र 4में दिखाई जाती हैं। एक्सप्लांट्स से निकलने वाली कोशिकाएं आम तौर पर एक-दूसरे के संपर्क में रहती हैं क्योंकि वे प्लेट पर बाहर निकलती हैं। इस तरह के प्रवास को सामूहिक सेल माइग्रेशन के रूप में जाना जाता है, और यह एपिथेलियल कोशिकाओं की एक विशेषता है7। संस्कृति के 2 सप्ताह तक, छोटे, कसकर पैक कोशिकाओं के पैच तुरंत दोनों भेड़ और मानव कॉर्निया8से explants के कई के बगल में गठन किया जाएगा । कोशिकाओं के ये पैच ईएमटी की रूपात्मक विशेषताओं का प्रदर्शन नहीं करते हैं और समय के साथ धीरे-धीरे विस्तार करते हैं। अधिक अनियमित, फाइब्रोब्लास्टिक आकार के साथ बड़ी कोशिकाओं को इन पैच के बाहर पाया जा सकता है। एक बार संस्कृतियों की स्थापना की गई है, explants संदंश का उपयोग कर हटाया जा सकता है और ताजा प्लेटों में रखा नई संस्कृतियों की स्थापना के लिए ।

कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों के भीतर छोटी, कसकर पैक कोशिकाएं ट्रिपल के साथ पाचन के लिए बहुत प्रतिरोधी हैं, जबकि बड़ी फाइब्रोब्लास्टिक कोशिकाएं इसके प्रति अधिक संवेदनशील होती हैं। ट्रिपल प्रतिरोध में इस अंतर को छोटी कोशिकाओं को नई प्लेटों में स्थानांतरित करने से पहले संस्कृतियों से बड़ी कोशिकाओं को चुनिंदा रूप से हटाने के लिए शोषण किया जा सकता है। ट्रिपल और डिस्पास II का उपयोग करके उपात्पूत प्रक्रिया में मानव कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों की प्रतिनिधि छवियां चित्र 4में दिखाई जाती हैं।

कोशिकाओं में विशिष्ट प्रोटीन का पता लगाने के लिए कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण किए जा सकते हैं। इसका एक उदाहरण चित्र 5में प्रस्तुत किया गया है । भेड़ और मानव कॉर्निया से Explants 24 में लगाव फैक्टर-लेपित ग्लास कवरस्लिप पर रखा गया था और 4 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत । एक्सप्लांट्स को हटा दिया गया और फिर संस्कृतियों का विश्लेषण हमारे प्रकाशित प्रोटोकॉल9के अनुसार, ZO-1, एक तंग जंक्शन प्रोटीन और एन-कैथेरिन, एक अनुयायियों जंक्शन प्रोटीन की उपस्थिति के लिए प्रतिरक्षण का उपयोग करके किया गया । भेड़ और मानव कोशिकाओं दोनों के लिए एक ही एंटी-जेडओ-1 और एंटी-एन-कैथेरिन एंटीबॉडी का इस्तेमाल किया गया और नतीजों से पता चला कि दोनों प्रजातियों से कोशिकाओं की प्लाज्मा झिल्ली में दोनों प्रोटीन का पता चला । ZO-1 आम तौर पर सेल सीमा पर एक अलग बैंड के रूप में मौजूद है, लेकिन कमजोर या EMT के दौर से गुजर कोशिकाओं में अनुपस्थित हो जाता है । इसलिए, इन संस्कृतियों में मजबूत ZO-1 अभिव्यक्ति ने संकेत दिया कि कोशिकाओं को ईएमटी नहीं आया था।

