Summary
여기에 제시된 것은 미세 주입 및 비침습적 미세가브지에 의한 형광성 표지 혐기성 C. difficile로 얼룩말 유충을 감염하는 안전하고 효과적인 방법입니다.
Abstract
클로스트리디오이드 디피실 감염(CDI)은 미국에서 가장 흔한 의료 관련 위장 감염 중 하나로 간주됩니다. C. difficile에 대하여 타고난 면역 반응은 기술되었습니다, 그러나 CDI에 있는 호중구 및 대식세포의 정확한 역할은 보다 적게 이해됩니다. 현재 연구에서는, Danio rerio (zebrafish) 애벌레는 생체 내에서 이러한 선천적 면역 세포의 행동과 협력을 이미징하기 위한 C. difficile 감염 모델을 확립하는 데 사용됩니다. C. difficile을모니터링하기 위해 형광 염료를 사용하는 라벨링 프로토콜이 확립되었습니다. 국소화된 감염은 제브라피시 장관에서 활발하게 자라며 CDI의 장 상피 손상을 모방하는 C. difficile이라는 라벨이 붙은 마이크로주입에 의해 달성됩니다. 그러나, 이 직접적인 감염 프로토콜은 침략적이고 실험 결과에 영향을 미칠 수 있는 현미경 상처를 일으키는 원인이 됩니다. 따라서, 더 비침습적 마이크로게이지 프로토콜은 여기에 기술된다. 이 방법은 열린 입을 통해 삽관에 의해 제브라피시 유충의 장으로 직접 C. difficile 세포의 전달을 포함한다. 이 감염 방법은 C. difficile의자연 감염 경로를 밀접하게 모방합니다.
Introduction
C. difficile는 그람 양성, 포자 형성, 혐기성 및 위장관에서 의 심한 감염의 주요 원인인 독소 생성 간균1. CDI의 전형적인 현상은 설사, 복부 고통 및 치명적인 pseudomembranous 대장염을 포함하고, 때때로 죽음으로 이끌어 낼 수 있습니다1,2. 증거는 호스트 면역 반응이 이 질병의 진행 그리고 결과 둘 다에 있는 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다3. 면역 반응 이외에, 토착 창자 microbiota는 CDI4의개시 그리고 병인을 위해 결정적이다. 지난 10 년 동안, CDI의 케이스의 수와 사망률은 C. difficile (BI/NAP1/027)의 hypervirulent 긴장의 출현 때문에 현저하게 증가했습니다5,6. 근본적인 면역 기계장치의 더 나은 이해 및 CDI 도중 microbiota의 역할은 이 전염병의 더 나은 통제를 가능하게 하는 새로운 치료 발달 및 어드밴스로 이끌어 낼 것입니다.
햄스터 및 마우스와 같은 몇몇 동물 모델은 C. difficile7,8에대하여 면역 방어에 대한 통찰력을 제공하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 선천성 면역 세포의 역할은 여전히 제대로 이해되지 못하며, 특히 선천성 면역 세포 행동은 주로 조직학적 분석 또는 시험관 내 배양 세포로부터 유래되기 때문에. 따라서, 살아있는 척추동물 유기체의 내부 C. difficile에 대한 선천적인 면역 반응을 밝히기 위해 투명한 제브라피시 모델을 확립하는 것은 그러한 연구를 용이하게 할 것이다. Zebrafish 유충은 기능성 선천성 면역 계통을 가지고 있지만, 수정 후 4-6주까지 적응면역계가결여되어 있다 9. 이 독특한 특징은 제브라피쉬 애벌레를 CDI에서 선천적인 면역 세포의 고립된 반응과 기능을 연구하는 훌륭한 모델로 만듭니다.
