Summary
Præsenteret her er en sikker og effektiv metode til at inficere zebrafisk larver med fluorescerende mærket anaerobe C. difficile ved mikroinjektion og noninvasive microgavage.
Abstract
Clostridioides difficile infektion (CDI) anses for at være en af de mest almindelige sundheds-relaterede gastrointestinale infektioner i USA. Den medfødte immunrespons mod C. difficile er blevet beskrevet, men de nøjagtige roller neutrofiler og makrofager i CDI er mindre forstået. I den nuværende undersøgelse, Danio rerio (zebrafisk) larver bruges til at etablere en C. difficile infektion model for billeddannelse adfærd og samarbejde af disse medfødte immunceller in vivo. For at overvåge C. difficileer der etableret en mærkningsprotokol ved hjælp af et fluorescerende farvestof. En lokaliseret infektion opnås ved microinjecting mærket C. difficile, som aktivt vokser i zebrafisk tarmkanalen og efterligner tarmepitel skader i CDI. Men, denne direkte infektion protokol er invasiv og forårsager mikroskopiske sår, som kan påvirke eksperimentelle resultater. Derfor er en mere noninvasive mikrogavage protokol er beskrevet her. Metoden indebærer levering af C. difficile celler direkte ind i tarmen af zebrafisk larver ved intubation gennem den åbne mund. Denne infektion metode nøje efterligner den naturlige infektion rute C. difficile.
Introduction
C. difficile er en gram-positiv, spore-dannende, anaerobe, og toksin-producerende bacillus, der er den hyppigste årsag til alvorlige infektioner i mave-tarmkanalen1. Typiske symptomer på CDI omfatter diarré, mavesmerter, og fatale pseudomembranøs colitis, og det kan undertiden føre til døden1,2. Dokumentation har vist, at værtsimmunrespons spiller en afgørende rolle i både progression og udfald af denne sygdom3. Ud over immunrespons, den indfødte tarm mikrobiota er afgørende for debut og patogenese af CDI4. I det seneste årti er både antallet af tilfælde og dødeligheden af CIU steget betydeligt på grund af fremkomsten af en hypervirulent stamme af C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. En bedre forståelse af underliggende immunmekanismer og mikrobiotaens rolle under CDI vil bidrage til at føre til nye terapeutiske udviklinger og fremskridt, hvilket muliggør bedre kontrol med denne epidemi.
Flere dyremodeller, såsom hamster og mus, er blevet udviklet til at give indsigt i immunforsvaret mod C. difficile7,8. Men, rollen som medfødte immunceller er stadig dårligt forstået, især da medfødte immuncelle adfærd er hovedsageligt stammer fra histologisk analyse eller dyrkede celler in vitro. Derfor vil etablering af en gennemsigtig zebrafisk model til at afsløre den medfødte immunrespons på C. difficile inde i en levende hvirveldyr organisme vil lette sådanne undersøgelser. Zebrafisk larver har en funktionel medfødte immunsystem, men de mangler adaptive immunsystem indtil 4-6 uger efter befrugtning9. Denne unikke funktion gør zebrafisk larver en fremragende model til at studere den isolerede respons og funktion af medfødte immunceller i CDI.
