Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Karakterisere enkeltmolekylkonformasjonsendringer under skjærstrøm med fluorescensmikroskopi

Published: January 25, 2020 doi: 10.3791/60784
Automatic Translation
1, *2, *3, 3, 1,2, 1,4
1Department of Bioengineering, Lehigh University, 2Department of Materials Science and Engineering, Lehigh University, 3Department of Chemistry, Lehigh University, 4Department of Mechanical Engineering and Mechanics, Lehigh University
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer en protokoll for å immobilisere enkeltmakromolekyler i mikrofluidiske enheter og kvantifisere endringer i deres konformasjoner under skjærstrøm. Denne protokollen er nyttig for å karakterisere biomekaniske og funksjonelle egenskaper av biomolekyler som proteiner og DNA i et strømningsmiljø.

Abstract

Enkeltmolekylatferd under mekanisk perturbasjon har blitt karakterisert mye for å forstå mange biologiske prosesser. Metoder som atomkraftmikroskopi har imidlertid begrenset tidsoppløsning, mens Förster resonansenergioverføring (FRET) bare tillater konformasjoner å bli utsatt. Fluorescensmikroskopi, derimot, tillater sanntid in situ visualisering av enkeltmolekyler under ulike strømningsforhold. Vår protokoll beskriver trinnene for å fange konformasjonelle endringer av enkeltbiomolekyler under forskjellige skjærstrømningsmiljøer ved hjelp av fluorescensmikroskopi. Skjærstrømmen opprettes inne i mikrofluidiske kanaler og styres av en sprøytepumpe. Som demonstrasjoner av metoden er von Willebrand-faktor (VWF) og lambda DNA merket med biotin og fluorophore og deretter immobilisert på kanaloverflaten. Deres konformasjoner overvåkes kontinuerlig under variabel skjærstrøm ved hjelp av total intern refleksjon (TIRF) og konfokal fluorescensmikroskopi. Den reversible unraveling dynamikken i VWF er nyttig for å forstå hvordan funksjonen er regulert i menneskelig blod, mens konformasjonen av lambda DNA gir innsikt i biofysikken til makromolekyler. Protokollen kan også brukes mye for å studere atferden til polymerer, spesielt biopolymerer, i varierende strømningsforhold og for å undersøke revologien til komplekse væsker.

Introduction

Mekanismer for hvordan biomolekyler reagerer på miljømessige stimuli har blitt studert mye. I et strømningsmiljø spesielt regulerer skjær- og langeringskrefter konformasjonsendringene og potensielt biomolekylenes funksjon. Typiske eksempler inkluderer skjær-indusert unraveling av lambda DNA og von Willebrand faktor (VWF). Lambda DNA har blitt brukt som et verktøy for å forstå konformasjonsdynamikk av individuelle, fleksible polymerkjeder og revologien til polymerløsninger1,2,3,4. VWF er en naturlig strømningssensor som samler blodplater på sårsteder i blodårene med unormal skjærfrekvens og strømningsmønstre. Unraveling av VWF er avgjørende for å aktivere bindingen av blodplater til A1-domenet og kollagenbinding til A3-domenet. I tillegg, høy skjær-indusert A2 domene utfoldelse tillater spaltning av VWF, som regulerer sin molekylære vektfordeling i sirkulasjon5,6. Dermed kan direkte visualisering av hvordan disse molekylene oppfører seg under strømning i stor grad forbedre vår grunnleggende forståelse av deres biomekanikk og funksjon, noe som igjen kan muliggjøre nye diagnostiske og terapeutiske applikasjoner.

Typiske metoder for å karakterisere enkeltmolekylkonformasjoner inkluderer optiske/magnetiske pinsett, atomkraftmikroskopi (AFM) og enkeltmolekyl Förster resonansenergioverføring (FRET)7. Enkeltmolekylstyrkespektroskopi er et kraftig verktøy for å undersøke kraften og bevegelsen forbundet med konformasjonsendringene av biomolekyler. Det mangler imidlertid evnen til å kartlegge generelle molekylære konformasjoner8. AFM er i stand til å bildebehandling med høy romlig oppløsning, men er begrenset i temporal oppløsning9,10. I tillegg kan kontakt mellom spissen og prøven forvirre responsen forårsaket av flyt. Andre metoder som FRET og nanoporeanalyse bestemmer enkeltmolekylproteinfolding og utfoldelse ser ut basert på påvisning av intramolekylær avstand og ekskluderte volumer. Imidlertid er disse metodene fortsatt i sin barndom og begrenset i sin direkte observasjon av enkeltmolekylkonformasjoner11,12,13,14.