이 보고서는 대식세포와 호중구와 같은 C. difficile과 선천적인 면역 세포 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 제브라피쉬 애벌레를 사용하는 새로운 방법을 설명합니다. 첫째, C. difficile 접종 및 염색을 포함하는 국소화된 미세 주입 프로토콜이 제시된다. 생체 내 공초점 시간 경과 이미징을 사용하여 감염 부위를 향한 호중구 및 대식세포의 반응이 기록되고 호중구 및 대식세포에 의한 박테리아의 식세포가 관찰됩니다. 그러나, 주사 자체가 조직 손상을 일으키고박테리아(10)와무관하게 백혈구의 모집을 유도하는 것으로 보고되었다. 따라서, 제브라피시 유충의 장으로 C. 디피실을 전달하는 비침습적 마이크로개지 프로토콜이 이어서 기술된다. 이전 연구는 토착 위장 미생물C. difficile의식민지에 대 한 호스트를 보호 하는 것을 입증했다 11. 따라서, 그놈제브라피쉬 유충은 또한 12개의감염된 제브라피시를 걸리기 위해 사용된다. 그 후, 장 해부는 실행 가능한 C. difficile을 복구하고 제브라피시 장관에서 자신의 존재의 기간을 확인하기 위해 수행됩니다.
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Protocol
여기에 설명된 모든 동물 작업은 법적 규정(EU-지침 2010/63, 라이센스 AZ 325.1.53/56.1-TUBS 및 라이센스 AZ 33.9-42502-04-14/1418)에 따라 수행되었습니다.
1. 저융액 아가로즈, 젤 플레이트 및 미세 주입 /미세 가게이 지 바늘의 준비
- 용해 0.08 g의 저용융 아가로즈(재료표,아가로즈 A2576) 10 mL의 30% 다니요 배지 (0.12 mM MgSO4,0.18 mM Ca [NO3]2),0.21 mM KCl, 1.5 mM HEPES (pH = 7.2), 및 17.4 mM NaCl, 0.8 % 용액을 얻기 위해 실온 (RT)에 저장.
참고: 아가로즈농도가 높거나 낮게 사용하실 수 있습니다. 그러나, 고형화 하는 데 필요한 시간은 아가로즈의 다른 브랜드에 대 한 변화, 심지어 동일한 농도에서. - 유리 모세 혈관에서 미세 주입 및 미세 가게이 바늘을 준비하십시오(재료 표).
- 다음 설정으로 마이크로파이펫 풀러를 사용하십시오 (단위는 여기에 사용되는 풀러에 특정합니다. 재료 표참조): 미세 사출 바늘 (공기 압력 = 500; 열 = 400; 당김 = 125; 속도 = 75; 시간 = 150); 및 마이크로 게이지 바늘 (공기 압력 = 500; 열 = 400; 당김 = 100; 속도 = 75; 시간 = 150). 마이크로 로더 팁을 사용하여 3 μL의 뉴클레아제 프리H2 O를당겨진 바늘에 적재하십시오.
- 바늘을 인젝터에 넣고 제대로 고정하십시오. 주사에 적합한 각도로 바늘을 조정합니다. 사이 주입 압력을 설정 600-900 미세 주입 바늘에 대 한 hPa 와 200-300 위봉 바늘에 대 한 hPa.
- 교정 슬라이드의 검은 색 원에 미네랄 오일 한 방울을 놓습니다. 미세 한 집게를 사용 하 여 바늘의 끝을 잘라. 미네랄 오일에 한 방울을 주입하여 물방울의 크기를 측정하십시오.
- 미세 주입의 경우 주입 시간을 조정하여 0.10-0.12 mm의 물방울을 얻습니다.이 물방울은 0.5-1.0 nL의 부피와 같습니다. 마이크로 게이지의 경우 직경이 0.18-0.20 mm인 물방울을 구하면 3-5 nL의 부피와 같습니다.
- 1.5% 아가로즈 플레이트를아가로즈(재료표,8050)로 10cm 페트리 접시에 30% 다니오의 배지에 마이크로가게이지 몰드로 플라스틱 몰드로 준비한다. 필요할 때까지 탈수하지 않도록 4°C에서 보관하십시오. 실험 전에 RT 또는 28°C로 따뜻하게 합니다.
2. 형광 염료로 C. 디피실 및 포자의 준비 및 라벨링
- 형광 염료(재료 표)의1 mM 재고 용액을 준비합니다. 염료는 분말의 50 μg aliquots에서 판매되기 때문에, 1 mM의 재고 농도를 얻기 위하여 유리병에 DMSO의 69 μL를 추가합니다.
