Tillväxt av human- och fårhornhinnans endotelcelllager på biomaterialmembran

Summary

Detta protokoll beskriver de kritiska steg som krävs för att upprätta och växa hornhinnans endotelcellkulturer från utväxter av mänsklig eller fårvävnad. En metod för att subkulera hornhinnans endotelceller på membranösa biomaterial presenteras också.

Abstract

Hornhinnans endotelcellkulturer har en tendens att genomgå epitel-till-mesenchymal övergång (EMT) efter förlust av cell-till-cell kontakt. EMT är skadliga för cellerna eftersom det minskar deras förmåga att bilda ett moget och funktionellt lager. Här presenterar vi en metod för att etablera och subkulera mänskliga och får hornhinnans endotelcellkulturer som minimerar förlusten av cell-till-cell-kontakt. Explantor av hornhinnans endotelet/Descemets membran tas från donatorhornhinnor och placeras i vävnadskultur under förhållanden som gör att cellerna kollektivt kan migrera till kulturytan. När en kultur väl har etablerats överförs utväxterna till färska tallrikar för att initiera nya kulturer. Dispase II används för att försiktigt lyfta klumpar av celler från vävnadsodlingsplattor för att subkulera. Hornhinnans endotelcellkulturer som har fastställts med hjälp av detta protokoll är lämpliga för överföring till biomaterialmembran för att producera vävnadskonstruerade celllager för transplantation i djurförsök. En skräddarsydd enhet för att stödja biomaterial membran under vävnadskultur beskrivs och ett exempel på en vävnad-konstruerad transplantat som består av ett lager hornhinnans endotelceller och ett lager av hornhinnans stromal celler på vardera sidan av en kollagen typ I membran presenteras.

Introduction

Hornhinnan är en genomskinlig vävnad som ligger på framsidan av ögat. Den består av tre stora lager: ett epitelskikt på den yttre ytan, ett mittstromalager och ett inre lager som kallas hornhinnans endotelet. Hornhinnans endothelium är ett monolayer av celler som sitter på ett källarmembran som kallas Descemets membran och upprätthåller insynen i hornhinnan genom att reglera mängden vätska som kommer in i stroma från den underliggande vattenhaltiga humor. För mycket vätska i stroma orsakar hornhinnans svullnad, opacitet och synförlust. Endothelium är därför avgörande för att upprätthålla vision.

Hornhinnans endothelium kan bli dysfunktionell av ett antal skäl, inklusive åldrande, sjukdom och skada, och den enda nuvarande behandlingen är transplantationkirurgi. Under denna operation avlägsnas endothelium och Descemets membran från patientens hornhinna och ersätts med ett transplantat av endotelet och Descemets membran som erhållits från en donatorhornhinnan. Många endothelium ympkvistar innehåller också ett tunt lager av stromal vävnad för att hjälpa hantering och fastsättning till värdhornhinnan¹.

Över hela världen är efterfrågan på hornhinnans donatorvävnad för transplantationsoperationer större än det belopp som kan levereras av ögonbanker². Det har därför funnits en drivkraft att utveckla vävnadskonstruerade hornhinnans endotheliumtransplantationer som skulle kunna användas för att lindra detta underskott³. Motiveringen till detta är baserad på det faktum att för närvarande kan endotelet från en enskild hornhinna endast överföras till en enda patient, men om hornhinnans endotelceller först utvidgades och odlas på biomaterial byggnadsställningar i vävnadskultur, kan de användas för att behandla flera patienter.

Stora utmaningar som måste åtgärdas innan vävnadskonstruerade hornhinnans endotheliumtransplantationer blir ett genomförbart alternativ för kirurger är: (1) om fastställande av tekniker för att expandera hornhinnans endotelceller av hög kvalitet och för att producera mogna och funktionella hornhinnans endotelcellslager in vitro och (2) som fastställer tekniker för att odla cellerna på biomaterialbyggnadsställningar för att producera vävnadskonstruerade transplantat som är lika med, eller bättre än, givaren hornhinna-härledda ympkvistar som för närvarande används.

Hornhinnans endotelceller har en mycket låg proliferativ potential in vivo men kan stimuleras att dela in vitro⁴. Ändå har de en stark tendens att genomgå in vitro epithelial-to-mesenchymal övergång (EMT), vilket minskar deras förmåga att bilda en mogen, funktionell endotelskikt. Kända utlösare för EMT i hornhinnans endotelceller inkluderar exponering för vissa tillväxtfaktorer och förlust av cell-till-cell kontakt⁵. Det är alltså nästan oundvikligt att hornhinnans endotelcellkulturer som enzymatiskt separeras under subkultur kommer att genomgå förändringar i samband med EMT. Här presenterar vi en cellodlingsmetod för mänskliga eller får hornhinnans endotelceller som är utformade för att minimera störningar av cell-till-cell-kontakter under isolering, expansion och subkultur stadier, för att minska risken för EMT. Dessutom visar vi hur vävnadskonstruerade transplantat som liknar givaren hornhinnan-härledda endothelium/ Descemets membran/stromal vävnadstransplantat kan produceras genom odling av odlade celllager på båda sidor av ett biomaterialmembran i en skräddarsydd monteringsanordning.