På den annen side har direkte observere makromolekyler med høy temporal og romlig oppløsning under fluorescensmikroskopi forbedret vår forståelse av enkeltmolekyldynamikk i mange biologiske prosesser15,16. For eksempel oppnådde Fu et al. nylig samtidig visualisering av VWF forlengelse og blodplatereseptorbinding for første gang. I sitt arbeid ble VWF-molekyler immobilisert på overflaten av en mikrofluidisk kanal gjennom biotin-streptavidin interaksjoner og avbildet under total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi ved varierende skjærstrømningsmiljøer17. Ved å bruke en lignende metode som Fus, viser vi her at konformasjoner av VWF og lambda DNA kan observeres direkte under både TIRF og konfokal fluorescensmikroskopi. Som vist i figur 1brukes mikrofluidiske enheter til å opprette og kontrollere skjærstrømning, og biomolekyler er immobilisert på kanaloverflaten. Ved bruk av varierende skjærhastigheter registreres konformasjoner av det samme molekylet for å måle forlengelseslengden, også vist i figur 1. Metoden kan brukes mye for å utforske andre polymeratferd under komplekse strømningsmiljøer for både revologiske og biologiske studier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjøre VWF

  1. Rekonstituere humant plasma VWF for å forberede det på merkingsreaksjonene. Tilsett 100 μL deionisert (DI) vann til 100 μg lyofilisert VWF for å lage en 1 mg/ml VWF-lagerløsning.
  2. Dialyze VWF lagerløsning for å fjerne overflødig glycin, og dermed øke biotin og fluorophore merking effektivitet.
    1. Overfør 50 μL VWF-lageroppløsning til en 0,1 ml dialyseenhet med en 10 000 kutting i molekylvekt og forsegling med en hette. Oppbevar gjenværende lageroppløsning ved -20 °C. VWF-aksjen vil være stabil i opptil 1 år ved -20 °C.
    2. Kjør dialyse i 500 ml steril fosfatbufret saltvann (PBS) (0,01 M disodium fosfat, 0,0018 monokaliumfosfat, 0,0027 M kaliumklorid, 0,137 M natriumklorid, pH 7,4 ved 25 °C) i 1 time ved 4 °C ved langsom omrøring. Gjenta dialyse i en ekstra time med 500 ml fersk PBS.
  3. Start biotinmerkingsreaksjon. Forbered en 2 mM-løsning av NHS-PEG4-biotin ved å oppløse faststoffet i DI-vann umiddelbart før reaksjonen. Å tillate NHS-PEG4-biotin å forbli i vann i lengre tid vil føre til at NHS-ester gruppen å hydrolysere, og dermed redusere merking effektivitet.
    1. Tilsett 2,5 μL 2 mM NHS-PEG4-biotin til dialyseenheten som inneholder VWF-lagerløsningen. Dette vil resultere i en 20-ganger molar overskudd av biotin sammenlignet med VWF monomers. Primær aminer av VWF vil reagere med NHS-ester grupper, og dermed covalently binding til PEG4-biotin grupper via amidlinker.
    2. Plasser dialyseenheten inne i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Forsegle dialyseenheten med tilsvarende hette. Fest rørdialyseenheten med Parafilm. Hold deg oppreist og la ved romtemperatur i 40 min.
  4. Begynn fluoropformerkingsreaksjonen. Forbered en 2,8 mM løsning av Alexa 488 tetrafluorophenyl-ester (TFP-ester) fluorescerende farge (eksitasjonmax = 498 nm, utslippmax = 519 nm) ved å oppløse fluorophore fast i DI vann. Gjør dette umiddelbart før reaksjonen for å hindre at TFP-estergruppen hydrolyserer.
    1. Tilsett 2,9 μL av 2,8 mM 488 fluoropfor til dialyseenheten. Dette vil resultere i en 34 ganger molar overskudd av fluorophore sammenlignet med VWF monomers. Gjenværende primære aminer av VWF vil reagere med TFP-ester grupper, og dermed covalent binding til fluorophores via amidlinker.
    2. Tilsett 2,0 μL 1 M natriumbikarbonat (oppløst i DI-vann) til dialyseenheten. Dette justerer pH av reaksjonen nærmere 8.0, noe som øker effektiviteten av TFP-ester og primære amin reaksjon.
    3. Fest dialyseenheten i et mikrocentrifugerør akkurat som i trinn 1.3.2. Oppbevares i mørket for å forhindre fotobleking og la ved romtemperatur stå i 1 time og 30 min.
  5. Plasser dialyseenheten i 900 ml 1x steril PBS og dialyze over natten ved 4 °C. Dette vil gi ca. 70 μL merket VWF i en konsentrasjon på 0,71 mg/ml eller 2,84 μM (monomerkonsentrasjon).
  6. Overfør merket VWF til et mikrocentrifugerør. Dekk røret med aluminiumsfolie og beskytt mot lys. Oppbevares ved 4 °C. For langtidslagring tilsett antimikrobielle midler natriumazid til en endelig konsentrasjon på 0,02 % (m/v).
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.