हमारे कस्टम निर्मित माइक्रो-बॉयडन कक्षों को 6-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट(चित्रा 6)के कुएं के भीतर एक जैव सामग्री झिल्ली को निलंबित करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक माइक्रो-बॉयडन कक्ष में बायोमटेरियल झिल्ली को बढ़ाने की प्रक्रिया चित्रा 7में दिखाई गई है। माइक्रो-बॉयडन चैंबर का डिजाइन इसके भीतर निलंबित झिल्ली के दोनों किनारों को सेल संस्कृति सतहों के रूप में एक साथ उपयोग करने की अनुमति देता है। यह प्रदर्शित करने के लिए, कॉर्नियल स्ट्रोमल ऊतक से प्राप्त भेड़ स्ट्रोमल कोशिकाओं को एक कोलेजन प्रकार के एक तरफ १००,००० कोशिकाओं/सेमी2 के घनत्व पर वरीयता दी गई थी और फिर 24 घंटे बाद कक्ष को फ़्लिप किया गया था और भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं को ४००,००० कोशिकाओं/2 के घनत्व पर झिल्ली के दूसरी तरफ वरीयता दी गई थी । ऊतक इंजीनियर सेल परतों को 4 सप्ताह के लिए सुसंस्कृत किया गया था, फिर 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन के साथ तय किया गया था और रोडामिन फालोलाइडिन और Hoechst परमाणु रंग 33342 का उपयोग करके दाग दिया गया था। इसके बाद उनकी जांच की गई और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप(चित्रा 8)का उपयोग करके फोटो खिंचवाई गई । ऊतक-इंजीनियर कोशिका निर्माण के एक क्रॉस-सेक्शन दृश्य ने कोलेजन झिल्ली की एक सतह पर कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की एक परत और दूसरी सतह पर कॉर्नियल स्ट्रोमल कोशिकाओं की बहुस्तरीय संस्कृति का पता चला।