- 1mMM 스톡 용액 의 2 μL을 원심분리튜브에 DMSO 18μL에 첨가하여 형광 염료의 100 μM 작동 용액을 준비하고 잘 혼합한다.
- 배양 C. 디피실(R20291, 리보타입 027 균주)은 밤새 흔들리지 않고 혐기성 후드에서 플레이트로부터 2~3개의 콜로니와 함께 BHIS 액상 배지의 10 mL을 접종함으로써. BHIS는 0.5% (v) 효모 추출물과 0.1% (v) L-시스테인으로 보충된 BHI입니다. DdH2O의 10 mL에 L-시스테인 1 g을 용해시키고 여과에 의해 살균한 다음, 오토클레이브 배지에 첨가하여 1 g/L. 플레이트의 최종 농도를 얻어 오토클레이브를 하기 전에 배지에 15 g/L 한천을 첨가하여 제조하였다. C. 디피실의 선택적 배합은 chromID C. 디피실 플레이트(물자표)를사용하여 수행된다.
- 형광 염료로 염색 C. 디피실
- 수확 C. 1.0-1.2의 OD600에서 difficile 및 1x PBS의 1 mL로 1 x 세척 (RT에서 3 분 동안 5,000 x g). 1 x PBS의 1 mL에서 다시 일시 중단합니다.
- 형광 염료의 작동 용액 3 μL을 박테리아 현탁액 1 mL에 추가합니다. 어둠 속에서 RT에서 15 분 동안 샘플을 배양하십시오. 염색된 C. difficile을 1 mL PBS로 한 번 세척하여 잔류 염료를 제거하고 1.0의 OD600으로 1x PBS에서 다시 일시 중단합니다(1.0 OD600은 대략 108 cfu/mL에 해당합니다).
3. 얼룩말 물고기 애벌레에 스테인드 C. difficile의 주입
- 20-30 제브라피시 유충을 5일 후 수정 후(5 dpf라고 함)에서 0.02%-0.04% 트리카인(트리카인 분말을 이중 증류수에 용해하고 pH =7로 조정)을 30% Danieau's medium에 30% 사출. 마취된 애벌레를 신선한 10cm 페트리 접시로 옮기고 다니오의 배지를 30% 이상 제거합니다.
- 제브라피시 유충에 0.8% 낮은 용융 아가로스를 떨어뜨려 덮습니다. 애벌레를 측면 위치로 부드럽게 조정합니다. 페트리 접시를 얼음 위에 30-60초 동안 놓아 서 녹는 아가로즈가 굳어지도록 합니다. 아가로즈를 덮기 위해 0.02%-0.04%의 트리카인을 함유한 30% 다니요 배지를 첨가합니다.
- 사출 용액을 준비합니다. 주사 과정을 시각화하기 위해 염료 염색 C. difficile 접종의 9 μL에 PBS 용액에 0.5 % 페놀 적색의 1 μL을 추가합니다.
- 마이크로 로더를 사용하여 주입 용액으로 교정 된 미세 주입 바늘을로드하십시오. 로드된 바늘을 마이크로 매니퓰레이터에 장착하고 입체 현미경 아래에 놓습니다.
- 600-900 hPa 사이의 사출 압력을 조정합니다. 주사 시간을 0.1-0.3s로 설정하여 0.5-1.0 nL를 얻습니다. 미소매니터의 바늘을 내장된 애벌레를 가리키는 ~45° 각도로 설정합니다.
- 바늘 끝을 비뇨 생식기 기공 에 가까운 위장관 위에 놓습니다. 아가로스를 통해 다음 바늘 끝으로 근육을 관통, 다음 장 내강구에 삽입 하 고 주입 0.5-1.0 C. difficile의nL. 형광 현미경을 사용하여 주입된 유충을 모니터링하고 공초점 이미징을 위해 적절하게 주입된 유충을 픽업합니다.