2. Klargjøre Lambda DNA

  1. Biotinylate lineær lambda DNA ved å fylle sine sammenhengende endesteder (cos nettsteder) med biotin-14-dCTP nucleotides i henhold til standard protokoller, gjentatt her i trinn 2.118. Fyll ut resten av cos-områdene med dATP, dTTP og dGTP-nukleotider.
    1. Forbered 1 mM-løsninger av dATP, dTTP, dGTP og biotin-14-dCTP i en 10x reaksjonsbuffer (500 mM natriumklorid, 100 mM Tris hydroklorid, 100 mM magnesiumklorid, 10 mM ditiothreitol, pH 7,9 ved 25 °C).
    2. Plasser 48 μL 500 ng/μL lambda DNA i et PCR-rør og varme i 5 min ved 65 °C. Cos-stedene for sirkulærlambda-DNA vil skilles under varme, linearisere molekylet og gjøre enstrandede overheng klare for biotinylation. Umiddelbart etter, plasser på is for å hindre at cos-steder re-annealing.
    3. Tilsett 5 μL 1 mM dATP, dTTP og dGTP og 4 μL 1 mM biotin-14-dCTP til lambda DNA. Tilsett også 2,5 μL 5 U/μL Klenow Fragment (3'à5' exo-) for å katalysere DNA-syntesen.
    4. Inkuber reaksjonsblandingen i 1 time ved 37 °C.
    5. Tilsett 1,2 μL på 0,5 M EDTA. Varm deretter reaksjonsblandingen i 5 min ved 70 °C. Dette vil deaktivere Klenow Fragment og biotinylation reaksjon.
  2. Fjern overflødige nukleotider fra lambda DNA ved hjelp av en spinnkolonne som kan holde 10-70 μL og har en 6000 molekylvekt cut-off.
    1. Plasser kolonnen inne i et 2 ml mikrocentrifugerør. Sentrifuger søylen og røret ved 1000 x g i 2 min. Kast gjennomstrømningen som samler seg i røret.
    2. Erstatt kolonnebufferen med en 1x-løsning av samme reaksjonsbuffer fra trinn 2.1.1. Gjør dette ved å legge til 500 μL 1x buffer i kolonnen. Sentrifuge i 1 min ved 1000 x g. Kast gjennomstrømningen. Gjenta disse 2 ganger til, slik at totalt 1500 μL er lagt til i kolonnen.
    3. Plasser kolonnen i et mikrocentrifugerør på 1,5 ml. Legg løsningen forsiktig fra trinn 2.1.5 til det øverste laget i kolonnen. Sentrifuge i 4 min ved 1000 x g.
    4. Samle gjennomstrømningen (40-70 μL) fra mikrocentrifugerøret og plasser i et PCR-rør. Dette inneholder renset, biotinylated lambda DNA.
  3. Label lambda DNA med fluorescerende YOYO-1 far (eksitasjonmax = 490 nm, utslippmax = 509 nm) i henhold til standard protokoller, gjentatt her i trinn 2.3.120.
    1. Forbered en løsning av YOYO-1-dye og lambda DNA med et hell til basepar molar forhold på 1:10. Anta at ingen DNA gikk tapt i rensetrinnet for å beregne baseparkonsentrasjonen av lambda DNA. Full lengde lambda DNA har 48 502 base par.
      MERK: Hvis det for eksempel ble gjenopprettet 50 μL oppløsning fra trinn 2,2,4, tilsett 7,4 μL på 500 μM YOYO-1-fars.
    2. Varm oppløsningen i 2 timer ved 50 °C i mørket for å fullføre reaksjonen.
    3. Dekk røret med aluminiumsfolie og beskytt mot lys. Oppbevares ved 4 °C. Løsningen er nå klar til å injiseres i mikrofluidiske enheter.
      MERK: Protokollen kan settes på pause her.

3. Opprette mikrofluidiske kanalformer i silisiumwafer

  1. Bruk fotolitografi til å lage mikrofluidiske kanaler med passende dimensjoner (Figur 2) på en master silisium wafer i henhold til standard protokoller19.

4. Tilberedning av polydimetylsiloxan (PDMS) mikrofluidisk enhet

  1. Tilsett 5 deler silikon elastomer base til 1 del herding middel (av masse) i en veiebåt. Rør innholdet grundig i 1 min for å lage forhåndsherdet PDMS-løsning.
  2. Plasser master silisium wafer i en plast Petri parabolen. Hell PDMS-løsningen over waferen for å lage et 5 mm lag. Dekk parabolen og la den stå i en utsiccator under vakuum i 1 t for å fjerne luftbobler.
  3. Inkuberdekket Petriskål ved 60 °C over natten for å kurere PDMS til et fleksibelt fast stoff. Herding vil resultere i mikrofluidiske kanaler støpt inn i PDMS på PDMS-wafer-grensesnittet.
  4. Skjær 20 x 10 mm rektangler inn i PDMS, rundt hver mikrofluidiske kanal, ved hjelp av en barberhøvel. Fjern de rektangulære PDMS-blokkene med pinsett.
  5. Bruk en 25 G stump endepinne med slipte kanter for å slå et hull 0,5 mm i diameter i den ene enden av kanalen, og pass på at hullet går helt gjennom PDMS-blokken (figur 2). Bruk en tynn nål til å slå ut PDMS fra hullet. Gjenta dette i den andre enden av kanalen. Dette vil skape et innløp og utløp for flyt gjennom kanalen.
  6. Rengjør overflaten av PDMS-blokken med vinyl cleanroom tape. Blås komprimert nitrogengass over en 1 1/2, 22 x 50 mm dekkslip for å fjerne rusk.
  7. Plasser PDMS-blokken med kanalsiden opp og dekselet glir inn i kammeret til en plasmabindingsmaskin. Start behandlingen.
  8. Når behandlingen er fullført, plasserer du raskt PDMS-blokken på en dekkslip slik at kanalen er i kontakt med slip. Påfør trykk langs kantene på blokken. Plasser dekseletslip-PDMS-enheten på en kokeplate ved 115 °C i 15 min for å forsterke den permanente bindingen.
  9. Sett 10 cm lang, 0,25 mm innerdiameter slange inn i utløpshullet på toppen av PDMS-blokken. Dette gjør at væske enkelt kan strømme ut av kanalen. Enheten er nå fullført.