Figure 1
चित्रा 1: ताजा कॉर्निया से एंडोथेलियम/डेसमेट की झिल्ली के एक्सप्लांट प्राप्त करने की तकनीक। (क)कॉर्निया को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे पेट्री डिश में एंडोथेलियम-साइड रखा गया है । (ख)एक लाल आयत(ए)द्वारा इंगित क्षेत्र के करीब दृश्य । वॉचमेकर संदंश का उपयोग अंतर्निहित स्ट्रोमा से डेसमेट की झिल्ली को धीरे-धीरे छीलने के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एंडोथेलियम/डेसेमेट की झिल्ली एक्सप्लांट्स से कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की संस्कृतियों की स्थापना और विस्तार के लिए प्रक्रिया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियम/डेसमेट की झिल्ली के explants से प्रारंभिक स्थापना के दौरान एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवियां । (A)संस्कृति में 3 दिनों के बाद भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियम/डेसमेट की झिल्ली एक्सप्लांट । कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं को थाली पर स्थानांतरित करने के लिए शुरू कर दिया है । (ख)एक भेड़ 1 सप्ताह के बाद संस्कृति को निकालना । एक्सप्लांट कोशिकाओं की एक शंखनाद शीट से घिरा हुआ है। (ग)एक भेड़ 2 सप्ताह के बाद संस्कृति को निकालना । छोटी कोशिकाएं एक्सप्लांट को घेर लेती हैं जबकि बड़ी कोशिकाएं आगे दूर स्थित होती हैं। (D)एक भेड़ 6 सप्ताह के बाद संस्कृति को निकालना । छोटी, कसकर पैक कोशिकाओं का एक क्षेत्र बड़ी कोशिकाओं के एक क्षेत्र के बगल में देखा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: उपसंस्कृतियों के लिए छोटे, कसकर पैक मानव कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव। (A)एक मानव कॉर्नियल एंडोथेलियम/डेसमेट की झिल्ली 7 सप्ताह के बाद संस्कृति को निकालना । कई छोटे, कसकर पैक कोशिकाओं को explant के बगल में मौजूद हैं । (ख)छोटी, कसकर पैक की गई कोशिकाओं के क्षेत्र मानव एक्सप्लांट संस्कृतियों में इसी तरह से विकसित होते हैं जो भेड़ ों के पौधे संस्कृतियों में मनाया जाता है । (ग)एक्सप्लांट को हटाने के बाद और ट्रिपल के 20 मिन के संपर्क में आने के बाद एक मानव एक्सप्लांट संस्कृति । छोटे, कसकर पैक कोशिकाओं ने प्लेट के प्रति अपना लगाव बनाए रखा है जबकि बड़ी कोशिकाओं ने दूर मंगाई है। (घ)डिपास द्वितीय में 1 घंटे के बाद एक मानव कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृति। अधिकांश कोशिकाओं को मुफ्त फ्लोटिंग झुरमुट के रूप में थाली से अलग कर दिया है । (ई)1 दिन के बाद एक मानव कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल उपसंस्कृति। कोशिकाएं कोशिकाओं के झुरमुट से बाहर चले गए हैं जो मूल एक्सप्लांट संस्कृति से अलग थे। (च)12 दिनों के बाद एक मानव कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल उपसंस्कृति। कोशिकाओं ने एक शंखनाद मोनोलेयर बनाया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: दोहरी लेबलिंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस द्वारा भेड़ और मानव कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की झिल्ली में ZO-1 और एन-कैडेरिन प्रोटीन का स्थानीयकरण। भेड़ और मानव कॉर्नियल एंडोथेलियम/डेसमेट की झिल्ली एक्सप्लांट संस्कृतियों को अटैचमेंट फैक्टर-लेपित ग्लास कवरस्लिप पर स्थापित किया गया था और 4 सप्ताह के बाद विश्लेषण किया गया था । भेड़(ए और बी)और मानव(डी और ई)कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की झिल्ली में ZO-1 (हरा दाग) और एन-कैथेरिन (लाल दाग) दोनों का पता चला। विलय छवियों के विश्लेषण से पता चला है कि दो प्रोटीन अत्यधिक संस्कृतियों(सी और एफ)के भीतर स्थानीयकृत थे । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्र6: क्रॉस सेक्शन में दिखाए गए माइक्रो-बॉयडन चैंबर का आरेख। हमारे कस्टम निर्मित माइक्रो Boyden चैंबर एक ऊपरी कक्ष, एक निचले कक्ष और एक ओ अंगूठी के होते हैं । इसका उपयोग ऊतक संस्कृति के भीतर किसी भी प्रकार की झिल्लीदार सामग्री को अच्छी तरह से निलंबित करने के लिए किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: ऊतक संस्कृति के लिए एक माइक्रो-बॉयडन कक्ष में एक जैव सामग्री झिल्ली बढ़ते के लिए प्रक्रिया। (A)इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक उपकरणों में एक पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन कटिंग बोर्ड, संदंश की एक जोड़ी, व्यास में 18 मिमी का ट्रेफिन, एक कस्टम-मेड माइक्रो-बॉयडन चैंबर और एक बायोमटेरियल झिल्ली शामिल है। (ख)बायोमटेरियल झिल्ली से डिस्क को पंच करने के लिए ट्रेफिन का उपयोग करें। (ग)ओ-रिंग को बढ़ते डिवाइस के ऊपरी कक्ष में रखें और फिर उस पर बायोमटेरियल डिस्क बिछाएं । (D)बढ़ते डिवाइस के ऊपरी कक्ष पर निचले कक्ष पेंच। }इकट्ठे हुए माइक्रो बॉयडन चैंबर को 70% इथेनॉल के साथ निष्फल करने की तैयारी है। (एफ) 6-अच्छी तरह की ऊतक संस्कृति प्लेट के कुएं में टिश्यू कल्चर मीडियम में निष्फल माइक्रो बॉयडन चैंबर को विसर्जित करें । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: एक कोलेजन प्रकार मैं झिल्ली के विरोधी पक्षों पर भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल और स्ट्रोमल कोशिकाओं। कोशिकाओं को नाभिक (नीला) की कल्पना करने के लिए ऐक्टिन (लाल) और होचस्ट की कल्पना करने के लिए फालोडिन रोडाइन से दाग दिया गया था। कोलेजन प्रकार मैं झिल्ली दाग नहीं था और इसलिए इन छवियों में दिखाई नहीं देता है जो कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके एकत्र किए गए थे। (A)ऊतक-इंजीनियर निर्माण का कम आवर्धन, क्रॉस सेक्शन व्यू। कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृति का प्रतिनिधित्व करने वाली ऐक्टिन की एक पतली परत झिल्ली की ऊपरी सतह पर दिखाई देती है, और झिल्ली की निचली सतह पर स्ट्रोमल सेल संस्कृति का प्रतिनिधित्व करने वाली ऐक्टिन की एक मोटी परत मौजूद होती है। इस छवि में ब्लू नाभिक नहीं दिखाया गया है। (ख)कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल परत का एन फेस व्यू जिसमें ऐक्टिन और न्यूक्लिकी धुंधला दोनों दिखाया गया है । (ग)कॉर्नियल स्ट्रोमल सेल परत का एन फेस व्यू जिसमें ऐक्टिन और न्यूक्लिकी धुंधला दोनों दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