4. 노토바이오틱제지브라피쉬 유충의 생성
- 잘 확립 된 자연 사육 방법을 사용하여 노토 바이오 틱 얼룩말 배아를 생성하고, 포함: 시험관 내 수정, 항생제 함유 배지 (1 μg / mL 암포테리신 B, 10 μg / mL 카나마이신 및 20 μg / mL ampicillin), 0.1 % wt / vol 폴리 비닐 피롤리돈 - 요오드 (PVP-I) 용액으로 세척, 및 배아배양12 배양 배양
- 모든 그놈 제브라피쉬 유충을 5 dpf 까지 또는 육계 직전까지 그놈바이오틱 조건하에서 유지하십시오. 게이지 후, 제브라피시 유충은 표준 인큐베이터로 옮겨지지만 멸균 된 30 % 다니오 의 배지.
5. 게브라피시 애벌레의 가가지
- 1.2단계에서 기재된 바와 같이 마이크로게이지 바늘을 교정한다.
- 바늘을 미네랄 오일 한 방울로 교정 슬라이드에 배치하여 바늘 끝의 직경을 측정합니다. 팁의 직경이 30-40 μm이고, 무딘, 매끄러운지 확인하십시오. 날카롭거나 거친 바늘을 버리십시오.
참고 : 바늘의 날카로운 가장자리는 빠른 불타는에 의해 무딘 될 수 있습니다. - 3.3단계에서 설명한 대로 게이지 용액을 준비한다.
- 3.4단계에서 설명한 바와 같이 바늘을 미세조작기 위에 적재하고 장착한다. 마이크로 조작기를 조정하여 바늘을 45° 각도로 배치합니다.
- 3.1단계에서 언급된 제브라피쉬 유충을 마취한다. 유충이 움직이지 않을 때, 파스퇴르 피펫을 사용하여 마이크로 게이지 몰드의 홈으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 옮김을 옮김으로 옮김을 옮김을 옮김을 메우게 한다
- 제브라피시 유충에 0.8% 낮은 용융 아가로스를 떨어뜨려 덮습니다. 홈의 45° 각도에서 머리를 똑바로 향하게 하고 홈 벽에 꼬리를 대고 애벌레를 부드럽게 조정합니다. 머리의 각도가 거의 동일한지 확인하여 게이지 바늘의 각도와 정렬되도록 하십시오. 30-60 s에 대 한 얼음에 microgavage 금형을 배치, 낮은 용융 agarose 고응화 하기 위해 유충의 위치를 안정화 하기 위해.
- 200-300 hPa 사이의 사출 압력을 조정합니다. C. 디피실의 3-5 nL의 주입 체적을 얻기 위해 주사 시간을 0.1-0.3 s로 설정합니다.
- 부드럽게 아가로즈를 통해 바늘을 조작 한 다음 제브라피시 유충의 입으로, 식도를 통해. 바늘의 끝이 전방 장 전구 안쪽에 있으면, 박테리아를 풀어 놓기 위하여 주입 페달을 누릅니다. 전달 된 볼륨으로 장의 내강을 채웁니다. 식도 나 클로아카에서 넘치게하지 마십시오. 제브라피시 입에서 바늘을 부드럽게 꺼냅니다.
- 위관에 따라, 먼저 애벌레를 들어 올려 아가로스를 절단하여 유연한 마이크로 로더 팁으로 아가로즈에서 감염된 제브라피시 유충을 구출합니다. 이 애벌레를 멸균 된 30 % 다니오 배지로 옮김. 애벌레를 멸균 배지로 두 번 헹구는다. 애벌레를 신선한 10cm 페트리 접시로 옮김. 애벌레는 최대 11 dpf까지 유지될 것이다.
6. 주입된 제브라피시 유충의 공초점 현미경 분석
- 제브라피쉬 유충을 마취시키는 것은 3.1단계를 지칭한다. 이미징 챔버라고 도는 구멍에 부착 된 유리 슬라이드와 35mm 페트리 접시의 바닥에 구멍을 확인합니다. 30% Danieau의 배지의 적당한 양으로 화상 진찰 실의 바닥에 배아를 전송하십시오.
- 마취 된 애벌레를 덮기 위해 1 % 낮은 용융 아가로스의 200-300 μL을 추가하십시오. 거꾸로 된 공초점 현미경이 사용되기 때문에, 유리 슬라이드에 대해 애벌레의 감염된 부위를 가능한 한 가깝게 놓습니다.
- 아가로즈가 얼음위에 굳어지게 하면 30~60초동안 아가로즈를 30% 다니요의 0.02%-0.04%의 트리카인으로 담그게 한다.
- 유충을 공초점 레이저 스캐닝 현미경으로이미지(재료 표).
7. 가능한 C. difficile를 복구 하기 위해 애벌레 얼룩말 창 자의 해 부
- 세균 부하를 분석 하기 위해 애벌레에서 위장을 분리. 먼저 제브라피쉬 유충을 0.4% 트리카인으로 안락사시합니다.
- 제브라피쉬를 멸균 된 1 x PBS로 간략하게 헹구고 신선한 아가로즈 접시로 옮김하십시오.
- 제브라피시 해부
- 제브라피시 유충의 등지트렁크에 바늘을 머리에 삽입하여 제브라피시를 고정시되이 시다. 랜싯으로 아가미 뒤의 머리를 제거합니다.
- 등도 트렁크의 중간에 두 번째 바늘을 삽입합니다. 제브라피시의 복부에 세 번째 바늘을 삽입하고 몸 구멍에서 내장을 당깁니다.
참고: 손상되지 않은 내장을 분리하려면 극도의 주의가 필요합니다. 그렇게하기 어려운 경우, 나머지 내부 장기에서 장의 나머지 부분을 분리하기 위해 추가 당김을 수행하십시오. - 미세 주입 바늘을 사용하여 10-15 개의 내장을 1x PBS의 200 μL 멸균을 포함하는 1.5 mL 튜브로 옮김을 옮김.
- 조직을 방해하고 균질제를 준비하는 유봉으로 내장을 균질화하십시오. 유봉이 튜브의 바닥에 도달하여 모든 창자를 완전히 방해하도록하십시오.
- 혐기성 챔버에서 타우로콜레이트(TCA, C. difficile 포자의 발아제)의 유무에 관계없이 D-시클로딘 및 세폭시틴을 함유하는 C. difficile 사육 배지에서 균질화를 배양한다.
- 37 °C에서 48 시간 동안 혐기성 플레이트를 배양합니다.
- 16S rRNA-PCR에 대 한 박테리아 배양을 사용 합니다.
- H2O의 50 μL에서 식민지를 다시 중단하고 95 °C에서 15 분 동안 끓입니다. 원심분리(RT에서 2분 동안 14,000rpm)에 의한 용해 된 파편을 펠렛하고 C. difficile-특정프라이머 (Cdiff16Sfw : 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3')를 사용하여 PCR 반응의 25 μL에서 템플릿으로 상급물질의 2 μL을 사용합니다. Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
- 액체 배양균을 사용할 때, 배양 1 mL을 수확하고 1 mL의 PBS (RT에서 2 분 동안 14,000 rpm)로 한 번 씻으하십시오. H2Odd의 100 μL에서 펠릿을 다시 중단하고 위에서 수행한 것처럼 취급한다. 세균 성 콜로니를 더욱 특성화하기 위해 BHIS- 또는 크로미드 플레이트(재료 표)에줄무늬를 지정합니다.
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Representative Results
C. difficile는 엄격하게 혐기성입니다, 그러나 형광성 단백질의 발색단은 일반적으로 성숙하기 위하여 산소를 요구합니다. 이러한 문제점을 극복하기 위해, 형광염료를 활발히 성장시킨 살아있는 C. 디피실 세포를 염색하는 데 사용되었다(R20291, 리보형 027 균주; 그림 1A). Gal4/UAS 시스템을 사용하여, mpeg1.1 또는 lyZ 프로모터가 Gal4 의존적 방식으로 대식세포 및 호중구(각각)에서 EGFP 형광 단백질의 발현을 유도하는 살아있는 이미징을 위해 안정적인 형질전환 제브라피시 라인이 생성되었습니다.
염색된 C. 디피실을 5 dpf에서 제브라피쉬 장관내로 주입하고, 감염된 부위를 1시간 배양 후에 이미지화시켰다. 시간 경과 화상 진찰은 호중구와 대식세포 둘 다 감염 사이트에 도달했다는 것을 보여주었습니다(그림 1B),이 2개의 선천적인 면역 세포의 수는 C. difficile가 삭제될 때까지 증가했습니다. 치우는 표지된 C. 디피실의 식세포증 및 소화에 의해 발생하였다. 도 1C는 활성화된 대식세포식세포가 두 개의 C. 디피실 박테리아를 함유하고 있음을 보여준다(보충 영화 1참조).
그림 1: 얼룩말에서 C. 디피실의 염색 및 감염. (A)미세 주입 후 감염된 제브라피시 내 의 C. 디피실 박테리아를 형광으로 표시하였다. 스케일 바 = 5 μm.(B)이중 형질전환 제브라피쉬 Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3에서 2h 감염 후 감염 부위에 축적된 녹색 형광 호중구를 나타내는 공초점 Z-스택 프로젝션(hpi). 호중구는 녹색과 C. 디피실을 빨간색으로 표시합니다. 스케일 바 = 50 μm.(C)공초점 시간 경과 이미징을 보여주는 GFP 표지 대식세포 식육 식세포 적색 형광 염색 C. difficile. 배율 표시줄 = 20 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
미세 주사는 병원균으로 얼룩말 유충을 감염시키는 가장 일반적인 방법이지만,이 방법은 변함없이 조직 손상을 일으켜 실험 결과에 영향을 줄 수 있습니다. 이 문제를 피하기 위해, 마이크로가비지는 CDI의 자연적인 경로를 모방한 5 dpf에서 대식세포 및 호중구 리포터 라인의 장 내루에 형광 표지 된 C. difficile을 전달하는 데 사용되었다(그림 2A). 그러나, 호중구 및 대식세포는 마이크로게이지 후 최대 12시간 동안 위장관으로의 명백한 이동을 나타내지않았다(도 2B). 한편, 표지된 C. difficile의 형광은 약 5시간 후 마이크로게이지, 1) 효소 파괴, 2) 제브라피시의 장에서 부적절한 pH 수준, 또는 3) 포자 형성 및 박테리아의 막 변화에 수반되는 후사라졌다(도 2B). 따라서 C. difficile을검출하기 위해 장 내 해부 방법이 확립되었습니다.
그림 2: C. 디피실을가진 제브라피시 유충의 마이크로게이지. (A)5 dpf에서 제브라피시 유충의 대표적인 이미지는 형광 얼룩C. difficile. 이미지는 약 3 시간 후 gavage, C. difficile 얼룩말물고기의 후방 창자에 존재 했다 보여주는. 스케일 바 = 100 μm.(B)대식세포 운동성을 입증하는 공초점 시간 경과 영상. 이중 형질전환 제브라피시 애벌레 Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 5 dpf에서 형광 표지 C. 디피실로발족하였다. 공초점 타임랩스 이미징은 최대 12시간 동안 수행되었습니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
C. difficile이 제브라피시에 서식할 수 있었는지 확인하기 위해, 제브라피쉬 장은 위장 후 다양한 시점에서 분리되었습니다. 이어서, 분리된 내장을 플라스틱 유봉으로 균질화하고, 균질체를 TCA 유무에 관계없이 D-시클로딘 및 세폭시틴을 함유하는 C. 디피시슬 배지에서 배양하였다. 그러나, 적극적으로 성장하는 C. difficile 세포는 TCA의 유무에 관계없이 24 시간 까지만 검출되었습니다 (데이터는 표시되지 않음). 그것은 기존의 애벌레에 있는 토착 미생물 지역 사회는 그들의 식민지 저항 때문에 C. difficile 침략을 방지 했다 추측.
그놈제브라피쉬 유충도 사용되었다. 장 샘플 24 hpi를 해부하고 TCA 또는 TCA 없이 배지에서 세균 성장을 보였으며, 대조군에서 박테리아가 증가하지 않은반면(도 3A). 그러나, 후기 시점에서(즉, 48hpi, 72hpi 및 120hpi) 배양된 샘플은 TCA를 함유하는 배지에서만 성장했으며, 이는 장에서의 총 C. difficile이 포자를 형성했다는 것을 시사한다(도3B). 이는 형광 라벨링의 손실에 대한 가능한 설명을 제공한다.
16S rDNA PCR은 성장한 박테리아를 C. difficile로식별하는 데 사용되었으며, 이는 예측 가능한 크기의 특정 PCR 앰플리콘을 생산했습니다 (~800 bp; 그림 3C). 이 결과는 이러한 PCR 제품의 시퀀싱을 통해 더욱 검증되었습니다. 그 후, 세균 배양은 BHIS 접시에 퍼졌다. 몇몇 단 하나 식민지는 그 때 단지 C. difficile 성장을 지원하는 chromID 격판덮개에 전송되었습니다. 박테리아는 전형적인 검은 식민지로 나타났으며, 이는 제브라피시 장의 박테리아가 C. difficile이었다는 것을 더 나타냈다(그림 3D).
그림 3: 감염 후 제브라피시 장에서 C. 디피실 검출. 각각의 독립적인 실험에 대해, 5 dpf에서 15-20 개의 그놈 제브라피쉬 유충은 마이크로 게이지에 의한 음성 대조군으로서 108 CFU/mL C. difficile 또는 PBS의 3-5 nL로 감염되었다. (A)해부된 장의 균질체를 배양하였다. 박테리아는 gnotobiotic zebrafish 유충의 감염 후에 TCA 72 h를 포함하는 배지에서 성장했습니다 (1, 비감염 대조군; 2, R20291-감염제브라피시; n=3). (B)24시간, 48시간, 72시간, 120시간 후 C. 디피실(n=3)으로 감염 후 전체 실험 결과의 개략적 도례(n=3)(C)세균 샘플은 72시간 후 마이크로게이비지(1, 비감염 대조군; 2, R20291-감염된 얼룩말)에서 16S rDNA PCR에 의해 시험되었다. (D)크로미드 플레이트에 C. 디피실의 성장; 이 판의 특징인 C. difficile의검은 색을 기록합니다(n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
제시된 방법은 주사 및 마이크로게이지10,14를모두 수행함으로써 제브라피시 유충을 감염시키기 위한 기존의 접근법을 수정하고 확장한다. 또한 제브라피시 유충22를사용하여 혐기성 병원체를 연구하는 접근법을 입증한다. 또한, 이 프로토콜은 CDI시 및 제브라피시에서 C. 디피실의 식민지화 시 생체 내 선천성 면역 세포 반응의 분석을 용이하게 한다. 이 방법은 재현 가능하고 일상적인 실험실 또는 임상 환경에서 수행하기 쉽습니다.
백혈구에 의한 C. 디피실의 식세포증을 모니터링하기 위해, 두 개의 안정적인 형질전환 제브라피쉬 라인(예를 들어, Tg[mpeg1.1: KalTA4] bz16)을 사용하여 대식세포(KalTA4: 제브라피쉬에 최적화된 Gal4-variant)와 Tg(lyz:KalTA4)bz17 및 Tg의 트랜스제닉 배경과 교차할 때 호중구를 시각화하였다(예를들어, Tg[mpeg1.1]bz16). C. difficile의성장에 필요한 혐기성 환경으로 인해, C. difficile을 추적하는 유전 도구는 제한됩니다. 코돈에 최적화된 mCherryOpt는 그(것)들을 표지하기 위하여 보고되었더라도, C. difficile 박테리아는 살아있는 화상 진찰 조정에 있는 그것의 사용의 앞에 형광을 전시하기 전에 고쳐져야 합니다13. 따라서, 형광 염료는 수많은 가능한 녹색 형광 형질 전환 제브라피시 균주와 결합될 수 있는 적색 형광을 가진 살아있는 C. difficile를 얼룩지기 위하여 여기에서 이용되었습니다. 이 방법은 박테로이드 취약성 및 헬리코박터 간염과 같은 다른 장 혐기성 박테리아에 쉽게 적용할 수 있습니다. 대표적인 결과는 호중구와 대식세포 가 모두 감염된 제브라피시에서 식세포 C. difficile을 인식하고 인식할 수 있다는 것을 보여줍니다.