5. Behandling av overflate av mikrofluidisk enhet

  1. Injiser <10 μL av 10 μg/ml biotinylated storfe serum albumin (BSA-biotin) oppløst i sterile 1x PBS i inntaket av mikrofluidisk enhet for VWF eksperimenter. Injiser <10 μL av 1 mg/ml BSA-biotin for lambda DNA-eksperimenter. Hold tilbake noen mikroliter BSA-biotin i pipettespissen etter injeksjon og la spissen forbli innebygd i innløpet.
    1. Hold alltid en dråpe DI vann rundt spissen. Dette vil hindre luftbobler fra å komme inn i kanalen. Påfør denne teknikken hver gang en ny løsning injiseres i kanalen.
    2. La BSA-biotin inkubere i enheten i 2 timer. BSA vil ikke spesifikt binde seg til dekkslipoverflaten (figur 3A).
  2. Fjern pipettespissen. Injiser <10 μL av kasein blokkeringsoppløsning i kanalen og la den inkubere i 30 min. Kaseinvil blokkere eventuelle gratis områder, redusere uspesifikk binding av biomolekyler til overflaten (Figur 3B).
  3. Fjern spissen og injiser <10 μL av 10 μg/ml streptavidin oppløst i sterile 1x PBS i kanalen for VWF-eksperimenter. Bruk 100 μg/ml streptavidin til lambda DNA-eksperimenter. Inkuber i 10 min. Streptavidinvil binde seg til biotingruppene i BSA-biotin (figur 3C).
  4. Fjern spissen og injiser <10 μL 1x vaskemiddeloppløsning (0,05 % Tween 20 i PBS) inn i kanalen for å vaske bort overflødig streptavidin.
  5. Fjern spissen og injiser <10 μL av enten 28,4 nM VWF fortynnet i kaseinoppløsning eller lambda DNA fra trinn 2.3.3. Inkuber VWF i 3 min. Inkubatlambda DNA i 45 min (figur 3D).
  6. Fjern spissen og injiser <10 μL 5 mM fri biotin fortynnet i tilfelleoppløsning. Gratis biotin vil blokkere overflødige streptavidin bindingssteder på kanaloverflaten (Figur 3E).

6. Visualisere VWF og Lambda DNA under fluorescens mikroskopi

  1. Forbered 1 ml kaseinblokkeringsløsning med 2,2 mM protocatechuic acid og 37 nM protocatechuate-3,4-dioxygenase (for å minimere fotobleking). Legg i en sprøyte og fest i en sprøytepumpe. Ta 30 cm lang, 0,25 mm slange med indre diameter og fest den ene enden til sprøytenålen. Strøm i løsningen for å fjerne luftbobler. Fest den andre enden av røret til inntaket av mikrofluidisk enhet. Det anbefales å gjøre dette 3 minutter etter trinn 5.6.
  2. Velg det høyeste forstørrelsesmålet (dvs. 60-100X) av en total intern refleksjon (TIRF) eller konfokal fluorescensmikroskop. Legg til en dråpe nedsenking olje på sitt mål om nødvendig. Plasser den mikrofluidiske enheten på mikroskopstadiet slik at dekksslipen er i flukt med målet.
  3. Start brightfield mikroskopi. Juster fokus slik at alle funksjoner, som rusk og bobler, er synlige. Juster deretter scenen i X- og Y-retningen til kanten av den mikrofluidiske kanalen er synlig og deler rammen.
  4. Bytt til 488-kanalen (FITC). Juster Z-nivå og TIRF vinkel etter behov til individuelle grønne, kulemolekyler kan skilles. Dette er enten VWF eller lambda DNA molekyler.
  5. Juster eksponeringstid og laserintensitet for å visualisere fluorescerende molekyler uten fotobleking dem for fort. Juster kontrasten for å visualisere molekyler tydeligere.
  6. Startstrøm fra sprøytepumpen slik at kaseinblokkeringsløsningen strømmer inn i kanalen og ut av uttaket. Gjør dette nøyaktig 5 minutter etter trinn 5.6. Stopp og start flyten for å observere endringene i konformasjonen av molekyler. Når du bruker strømning, bruk priser mellom 5000 og 30 000 μL/t. Gjenta dette i ulike områder av mikrofluidisk enhet. Fortsett denne prosessen for å finne molekyler som kan utvide og slappe av på flere sykluser for å stoppe og starte flyten.
  7. Legg merke til hvor lang tid det tar for molekyler å nå maksimal forlengelse og helt slappe av i globules. Ta opp videoer av den kontinuerlige oppførselen til molekyler under skjærstrøm, velg den beste eksponeringstiden, eksponeringsfrekvensen og videovarigheten som vil fange hele spekteret av forlengelsesatferd og minimere fotobleking.
  8. Lagre videoene som . AVI-filer med en vekter.
    MERK: Protokollen kan settes på pause her.