मानव कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं की स्थापना और विस्तार से जुड़ी एक महत्वपूर्ण तकनीकी चुनौती ईएमटी को संस्कृतियों में होने से रोक रही है। ईएमटी को सेल-टू-सेल संपर्क के नुकसान से कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं में ट्रिगर किया जा सकता है, फिर भी इन कोशिकाओं के लिए अधिकांश सेल संस्कृति प्रोटोकॉल में अलगाव और उपसंस्कृति10के दौरान एकल कोशिकाओं को एंजाइमैटिक विसोशन शामिल है। यहां हम कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए एक वैकल्पिक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो अलगाव और उपसंस्कृति चरणों के दौरान एक दूसरे के साथ संपर्क खोने वाली कोशिकाओं के जोखिम को कम करता है।

कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए हमारी विधि में दाता कॉर्निया से एंडोथेलियम/डेसमेट की झिल्ली के एक्सप्लांट्स को उन परिस्थितियों में ऊतक संस्कृति प्लेटों में रखना शामिल है जो कोशिकाओं को सामूहिक रूप से झिल्ली से और प्लेटों पर माइग्रेट करने की अनुमति देते हैं । सफल होने के लिए, एक्सप्लांट को ऊतक संस्कृति प्लेट के लिए एक तंग लगाव बनाना चाहिए, और संस्कृतियों की स्थापना के बाद कई दिनों तक प्लेट को परेशान न करके इसे सबसे अच्छा हासिल किया जाता है। मनुष्यों से कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों की सफल स्थापना में एक और महत्वपूर्ण कारक दाता की उम्र है। उच्च सफलता दर 30 साल से छोटी उम्र के दानदाताओं से हासिल की जा रही है ।

कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए एक्सप्लांट संस्कृति विधि का उपयोग करने का नुकसान अपेक्षाकृत लंबी अवधि है जो संस्कृतियों की स्थापना और बड़ी संख्या में कोशिकाओं को प्राप्त करने के बीच मौजूद है। तथाकथित ' पील और डाइजेस्ट ' तरीकों में दाता कॉर्निया से एंडोथेलियम को अलग करना और संस्कृति11के लिए कोशिकाओं को जारी करने के लिए एंजाइमों के साथ पचाना शामिल है । इस प्रकार के तरीके एक्सप्लांट्स से स्थापित लोगों की तुलना में शुरू में अधिक कोशिकाओं वाली संस्कृतियों का उत्पादन करेंगे।

कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए हमारी एक्सप्लांट संस्कृति विधि उच्च गुणवत्ता की बहुत छोटी, कॉम्पैक्ट, परिपक्व कोशिकाओं वाली संस्कृतियों का उत्पादन करती है। हालांकि, संस्कृतियों में प्लेट की परिधि की ओर बड़ी, कम आदर्श कोशिकाएं भी होती हैं। बड़ी कोशिकाओं को ट्रिपल के साथ पाचन द्वारा हटाया जा सकता है और यदि वांछित हो तो त्याग दिया जाता है, लेकिन यह उपसंस्कृति के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या को कम करता है। हालांकि, जिन एक्सप्लांट्स ने प्राथमिक कोशिका संस्कृतियों को सफलतापूर्वक शुरू किया है, लगभग हमेशा आगे की कोशिका संस्कृतियों को शुरू करने में सक्षम होते हैं, और बड़ी संख्या में उच्च गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए इस क्षमता का दोहन किया जा सकता है।

कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं के लिए हमारी उपसंस्कृति विधि में Dispase II का उपयोग करना शामिल है ताकि ताजा प्लेटों में स्थानांतरण के लिए ऊतक संस्कृति प्लेट से सेल झुरमुटों को धीरे से उठाया जा सके, और हालांकि यह विधि मार्ग में होने वाली ईएमटी की संभावना को कम करने के लिए डिज़ाइन की गई है कोशिकाओं, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह शून्य करने के लिए जोखिम को कम नहीं करता है।