Protocol

Mänskliga hornhinnor med givarens samtycke för forskning erhölls från Queensland Eye Bank och används med etik godkännande från Metro South Hospital and Health Service’s Human Research Ethics Committee (HREC/07/QPAH/048). Får hornhinnor erhölls från avlivade djur vid Herston Medical Research Facility vid University of Queensland enligt en vävnad dela avtal. 1. Beredning av dissekeringsverktyg Sterilisera två par nummer 4 urmakare pincett genom att antingen blötlägga dem…

Representative Results

Metoden för att isolera och expandera hornhinnans endotelceller från mänskliga eller fårhornär sammanfattas i figur 1 och figur 2. De flesta utväxter som härrör från hornhinnorna från 1 till 2-åriga får eller mänskliga donatorer under 30 år kommer att fästa vid Attachment Factor-belagda vävnadsodlingsplattor inom en vecka, men det är inte ovanligt att finna att upp till en tredjedel av explantorna inte fäster inom denna tid. Dessa “flytande” ut…

Discussion

En betydande teknisk utmaning i samband med att upprätta och expandera mänskliga hornhinnans endotelceller hindrar EMT från att inträffa i kulturerna. EMT kan utlösas i hornhinnans endotelceller genom förlust av cell-till-cell kontakt, men de flesta cell kultur protokoll för dessa celler innebär enzymatisk dissociation till enstaka celler under isolering och subkultur¹⁰. Här presenterar vi ett alternativt cellkulturprotokoll för hornhinnans endotelceller som minimerar risken för att cel…

Materials

Attachment factor	Gibco	S006100	A 1X sterile solution containing gelatin that is used to coat tissue culture surfaces. Store at 4 °C.
Bovine pituitary extract	Gibco	13028014	A single vial contains 25 mg. Freeze in aliquots.
Calcium chloride	Merck	C5670	Dissolve in HBSS to make a 1 mM stock solution. Filter sterilise.
Centrifuge tube, 50 ml	Labtek	650.550.050
Chondroitin sulphate	LKT Laboratories	C2960	This is bovine chondroitin sulphate. Dissolve in HBSS to make a 0.08 g/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Dispase II	Gibco	17105-041	Dissolve in DPBS to make a 2 mg/mL stock solution. Filter sterilise and freeze in aliquots.
Ethanol	Labtek	EA043	100% undenatured ethanol should be diluted to 70% in deionised water for sterilising instruments and surfaces.
Foetal bovine serum	GE Healthcare Australia Pty Ltd	SH30084.03	This is a HyClone brand of foetal bovine serum.
Coverglass No. 1, Ø 13 mm	Proscitech	G401-13	Place sterilised cover slips into 24-well plates for tissue culture.
HBSS	Gibco	14025-092	Hank's balanced salt solution, 1X, containing calcium chloride and magnesium chloride.
L-ascorbic acid 2-phosphate	Merck	A8960	Dissolve in HBSS to make a 150 mM stock solution. Filter sterilise.
Micro-Boyden chamber	CNC Components Pty. Ltd.	Upper ring: QUT-0002-0006, Base ring: QUT-0002-0007	Both components are made from polytetrafluoroethelyne (PTFE).
O-ring for micro-Boyden chamber	Ludowici Sealing Solutions	RSB012	Composed of silicon rubber.
Opti-MEM 1 (1X) + GlutaMAX-1	Gibco	51985-034	A reduced serum medium containing glutamine.
DPBS	Gibco	14190-144	Dulbecco's phosphate buffered saline, 1X, without calcium chloride and magnesium chloride.
Pen Strep	Gibco	15140-122	A 100X antibiotic solution containing 10,000 Units/mL penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin.
Petri dish	Sarstedt	82.14473.001	Sterile Petri dish, 92 X 16 mm, for tissue dissections.
Tissue culture plate, 24 well	Corning Incorporated	Costar 3524	A plate containing 24 wells, each with a surface area of 2 cm2.
Tissue culture plate, 6 well	Corning Incorporated	Costar 3516	A plate containing 6 wells, each with a surface area of 9 cm2.
TrypLE Select	Gibco	12563-011	A 1X enzyme solution for dissociating cells.
Versene	Gibco	15040-066	A 1X EDTA solution for dissociating cells.
Watchmaker forceps	Labtek	BWMF4	Number 4 watchmaker forceps work well for removing strips of endothelium/Descemet's membrane from corneas.