7. Bildeanalyse av konformasjonelle endringer

  1. Beregn veggskjærhastigheten (Symbol 1) som brukes på makromolekyler ved hjelp av strømningshastigheten (Q) og høyden (h) og bredde (w) på den rektangulære mikrofluidiske kanalen. Bruk følgende formel til å gjøre dette:
    Equation 1
  2. Bestem lengden på et biomolekyl under ulike skjærhastigheter ved hjelp av en tilpasset MATLAB-kode (se Supplerende filer). Opprett en videoanalyse med tittelen videoer som inneholder følgende MATLAB-koder: main.m, save_each_frame.m, get_length.m og get_length.fig. Opprett en undermappe i videoanalyse med tittelen videoer og legg til . AVI-filer som skal analyseres i den.
  3. Åpne main.m ved hjelp av MATLAB 2019a og kjør koden. Skriv inn navnet på videofilen som skal analyseres i kommandovinduet under Skriv inn datafilen for å analysere:.
  4. I det åpnede grafiske brukergrensesnittet (GUI) angir du terskel (tekst i boksen øverst til høyre i vinduet) til 20 og klikker på Angi terskelknapp for å bekrefte.
  5. Bruk datamarkøren i den øverste verktøylinjen i vinduet til å velge én piksel hvor som helst på skalalinjen. Klikk Startpunkt i Skalabar-delen til høyre i vinduet. Posisjonen (x,y) til den valgte pikselen vises til høyre for knappen. Klikk på Pikselstørrelse (μm)-knappen. Pikselstørrelsen må bare måles én gang i hver video.
  6. Velg hvilken som helst piksel på molekylet av interesse. Klikk på Startpunkt i VWF-delen. Når plasseringen av den valgte pikselen vises på tekstboksen til høyre, klikker du på venstre ende, Høyre ende og Strenglengde for å få den molekylære lengden i bildet.
    MERK: Dette trinnet kan brukes til å analysere de konformasjonelle endringene av etbiomolekyl, til tross for at koden har en bestemt seksjon kalt VWF.
  7. Dobbeltsjekk venstre og høyre ende av molekylet. Zoom inn og bruk datamarkøren til å kontrollere pikselposisjonen til interesse. Velg pikselen manuelt som en slutt og beregnlengden (i piksler) på nytt når det er nødvendig.
  8. Registrer pikselstørrelsen i μm og strenglengde i pikselnummer i et Excel-ark og beregn strenglengden i μm.
  9. Gjenta trinnene ovenfor for hvert bilde. Bruk Siste, Neste-knappen nederst til høyre i GUI-en for å bytte mellom bilder i samme videofil. Klikk på Lukk for å lukke GUI-vinduet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Å observere den dynamiske oppførselen til biomolekyler som VWF og lambda DNA er svært avhengig av å optimalisere bindingen til enhetsoverflaten. Inkubering av overflatebehandlinger for de anbefalte tidene i mikrofluidisk enhet er avgjørende for å oppnå binding med noen forankringspunkter, slik at molekyler fritt kan utvide og slappe av ved endring av strømning. Hvis proteinene eller DNA-et er bundet for sterkt med flere koblinger, vil de enten strekke seg til begrensede lengder eller ikke strekke seg i det hele tatt. Dette skjer spesielt med VWF når det forblir uten strøm på enhetens overflate i mer enn 3 min før gratis biotinblokkering. Jo lengre VWF forblir på overflaten stillestående, jo mer VWF biotin grupper binde seg til overflaten streptavidin grupper og mindre fleksibilitet molekylet må rakne. Hvis molekyler er bundet for svakt, derimot, vil de løsne ved strømmen og forsvinne fra visningen. Dette kan oppstå hvis VWF eller lambda DNA er inkubert for kort perioder, forårsaker for få biotin-streptavidin interaksjoner å danne. Molekyler kan også bryte fri når ekstremt høye skjærhastigheter (> 200.000 s-1)påføres, noe som svekker biotin-streptavidininteraksjonene.

Et ideelt molekyl binder seg i en slik grad at det kan rakne og slappe av på flere sykluser for å stoppe og starte flyten. Fleksibiliteten til et molekyl for å endre konformasjon som dette er ofte demonstrert av sin evne til å strekke seg til økende lengder som høyere skjærhastigheter påføres innenfor en rekke økende flyt. Bilder av VWF innhentet med TIRF mikroskopi demonstrere dette forholdet i Video 1. Utvidelsen versus skjærhastighetskurven til det samme VWF-molekylet i figur 4 fanger nøyaktig den skjærinduserte oppførselen til et VWF-molekyl og er nyttig for å karakterisere proteinets biomekaniske egenskaper. Bilder av lambda DNA oppnådd med konfokal fluorescens mikroskopi viser tilsvarende økt forlengelse ved høyere skjærhastigheter og gradvis avslapning over 2 min, som er fanget i Video 2 og Video 3. Rekylereegenskapene til lambda DNA etter stoppet flyt er også grafisk representert i figur 5.