प्रत्यारोपण प्रयोजनों के लिए ऊतक-इंजीनियर कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल परतें विकसित करना कई समूहों का लक्ष्य रहा है। कोशिकाओं के लिए वाहक के रूप में कई अलग-अलग सामग्रियों का परीक्षण किया गया है और सेल संस्कृति के दौरान संस्कृति प्लेट में सामग्री को घूमने से रोकने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया गया है। अधिकांश तरीकों में सामग्री को किसी भी तरह ऊतक संस्कृति प्लेट की सतह पर लंगर डालना शामिल है, जो केवल झिल्ली की ऊपरी सतह तक सेल विकास को सीमित करता है। हालांकि इन तरीकों का उपयोग ऊतक-इंजीनियर कॉर्नियल एंडोथेलियम की एकल परतों का उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है जो एंडोथेलियम/डेसमेट के झिल्ली ग्राफ्ट (DMEK ग्राफ्ट) के बराबर होगा, उनका उपयोग एंडोथेलियम/डेसेमेट की झिल्ली/स्ट्रोमा ग्राफ्ट (डीएससेक या डीएसएईके ग्राफ्ट) के ऊतक-इंजीनियर समकक्ष का उत्पादन करने के लिए नहीं किया जा सकता है जो वर्तमान में सर्जनों द्वारा उपयोग किए जाते हैं। इसलिए हमने एक झिल्ली बढ़ते उपकरण को विकसित किया है जिसे माइक्रो-बॉयडेन कक्ष कहा जाता है जो कोशिकाओं को एक निलंबित जैव सामग्री झिल्ली की दोनों सतहों पर एक साथ उगाने की अनुमति देता है, और इसका उपयोग कोलेजन प्रकार आई झिल्ली की विपरीत सतहों पर कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं और कॉर्नियल स्ट्रोमल कोशिकाओं से मिलकर ऊतक-इंजीनियर ग्राफ्ट का उत्पादन करने के लिए किया है। इन दोहरे स्तरित ऊतक इंजीनियर ग्राफ्ट संभवतः दाता कॉर्निया-एंडोथेलियम और स्ट्रोमल ऊतक के ग्राफ्ट को डेसमेट की झिल्ली (डीएसईकेक या डीएसएईके ग्राफ्ट) के दोनों ओर प्रतिस्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

संक्षेप में, इस लेख में प्रस्तुत तरीकों को उन लोगों के लिए डिज़ाइन किया गया है जो ऊतक इंजीनियरिंग अध्ययन में उपयोग के लिए उच्च गुणवत्ता की प्राथमिक कॉर्नियल एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करना चाहते हैं। कोमल संस्कृति विधियों का वर्णन किया गया है जो ईएमटी से गुजरने वाली कोशिकाओं के जोखिम को कम करने के लिए डिज़ाइन किए गए हैं और निलंबित जैव सामग्री झिल्ली पर कोशिकाओं को बढ़ाने के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। हमें आशा है कि इन तरीकों ऊतक इंजीनियर कॉर्नियल एंडोथेलियम प्रत्यारोपण के उत्पादन के अपने लक्ष्यों की दिशा में दूसरों की सहायता कर सकते हैं ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

चित्रा 7की तैयारी के दौरान उसकी सहायता के लिए Noémie गैलोरिनी के लिए धन्यवाद। इस काम को ऑस्ट्रेलिया के राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद (परियोजना अनुदान 1099922) द्वारा डीएच को दिए गए एक परियोजना अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, और क्वींसलैंड नेत्र संस्थान फाउंडेशन से प्राप्त अनुपूरक वित्तपोषण द्वारा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Attachment factor Gibco S006100 A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract Gibco 13028014 A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride Merck C5670 Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml Labtek 650.550.050
Chondroitin sulphate LKT Laboratories C2960 This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II Gibco 17105-041 Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol Labtek EA043 100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum GE Healthcare Australia Pty Ltd SH30084.03 This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm Proscitech G401-13 Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS Gibco 14025-092 Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate Merck A8960 Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber CNC Components Pty. Ltd. Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007 Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber Ludowici Sealing Solutions RSB012 Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1 Gibco 51985-034 A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS Gibco 14190-144 Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep Gibco 15140-122 A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish Sarstedt 82.14473.001 Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well Corning Incorporated Costar 3524 A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well Corning Incorporated Costar 3516 A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select Gibco 12563-011 A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene Gibco 15040-066 A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps Labtek BWMF4 Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.

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References

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बायोमटेरियल झिल्ली पर मानव और भेड़ कॉर्नियल एंडोथेलियल सेल परतों का विकास
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Walshe, J., Abdulsalam, N. A. K.,… More

Walshe, J., Abdulsalam, N. A. K., Suzuki, S., Chirila, T. V., Harkin, D. G. Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes. J. Vis. Exp. (156), e60762, doi:10.3791/60762 (2020).

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