침지 및 미세 주입 방법 모두 정기적으로 제브라피시20,21,22를감염시키기 위해 사용되어 왔다. 침지 방법을 사용하는 것은 간단하지만,이 방법은 정확하게 장으로 박테리아의 침입 시간을 제어하는 것을 어렵게만든다. 미세 주사는 병원균으로 얼룩말 배아를 감염시키는 가장 일반적인 방법이지만 변함없이 조직 손상을 일으킵니다. 따라서, 마이크로 게이지는 자연 감염 경로를 모방하는 데 사용되었다.
그러나, 염료 염색 된 C. difficile 주위 5 시간 후 microgavage 발견 되었다. 이것에 대한 이유는 현재 불분명하지만 1) 장 조건 하에서 형광의 편협 또는 2) C. difficile 세포의 포자 형성개시와 관련이 있을 수 있습니다. 또한 C. difficile전체 유충 균질제의 배양에서 검출되지 않았다는 것을 발견되었습니다. 따라서, 각 감염된 제브라피시의 장은 해부된 후 배양하여 C. difficile이 여전히 제브라피시의 장 조직에 거주하고 있는지 여부를 결정합니다.
종래의 마우스의 토착 미생물체때문에, 항생제 칵테일 또는 뇨시바이오틱 마우스로 전처리된 마우스만이 C. difficile16에취약하다. 마찬가지로, C. difficile는 gnotobiotic 얼룩말피의 창자에서만 검출되었지만 전통적인 야생 형 제브라피시 24 시간 감염 후에서 만 검출된 것으로 나타났습니다. 흥미롭게도, 48 시간, 72 시간 및 120 h 감염 후 제브라피쉬의 장 샘플은 TCA를 함유하는 미디어에서만 성장했습니다. 전술한 바와 같이, TCA는 시험관 내에서 C. 디피실 포자 발아를 자극한다. 이 결과는 활성 C. difficile 세포가 이미 제브라피시 장에서 식물 포자를 형성하고, 포자 유래 콜로니가 microgavage 접근법을 사용하여 검출되었다는 것을 시사한다.
흥미롭게도, 세균이 없는 얼룩말은 여전히 장 호중구 유입 이나 얼룩말 물고기의 죽음과 같은 CDI의 증상을 제시 하지 않았다. 이것은 주입에 의하여 감염이 상처를 입으로써 선천적인 면역 세포를 활성화할 수 있고 활성화된 대식세포와 호중구만이 C. difficile을빨리 검출할 수 있다는 것을 보여줍니다. 또한, 제브라피쉬에서 눈에 띄는 CDI의 부족에 대한 설명은 제브라피시와 포유류장(17)의구조적 차이에 기초한다. 제브라피쉬 장에는 C. 디피실이 자주 있는18개의창자 지하실이 부족합니다. 포유류에 비해 제브라피시의 유지 보수 온도가 낮을수록 포유류 모델에서처럼 빠르게 제브라피시에서 CDI가 발병하지 않는다고 추론되었습니다. 그러나, 인간 미생물의 두 혐기성 박테리아, 유산 균 파라카세이 와 Eubacterium 리모섬, 제브라피쉬 창 자 내부 성장 입증되었습니다 19. 여기에 제시 된 기술 발전은 생체 내에서 분자 견인 제브라피쉬 유충에서 포유류 창자에서 파생 된 C. difficile 및 기타 박테리아 또는 병원체를 연구하는이 방법의 응용 프로그램을 장려할 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
우리는 훌륭한 동물 관리를 위한 티모 프리치에게 감사드립니다. 우리는 Köster와 Steinert 연구소의 회원들에게 지원과 도움이 되는 토론에 감사드립니다. 원고를 비판적으로 읽어주신 한단 박사께 감사드립니다. 우리는 감사하 중 낮은 작센의 연방 국가에 의해 자금 을 인정, 니더샤치쉬 보랍 (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
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