Figure 1
Figur 1: Skjemaer av enkeltmolekylflyteksperiment i mikrofluidisk kanal under fluorescensmikroskopi. Kanaloverflaten er belagt med BSA-biotin og blokkert med kasein. Streptavidin er bundet med biotin på kanaloverflaten og også biotinylated VWF / lambda DNA å immobilisere enkeltmolekyler på overflaten. Etter hvert som skjærhastigheten øker fra A til C,strekkes molekylet fra en foldet tilstand til en langstrakt tilstand langs strømningsretningen fra venstre til høyre. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Mikrofluidiske kanaldimensjoner. Formen og strukturen til PDMS mikrofluidiske enheten vises sammen med kanaldimensjonene. Kanalen er 50 μm i høyde og varierer fra 0,1 til 1,0 mm i bredde. Innsnevringregionen midt på kanalen er 0,7 mm lang. Inntaket og uttaket er 0,5144 mm (25 G) i diameter. Strømningsretningen er fra venstre til høyre. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Overflatebehandlingstrinn for immobilisering med ett molekyl. Alle trinnene skjer ved romtemperatur. (A). BSA-biotin er belagt på overflateni 2 timer . Casein injiseres i kanalen i 30 min for å blokkere overflaten. (C). Streptavidin inkuberes i kanalen i 10 min for å binde med BSA-biotin. (D). Etter å ha vasket bort overflødige molekyler i de tidligere trinnene, injiseres fluorophore og biotin merket VWF/lambda DNA inn i kanalen og immobiliseres gjennom binding med streptavidin. (E). Fri biotin strømmes inn, blokkerer ekstra streptavidin bindingssteder for å minimere interferens med molekylet under konformasjonelle endringer. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Forlengelsesvirkemåte for VWF under skjærstrømning. Molekylet rakner reversibelt med 7 forskjellige skjærhastigheter: 0 s-1, 33 333 s-1, 66 667 s-1, 100 000 s-1, 133 333 s-1, 166 667 s-1 og 200.000 s-1. Lengden på det strukket molekylet øker fra 0,52 μm ved null skjærhastighet til 3,44 μm ved 200.000 s-1 skjærhastighet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Avslapningsatferd av lambda DNA etter skjærstrømning stopper. Flow med 33 000 s-1 og 66 667 s-1 skjærhastigheter påføres fra 0 til 30 s til samme molekyl. Avslapning er registrert fra 30 s til 150 s. Ved 66 667 s-1 skjærhastighet, forlenger DNA-molekylet til 15,00 μm og slapper tilbake til 5,83 μm etter at strømmen er stoppet i 2 min. Ved 33 333 s-1 skjærhastighet strekker molekylet seg bare til 8,75 μm og er 3,33 μm i lengde etter 2 min avslapning. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

Video 1
Video 1: Reversibel unraveling av VWF under økende skjærhastigheter ved hjelp av total intern refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi. Molekylet i midten av synet rakner reversibelt til forskjellig lengde ved skjærhastigheter 33 333 s-1, 66 667 s-1, 100.000 s-1 og 133 333 s-1. En sprøytepumpe brukes til å kontrollere strømningshastigheten som skjærhastigheter beregnes fra. Strømningsretningen er fra venstre til høyre. Bilder tas med 15 s intervaller for å tillate fullstendig avslapning og forlengelseprosesser. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 2
Video 2: Avslapning av lambda DNA etter 33 333 s-1 skjærhastighet. Bilder tas under konfokal fluorescens mikroskopi. Lambda DNA er strukket under 33 333 s-1 skjær flyt og avslappet tilbake til en foldet tilstand etter at strømmen er stoppet på 30 s. Varighet av avslapning er 2 min. Flow retning er fra venstre til høyre. Bilder tas med 30 s intervaller i mellom. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 3
Video 3: Avslapning av lambda DNA etter 66 667 s-1 skjærhastighet. Innstillingene er identiske med innstillingene i Video 2, med unntak av den første skjærhastigheten. Vennligst klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Tilleggfiler: MATLAB-koder. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For å oppnå data av høy kvalitet av enkeltmolekylkonformasjonsendringer ved hjelp av fluorescensmikroskopi som beskrevet i denne metoden, er det avgjørende å inkubere molekylet i riktig tid, minimere sine uspesifikke interaksjoner med overflaten og etablere mikroskopinnstillinger som reduserer fotobleking. Molekylets evne til fritt å endre konformasjoner er relatert til antall biotin-streptavidin interaksjoner dannet mellom molekylet og overflaten. Som nevnt tidligere, må dette kontrolleres ved å inkubere molekylet uten strøm for riktig tid. I tillegg kan protein eller DNA ikke-spesifikt binde seg til dekkslip hvis dekkslip ikke er blokkert effektivt. Uten den anbefalte blokkeringsløsningen kan molekyler festes til glasset uspesifikt og ikke reagere på noen strømningshastighet som påføres. Bruk av kaseinblokken under tidlig overflatebehandling og opprettholde rens tilstedeværelse under strømning er avgjørende for å redusere disse ikke-spesifikke interaksjonene. Til slutt, fange den kontinuerlige, dynamiske oppførselen til et enkelt molekyl krever hyppig fluoropfor spenning under bildeopptak. Dette kan føre til rask fotobleking hvis laserintensitet, eksponeringstid og eksponeringsfrekvens er for høy. Det er derfor nødvendig å justere disse innstillingene i tandem og strategise hvordan å redusere sine verdier uten å gå på akkord med tid eller bildeoppløsning av dataene.