Denne rapport beskriver nye metoder ved hjælp af zebrafisk larver til at studere samspillet mellem C. difficile og medfødte immunceller, såsom makrofager og neutrofiler. For det første præsenteres en lokaliseret mikroinjektionsprotokol, der omfatter C. difficile inoculum og farvning. Ved hjælp af in vivo confocal time-lapse imaging, er reaktionen af neutrofiler og makrofager mod infektionsstedet registreres, og fagocytose af bakterier af neutrofiler og makrofager er observeret. Men, Det er blevet rapporteret, at injektionen selv forårsager vævsskader og fører til rekruttering af leukocytter uafhængig afbakterierne 10. Derfor beskrives en noninvasive mikrogavageprotokol til at levere C. difficile ind i tarmen af zebrafisklarver efterfølgende beskrevet. Tidligere undersøgelser har vist, at indfødte gastrointestinale mikrobiota beskytte en vært mod kolonisering af C. difficile11. Derfor er gnotobiotiske zebrafisk larver også bruges til at disponere zebrafisk, der er inficeret 12. Derefter udføres tarmdissektion for at genvinde levedygtige C. difficile og validere varigheden af deres tilstedeværelse i zebrafisk tarmkanalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alt animalsk arbejde, der er beskrevet her, blev udført i overensstemmelse med lovbestemmelser (EU-direktiv 2010/63, licens AZ 325.1.53/56.1-TUBS og licens AZ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Forberedelse af lavsmeltende Agarose, Gel Plate, og Microinjection / Microgavage Nåle
- Genopløs 0,08 g lavsmeltende agarose ( Tabel overmaterialer, agarose A2576) i 10 ml af 30% Danieau's medium (0,12 mM MgSO4, 0,18 mM Ca [NO3]2), 0,21 mM KCl, 1,5 mM HEPES (pH = 7,2) og 17,4 mM NaCl, opbevaret ved stuetemperatur (RT) for at opnå en 0,8% opløsning.
BEMÆRK: Højere eller lavere koncentrationer af agarose kan anvendes. Den nødvendige tid til at størkne varierer imidlertid for forskellige mærker af agarose, selv i samme koncentration. - Forbered mikroinjektion og mikrogavage nåle fra glas kapillærer (Tabel over materialer).
- Brug en micropipette puller med følgende indstillinger (bemærk, at enheder er specifikke for puller, der anvendes her; se Tabel over materialer): mikroinjektion nåle (lufttryk = 500; varme = 400; pull = 125; hastighed = 75; tid = 150); og microgavage nåle (lufttryk = 500; varme = 400; træk = 100; hastighed = 75; tid = 150). Brug en mikrolæsserspids til at læsse 3 μL nuclease-fri H2O ind i den trak nål.
- Indfør nålen i injektoren og fastgør den korrekt. Juster nålen til en passende vinkel til injektion. Indstil injektionstrykket mellem 600-900 hPa for mikroinjektionsnål og 200-300 hPa for sondenål.
- Placer en dråbe mineralsk olie på kalibreringsdiasets sorte cirkel. Brug fine pincet til at klippe spidsen af nålen. Injicer en dråbe i mineralsk olie for at måle størrelsen af dråben.
- Ved mikroinjektion justeres injektionstiden for at opnå en dråbe med en diameter på 0,10-0,12 mm, hvilket svarer til et volumen på 0,5-1,0 nL. For mikrogavage, opnå en dråbe med en diameter på 0,18-0,20 mm, hvilket svarer til et volumen på 3-5 nL.
- Forbered en 1,5 % agaroseplade med agarose(Materialetabel,8050) i en 10 cm petriskål i 30% Danieaus medium ved hjælp af en plastform som mikrogavageformen. Opbevares ved 4 °C for at forhindre udtørring, indtil det er nødvendigt. Varm til RT eller 28 °C før forsøget.
2. Forberedelse og mærkning af C. difficile og sporer med fluorescerende farvestof
- Forbered en 1 mM lager opløsning af en fluorescerende farvestof (Tabel over materialer). Da farvestoffet sælges i 50 μg aliquots pulver, tilsættes 69 μL DMSO til hætteglasset for at opnå en 1 mM lagerkoncentration.
- Der fremstilles en 100 μM-arbejdsopløsning af fluorescerende farvestof ved at tilsætte 2 μL 1 mM-lageropløsning til 18 μL DMSO i et centrifugerør og blandes godt.
- Kultur C. difficile (R20291, en ribotype 027 stamme) ved at vaccinere 10 ml BHIS flydende medium med to til tre kolonier fra en plade i en anaerob hætte uden at ryste natten over. BHIS er BHI suppleret med 0,5% (w /v) gær ekstrakt og 0,1% (w / v) L-cystein. 1 g L-cystein opløses i 10 ml ddH2O og steriliseres ved filtrering, og tilsæt derefter til autoclaved mediet for at opnå en endelig koncentration på 1 g/L. Plader fremstilles ved at tilføje 15 g/L agar-agar til mediet før autoklavering. Selektiv dyrkning af C. difficile sker ved hjælp af chromID C. difficile plader (Tabel over materialer).
- Farvning C. difficile med fluorescerende farvestof
- Høst C. difficile ved en OD600 på 1,0-1,2 og vask 1x med 1 ml 1x PBS (5.000 x g i 3 min på RT). Resuspendering i 1 ml 1 x PBS.
- Der tilsættes 3 μL arbejdsopløsning af fluorescerende farvestof i 1 ml bakteriesuspension. Inkuberprøven i 15 minutter på RT i mørke. Den farvede C. difficile vaskes én gang med 1 ml PBS for at fjerne restfarvefarvestof og ophænges igen i 1x PBS til en OD600 på 1,0 (1,0 OD600 svarer til 108 cfu/ml).
3. Injektion af farvede C. difficile i Zebrafisk Larver
- Bedøve 20-30 zebrafisk larver ved 5 dage efter befrugtning (benævnt her som 5 dpf) med 0,02%-0,04% tricaine (tricainpulver opløses i dobbelt-destilleret vand og justeres til pH = 7 med 1 M Tris-HCL løsning) i 30% Danieau's medium ~ 10 min før Injektion. Overfør de bestøvede larver til en frisk 10 cm petriskål og fjern overskydende 30% Danieaus medium.
- Placer et fald på 0,8% lav smeltende agarose på zebrafisk larver til at dække. Juster forsigtigt larverne til en sideværts position. Placer petriskålen på is i 30-60 s for at lade den lave smeltende agarose størkne. Tilføj 30% Danieau's medium indeholder 0,02% -0,04% tricaine til at dække agarose.
- Gør injektionsopløsningen klar. Der tilsættes 1 μL 0,5% phenolrød i PBS-opløsning i 9 μL af farvestoffet C. difficile i unokselumforati for at visualisere injektionsprocessen.
- Læg en kalibreret mikroinjektionsnål med injektionsopløsningen ved hjælp af en mikrolæsser. Monter den lastede nål på en mikromanipulator, og placer den under et stereomikroskop.
- Tiljuster injektionstrykket mellem 600-900 hPa. Indstil injektionstiden til 0,1-0,3 s for at opnå 0,5-1,0 nL. Sæt nålen i mikromanipulatoren i en vinkel på ~45°, der peger mod de indlejrede larver.
- Placer nålespidsen over mave-tarmkanalen tæt på den urogenitale pore. Pierce gennem agarose derefter musklen med nålen spidsen, derefter indsætte det i tarmlumen og injicere 0,5-1,0 nL af C. difficile. Brug et fluorescensmikroskop til at overvåge de injicerede larver og afhente de korrekt injicerede larver til konfokal billeddannelse.
4. Generation af gnotobiotiske zebrafisk larver
- Brug den veletablerede naturlige avlsmetode til at generere gnotobiotiske zebrafiskembryoner, herunder: in vitro-befrugtning, vask med antibiotisk holdigt medium (1 μg/ml amphotericin B, 10 μg/mL kanamycin og 20 μg/mL ampicillin), vask med 0,1% wt/vol polyvinyl pyrrolidon-jod (PVP-I) opløsning og inkubation af embryonerne i en cellekulturhætte12.
- Opretholde alle gnotobiotiske zebrafisk larver under gnotobiotiske forhold indtil 5 dpf eller lige før gavage. Efter sonde, zebrafisk larver vil blive overført til en standard kuvøse, men med sterile 30% Danieau's medium.
5. Gavage af zebrafisk larver
- Mikrogavagenålen kalibreres som beskrevet i trin 1.2.
- Mål diameteren af spidsen af nålen ved at placere nålen på en kalibrering dias med en dråbe mineralsk olie. Sørg for, at spidsen er 30-40 μm i diameter, stump og glat. Kassér de skarpe eller ru nåle.
BEMÆRK: Skarpe kanter af nåle kan afstumpet ved hurtig flammende. - Gør sondeopløsningen klar som beskrevet i trin 3.3.
- Lad og monter nålen på en mikromanipulator som beskrevet i trin 3.4. Juster mikromanipulatoren for at placere nålen i en vinkel på 45°.
- Bedøve zebrafisk larver nævnt i trin 3.1. Når larverne holder op med at bevæge sig, overføres dem til rillen i en mikrogavageskimmel ved hjælp af en Pasteur pipette.
- Placer et fald på 0,8% lav smeltende agarose på zebrafisk larver til at dække. Juster forsigtigt larver med hoveder, der vender opad ved 45° vinkler i rillen og halerne mod rillens væg. Sørg for, at hovedernes vinkler er omtrent de samme, så de flugter med sondenålenes vinkel. Placer mikrogavage skimmel på is i 30-60 s, så den lave smeltende agarose at størkne for at stabilisere placeringen af larverne.
- Tiljuster injektionstrykket mellem 200-300 hPa. Indstil injektionstiden til 0,1-0,3 s for at opnå et injektionsvolumen på 3-5 nL C. difficile.
- Forsigtigt betjene nålen gennem agarose derefter ind i munden af zebrafisk larver, gennem spiserøret. Når spidsen af nålen er inde i den terior tarmpære, skal du trykke på injektionspedalen for at frigive bakterierne. Fyld lumen af tarmen med den leverede volumen. Lad det ikke flyde fra spiserøret eller cloaca. Træk forsigtigt nålen ud af zebrafiskens mund.
- Efter sonde, redde de inficerede zebrafisk larver fra agarose med en fleksibel mikrolæsser spids ved først at skære agarose væk derefter ved at løfte larver. Overfør disse larver til sterile 30% Danieau's medium. Skyl larverne i sterilt medium to gange. Overfør larver til en frisk 10 cm petriskål. Larverne vil blive vedligeholdt i op til 11 dpf.
6. Konfokal mikroskopi analyse af injicerede zebrafisk larver
- Bedøve zebrafisk larver henvist til trin 3.1. Lav et hul i bunden af en 35 mm petriskål med et glasdias fastgjort til hullet, benævnt billedkammeret. Overfør embryoner til bunden af billedkammeret med en tilstrækkelig mængde på 30% Danieaus medium.
- Der tilsættes 200-300 μL 1% lav smeltende agarose til at dække de bestøvede larver. Da der anvendes et omvendt konfokalmikroskop, skal den inficerede region af larverne placeres så tæt som muligt.
- Lad agarose størkne på is i 30-60 s. Nedsænk agarose med 30% Danieau's indeholder 0,02% -0,04% tricaine.
- Billede larver med en konfokal laser scanning mikroskop(Tabel over materialer).
7. Dissektion af Larval Zebrafish Tarm til at inddrive levedygtige C. difficile
- Isoler mave-tarmkanalen fra larver til at analysere bakteriel belastning. Start med at aflive zebrafisklarver med 0,4 % tricain.
- Skyl zebrafisken kort med steril 1x PBS og overfør dem til en frisk agaroseplade.
- Dissektion af zebrafisk
- Sæt en nål ind i blækspruttestammen af zebrafisklarver tæt på hovedet for at immobilisere zebrafisken. Fjern hovedet bag gællerne med en lancet.
- Sæt den anden nål ind i midten af dorsalstammen. Sæt den tredje nål ind i maven af zebrafisk og træk tarmen ud af kroppenhulen.
BEMÆRK: Der er behov for ekstrem forsigtighed for at isolere den intakte tarm. Hvis det er vanskeligt at gøre det, udføre yderligere trækker til at adskille resten af tarmen fra de resterende indre organer. - Brug en mikroinjektionsnål til at overføre 10-15 tarme til et 1,5 ml rør, der indeholder 200 μL sterilt 1x PBS.
- Homogeniser tarmene med en støder for at forstyrre vævet og forberede homogenater. Sørg for, at støderen når bunden af røret for at forstyrre alle tarme helt.
- Inkuber homogenaterne i C. difficile opdrætsmedium, der indeholder D-cycloserin og cefoxitin, med eller uden taurocholate (TCA, et spiremiddel af C. difficile sporer) i et anaerobkammer.
- Inkuber pladen anaerobt i 48 timer ved 37 °C.
- Brug bakteriekultur til 16S rRNA-PCR.
- Opslæm en koloni i 50 μL H2O og kog den ved 95 °C i 15 min. Pellet af lysed snavs ved centrifugering (14.000 rpm for 2 min på RT) og bruge 2 μL af supernatantsom skabelon i 25 μL PCR-reaktion ved hjælp af C. difficile-specifikkeprimere (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'. Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
- Når bakterier fra flydende kultur anvendes, høst 1 ml kultur og vask en gang med 1 ml PBS (14.000 rpm i 2 min på RT). Pelleten skal opslæs igen i 100 μL h2Odd og behandles som udført ovenfor. For yderligere at karakterisere bakteriekolonier, stribe på en BHIS- eller chromID-plade (Tabel over materialer).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. difficile er strengt anaerob, men kromofa af fluorescerende proteiner kræver normalt ilt til at modnes. For at løse dette problem, en fluorescerende farvestof blev brugt til at plette levende C. difficile celler, der var aktivt voksende (R20291, en ribotype 027 stamme; Figur 1A). Ved hjælp af Gal4/UAS-systemet blev der genereret stabile transgene zebrafisklinjer til levende billeddannelse, hvor mpeg1.1 eller lyZ-initiativtagerne drev udtrykket EGFP fluorescerende protein i makrofager og neutrofiler (henholdsvis) på en Gal4-afhængig måde.
Den farvede C. difficile blev injiceret i zebrafisk tarmkanalen ved 5 dpf, og de inficerede steder blev afbildet efter 1 time inkubation. Time-lapse imaging viste, at både neutrofiler og makrofager nåede infektionsstederne(figur 1B),og antallet af disse to medfødte immunceller steg, indtil C. difficile blev ryddet. Clearing opstod ved fagocytose og fordøjelse af de mærkede C. difficile. Figur 1C viser, at en aktiveret makrofag phagocytis to C. difficile bakterier (se Supplerende Film 1).
Figur 1: Farvning og infektion af C. difficile hos zebrafisk. (A) Fluorescerende mærket C. difficile bakterier i inficerede zebrafisk efter mikroinjektion. Skalabar = 5 μm. (B) Konfokal Z-stack projektion, der viser grønne fluorescerende neutrofiler i dobbelt transgene zebrafisk Tg (lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 akkumuleret ved C. difficile infektionsstedet ved 2 h efter infektion (hpi). Neutrofiler vises med grønt og C. difficile med rødt. Skalabar = 50 μm. (C) Konfokal tidsforfaldsbilleddannelse, der viser GFP-mærket makrofager, der fagocytoserende rød fluorescerende farveC. difficile. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Selv om mikroinjektion er den mest almindelige metode til at inficere zebrafisk larver med patogener, denne metode altid forårsager vævsskader, som kan påvirke eksperimentelle resultater. For at undgå dette problem blev mikrogavage brugt til at levere fluorescensmærket C. difficile i tarmlumen af makrofag og neutrofile reporterlinjer ved 5 dpf, som efterligner CDI's naturlige vej (figur 2A). Neutrofiler og makrofager viste imidlertid ikke tydelig migration til mave-tarmkanalen i op til 12 timer efter mikrogavage (figur 2B). I mellemtiden forsvandt fluorescensen af mærket C. difficile efter ca. 5 h post-microgavage, sandsynligvis på grund af enten 1) enzymatisk destruktion, 2) uhensigtsmæssige pH-niveauer i tarmen af zebrafisk, eller 3) udbrud af spore dannelse og ledsagende membranændringer i bakterier (figur 2B). Derfor blev der etableret en tarmdissektionsmetode til påvisning af C. difficile.
Figur 2: Mikrogavage af zebrafisklarver med C. difficile. A) Repræsentativt billede af zebrafisklarver ved 5 dpf gavaged med fluorescensplettet C. difficile. Billedet blev optaget omkring 3 timer efter gavage, der viser, at C. difficile var til stede i den bageste tarm af zebrafisk. Skalabjælke = 100 μm. (B) Konfokal tidsforfaldsbilleddannelse, der viser makrofagsmotilitet. Dobbelt transgene zebrafisk larver Tg (mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 ved 5 dpf blev givetaged med fluorescensmærket C. difficile. Konkal tid-lapse imaging blev udført for op til 12 h. Skala bar = 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
For at bekræfte, om C. difficile var i stand til at bebo zebrafisk, zebrafisk tarme blev adskilt på forskellige tidspunkter efter gavage. Derefter blev de isolerede tarme homogeniseret med plastskadedyr, og homogenater blev inkuberet i C. difficile medium indeholdende D-cycloserin og cefoxitin, med eller uden TCA. Men, aktivt voksende C. difficile celler blev kun opdaget op til 24 h post-infektion både med og uden TCA (data ikke vist). Det spekuleres, at de indfødte mikrobielle samfund i konventionelle larver forhindret C. difficile invasion på grund af deres kolonisering modstand.
Gnotobiotiske zebrafisk larver blev også brugt. Tarmprøver 24 hki blev dissekeret og viste bakterievækst i medium med TCA eller uden TCA, mens ingen bakterier voksede i kontrolgruppen (figur 3A). Men på senere tidspunkter (dvs. 48 hpi, 72 hpi, og 120 hki) inkuberede prøver kun voksede i mediet indeholder TCA, hvilket tyder på, at den samlede C. difficile i tarmen havde dannet sporer (Figur 3B). Dette giver en mulig forklaring på tabet af fluorescens mærkning.
16S rDNA PCR blev derefter brugt til at identificere de dyrkede bakterier som C. difficile, som producerede specifikke PCR amplicons af forudsigelig størrelse (~ 800 bp; Figur 3C). Dette resultat blev yderligere verificeret ved sekvensering af disse PCR-produkter. Bagefter blev bakteriekulturer spredt på en BHIS-plade. Flere enkeltkolonier blev derefter overført til en chromID-plade, som kun understøttede C. difficile vækst. Bakterierne fremstod som typiske sorte kolonier, hvilket yderligere viste, at bakterier fra zebrafisktarmene var C. difficile (figur 3D).
Figur 3: Påvisning af C. difficile i zebrafisktarmen efter infektion. For hvert af de uafhængige forsøg, 15-20 gnotobiotiske zebrafisk larver ved 5 dpf blev inficeret med 3-5 nL af 108 CFUs/ml C. difficile eller PBS som en negativ kontrol ved microgavage. (A) Homogenaterne af dissekeret tarme blev dyrket. Bakterier voksede i mediet, der indeholder TCA 72 h efter infektion af gnotobiotiske zebrafisk larver (1, ikke-inficeret kontrolgruppe; 2, R20291-inficeret zebrafisk; n = 3). (B) Skematisk illustration af de samlede forsøgsresultater efter 24 timer, 48 h, 72 h og 120 h efter infektion med C. difficile (n = 3) (C) Bakterielle prøver blev testet af 16S rDNA PCR ved 72 h efter mikrogavage (1, ikke-inficeret kontrolgruppe; 2, R20291-inficeret zebrafisk; n = 3). D) C. difficiles vækst på kroromaplader bemærk den sorte farve C. difficile, som er en funktion af disse plader (n = 3). Klik her for at se en større version af denne figur.
Supplerende film 1. Klik her for at se denne fil (højreklik for at downloade).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fremlagte metoder ændrer og udvider en eksisterende tilgang til at inficere zebrafisklarver ved at udføre både injektion og mikrogavage10,14. Det viser også en tilgang til at studere anaerobe patogener med zebrafisk larver22. Desuden letter protokollen analysen af medfødte immuncellereaktioner in vivo på CDI og ved kolonisering af C. difficile i zebrafisk. Metoden er reproducerbar og nem at udføre i et rutinemæssigt laboratorium eller klinisk miljø.
For at overvåge fagocytose af C. difficile af leukocytter, to stabile transgene zebrafisklinjerblev anvendt (f.eks. På grund af det anaerobe miljø, der er nødvendig for væksten af C. difficile, genetiske værktøjer til at spore C. difficile er begrænset. Selv om en codon-optimeret mCherryOpt er blevet rapporteret til at mærke dem, C. difficile bakterier skal fastsættes, før udviser fluorescens før dens anvendelse i live imaging indstillinger13. Derfor blev et fluorescerende farvestof brugt her til at plette levende C. difficile med rød fluorescens, som kan kombineres med de mange tilgængelige grønne fluorescerende transgene zebrafiskstammer. Denne metode kan nemt anvendes på andre intestinale anaerobe bakterier, såsom Bacteroides fragilis og Helicobacter hepaticus. De repræsentative resultater viser, at både neutrofiler og makrofager kan genkende og fagocytose C. difficile i inficerede zebrafisk.
Både nedsænkning og mikroinjektion metoder er blevet regelmæssigt brugt til at inficere zebrafisk20,21,22. Ved hjælp af nedsænkning metoder er ligetil, men denne tilgang gør det vanskeligt præcist at kontrollere invasion tid af bakterier i tarmen. Microinjection er den mest almindelige metode til at inficere zebrafisk embryoner med patogener, men det altid forårsager vævsskader. Derfor, microgavage blev brugt til at efterligne den naturlige infektion rute.
Men det blev konstateret, at farvestof-farvede C. difficile blev målbart omkring 5 timer efter microgavage. Årsagerne hertil er i øjeblikket uklare, men kan være relateret til enten 1) intolerans af fluorophore under tarmbetingelser eller 2) indledning af spore dannelse af C. difficile celler. Det blev endvidere konstateret, at C. difficile ikke kunne påvises i kulturen med hellarverhomogenater. Derfor blev tarmen af hver inficeret zebrafisk dissekeret derefter dyrket for at afgøre, om C. difficile stadig beboede tarmvæv af zebrafisk.
På grund af den indfødte mikrobiota af konventionelle mus, kun mus forbehandlet med en antibiotisk cocktail eller gnotobiotiske mus er modtagelige for C. difficile16. Ligeledes blev det konstateret, at C. difficile kun blev opdaget i tarmene af gnotobiotiske zebrafisk, men ikke i konventionel vildtype zebrafisk 24 h efter infektion. Interessant, tarm prøver af 48 h, 72 h, og 120 h post-infektion zebrafisk kun voksede i medier, der indeholder TCA. Som beskrevet ovenfor stimulerer TCA C. difficile spore spiring in vitro. Dette resultat tyder på, at aktive C. difficile celler allerede dannet vegetative sporer i zebrafisk tarmen, og spore-afledte kolonier blev opdaget ved hjælp af microgavage tilgang.
Interessant, kim-fri zebrafisk stadig ikke præsentere nogen symptomer på CDI, såsom intestinal neutrofile tilstrømning eller endda død zebrafisk. Dette viser, at infektion ved injektion kan aktivere medfødte immunceller ved at såre, og at kun aktiverede makrofager og neutrofiler er i stand til hurtigt at opdage C. difficile. Desuden er en sandsynlig forklaring på manglen på fremtrædende CIU hos zebrafisk baseret på de strukturelle forskelle mellem zebrafisk og pattedyrtarme17. Zebrafisktarmen mangler tarmkrypter, hvor C. difficile ofte er placeret18. Sammen med zebrafiskens lavere vedligeholdelsestemperatur i forhold til zebrafiskens i pattedyr blev det udledt, at starten af CDI i zebrafisk ikke forekommer så hurtigt som i pattedyrmodeller. Men to anaerobe bakterier af den menneskelige mikrobiota, Lactobacillus paracasei og Eubacterium limosum, har vist sig at vokse inde i zebrafisk gut19. De tekniske fremskridt, der præsenteres her, vil tilskynde anvendelser af denne metode til at studere C. difficile og andre bakterier eller patogener stammer fra pattedyr tarmen i molekylært tractable zebrafisk larver in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for Timo Fritsch for fremragende dyrepleje. Vi takker medlemmerne af Köster og Steinert labs for støtte og nyttige diskussioner. Vi takker dr. Dandan Han for kritisk læsning af manuskriptet. Vi anerkender taknemmeligt finansieringen fra forbundsstaten Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of Zebrafish Larvae. Journal of Visualized Experiments. (72), e4434 (2013).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