Hvis forlengelse og avslapning av molekylet ikke observeres, bør ytterligere trinn følges. Inkuber molekylet i enheten i lengre og kortere tider enn det som anbefales i protokollen. For hver gang som testes, varierer BSA-biotin og streptavidin konsentrasjoner med faktorer på 10. Disse testene kan være nødvendig for å optimalisere antall biotin-streptavidin forankringspunkter dannet mellom molekylet og overflaten. For eksempel, hvis biotinmerkingstettheten er svært høy, kan det være nødvendig med kortere inkubasjonstid og lavere BSA-biotin- og streptavidinkonsentrasjoner. For ytterligere å forbedre eksperimentets suksess, kan du skanne hele mikrofluidisk enhet for molekyler som reversibel rakne. Overflaten kan ikke behandles jevnt med streptavidin eller kaseinblokk, noe som forårsaker molekyler i visse områder å ha større rakne responsenn andre.

Denne metoden er begrenset av mangel på informasjon om størrelsen og internettteringspunktene i molekylet, vanskeligheten med å produsere 0 s-1 skjærhastighet og den optiske oppløsningen av fluorescensmikroskoper. Tidligere arbeid har vist en stor variasjon i den rakne oppførselen til VWF, potensielt forklart av den brede fordelingen i antall og plassering av biotin-streptavidin tether punkter og molekylvekten av hvert VWF molekyl18. For øyeblikket kan ikke metoden vi presenterer definere tether-punkter og molekylær størrelse. Brownian dynamikk simuleringer av en grovkornet VWF-modell utgitt av Wang et al. innlemme disse variablene og kan kjøres sammen med eksperimentelle funn for å forklare en slik variasjon18. Videre stopper strømmen ikke øyeblikkelig når sprøytepumpen stoppes, forvirrende observasjon av rekyldynamikk. Dette skyldes deformasjon og liten utvidelse av PDMS-kanalen i den tiltenkte strømningsperioden. Når pumpen stoppes, fortsetter væsken å strømme til PDMS er helt avslappet. Et forbedret system bør bruke mer stive PDMS eller mikrokanaler fabrikkert i harde plastmaterialer, slik at væske kan nå en 0 s-1 skjærhastighet raskere. Til slutt kan man bare løse molekyler hvis størrelse er på samme størrelsesorden som den optiske oppløsningen av fluorescensmikroskopet, som kanskje ikke er mindre enn noen få hundre nanometer. Dermed er det et minimumsstørrelseskrav for molekylene som kan observeres direkte med denne metoden.

Den nåværende protokollen gjelder hovedsakelig kvantifisering av konformasjonelle endringer av protein- og DNA-molekyler under fysiologisk strømning. Metoden kan imidlertid også brukes til å visualisere sanntidsinteraksjoner mellom biologiske molekyler og ytterligere karakterisere protein- og DNA-funksjon. Fu et al. har for eksempel vist at bundet VWF kan aktivere under høy skjærstrømning og ytterligere fange blodplateadhesjonsmolekylet GPIbα under varierende strømningsforhold17. Denne bindende hendelsen bevares selv når VWF er bundet til overflaten av biotin-streptavidin linkages, som viser effektiviteten av denne protokollen for å studere fysiologisk relevante funksjoner og mekanikk17. Lignende mekanistisk innsikt kan oppnås mens du studerer interaksjonene mellom rakne DNA og regulatoriske proteiner i strømningsmiljøer21,22. I tillegg gjelder vår metode for det meste å observere konformasjonelle endringer i makromolekyler. Likevel kan man tilpasse det med det formål å studere mindre molekyler som er store nok til å løses under fluorescensmikroskopi. For eksempel, ved noncovalently eller covalently feste et lite molekyl til en mye større, immobilisert lambda DNA, kan man øke skjær-følsomheten til det mindre molekylet og lettere observere sin oppførsel. Til slutt gir andre enkeltmolekylkarakteriseringsmetoder, for eksempel AFM eller optiske pinsett, høyoppløselige data om makromolekylenes strukturelle og funksjonelle egenskaper; Disse alternative metodene kan imidlertid ikke observere de dynamiske, konformasjonsmessige endringene av proteiner og DNA som finner sted i et fysiologisk strømningsmiljø, som det fremgår av denne protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble delvis støttet av en National Science Foundation stipend DMS-1463234, National Institutes of Health tilskudd HL082808 og AI133634, og Lehigh University intern finansiering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 Labeling Kit Invitrogen A30006
Bio-Spin P-6 Gel Columns Bio-Rad 7326221
Biotin Sigma-Aldrich B4501 Use as free biotin in Step 5.6
Biotin-14-dCTP AAT Bioquest 17019
BSA-Biotin Sigma-Aldrich A8549
Coverslips VWR 48393-195 No. 1 ½, 22 x 50 mm
dNTP Set Invitrogen 10297018
Float Buoys for Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69588
Klenow Fragment (3'→5' exo-) New England BioLabs M0212S Use for 10X reaction buffer in Step 2.1.1 and 1X reaction buffer in Step 2.2.2
Lambda DNA New England BioLabs N3011S
Mini Dialysis Device Thermo Scientific 69570 10K MWCO, 0.1 mL volume
NEBuffer 4 New England BioLabs B7004S
NHS-PEG4-Biotin Thermo Scientific 21330
Protocatechuate 3,4-Dioxygenase Sigma-Aldrich P8279
Protocatechuic acid Santa Cruz Biotechnology sc-205818
Silicone Elastomer Kit for PDMS Fabrication The Dow Chemical Company 4019862
Streptavidin Sigma-Aldrich 85878
The Blocking Solution CANDOR Bioscience 110 050 Use as casein blocking solution throughout protocol
Vinyl Cleanroom Tape Fisher Scientific 19-120-3217
von Willebrand Factor, Human Plasma Millipore Sigma 681300
YOYO-1 Dye AAT Bioquest 17580
0.25 mm Inner Diameter Tubing Cole-Parmer EW-06419-00
25 Gauge Needle Thomas Scientific JG2505X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaqfeh, E. S. The dynamics of single-molecule DNA in flow. Journal of Non-Newtonian Fluid Mechanics. 130 (1), 1-28 (2005).
  2. Smith, D. E., Babcock, H. P., Chu, S. Single-polymer dynamics in steady shear flow. Science. 283 (5408), 1724-1727 (1999).
  3. LeDuc, P., Haber, C., Bao, G., Writz, D. Dynamics of individual flexible polymers in a shear flow. Nature. 399 (6736), 564-566 (1999).
  4. Huber, B., Harasim, M., Wunderlich, B., Kröger, M., Bausch, A. R. Microscopic Origin of the Non-Newtonian Viscosity of Semiflexible Polymer Solutions in the Semidilute Regime. ACS Macro Letters. 3 (2), 136-140 (2014).
  5. Springer, T. A. Biology and physics of von Willebrand factor concatamers. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9, 130-143 (2011).
  6. Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
  7. Merchant, K. A., Best, R. B., Louis, J. M., Gopich, I. V., Eaton, W. A. Characterizing the unfolded states of proteins using single-molecule FRET spectroscopy and molecular simulations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (5), 1528-1533 (2007).
  8. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  9. Siedlecki, C. A., et al. Shear-dependent changes in the three-dimensional structure of human von Willebrand factor. Blood. 88 (8), 2939-2950 (1996).
  10. Roiter, Y., Minko, S. AFM single molecule experiments at the solid-liquid interface: In situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte chains. Journal of the American Chemical Society. 127 (45), 15688-15689 (2005).
  11. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (37), 5389-5398 (2016).
  12. Schuler, B., Eaton, W. A. Protein folding studied by single-molecule FRET. Current Opinion in Structural Biology. 18 (1), 16-26 (2008).
  13. Howorka, S., Siwy, Z. Nanopore analytics: sensing of single molecules. Chemical Society Reviews. 38 (8), 2360-2384 (2008).
  14. Talaga, D. S., Li, J. Single-molecule protein unfolding in solid state nanopores. Journal of the American Chemical Society. 131 (26), 9287-9297 (2009).
  15. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  16. Xia, T., Li, N., Fang, X. H. Single-Molecule Fluorescence Imaging in Living Cells. Annual Review of Physical Chemistry. 64, 459-480 (2013).
  17. Fu, H., et al. Flow-induced elongation of von Willebrand factor precedes tension-dependent activation. Nature Communications. 8 (324), 1-12 (2017).
  18. Smith, S. B., Cui, Y., Bustamante, C. Overstretching B-DNA: The Elastic Response of Individual Double-Stranded and Single-Stranded DNA Molecules. Science. 271 (5250), 795-799 (1996).
  19. Wang, Y., et al. Shear-Induced Extensional Response Behaviors of Tethered von Willebrand Factor. Biophysical Journal. 116 (11), 29092 (2019).
  20. Carlsson, C., Johnsson, M., Åkerman, B. Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes. Nucleic Acids Research. 23 (13), 2413-2420 (1995).
  21. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: Novel tools for imaging protein–nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  22. Green, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).

Tags

Bioengineering Utgave 155 von Willebrand faktor lambda DNA microfluidics skjær flyt TIRF konfokal fluorescens mikroskopi
Karakterisere enkeltmolekylkonformasjonsendringer under skjærstrøm med fluorescensmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch,… More

Pisapati, A. V., Wang, Y., Blauch, M. E., Wittenberg, N. J., Cheng, X., Zhang, X. F. Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (155), e60784, doi:10.3791/60784 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter