Summary
Представленный здесь безопасный и эффективный метод заражения личинок зебры флуоресцентно помечены анаэробных C. difficile микроинъекции и неинвазивных микрогаважа.
Abstract
Clostridioides difficile инфекции (CDI) считается одним из наиболее распространенных медицинских связанных желудочно-кишечных инфекций в Соединенных Штатах. Врожденный иммунный ответ против C. difficile был описан, но точные роли нейтрофилов и макрофагов в CDI менее понятны. В текущем исследовании, Личинки Данио рерио (зебрафиш) используются для создания модели C. difficile инфекции для визуализации поведения и сотрудничества этих врожденных иммунных клеток in vivo. Для мониторинга C. difficileустановлен протокол маркировки с использованием флуоресцентного красителя. Локализованная инфекция достигается путем микроинъекций с пометкой C. difficile, которая активно растет в желудочно-кишечном тракте зебры и имитирует повреждение эпителиального кишечника в CDI. Однако, этот прямой протокол инфекции является инвазивным и вызывает микроскопические раны, которые могут повлиять на экспериментальные результаты. Таким образом, здесь описан более неинвазивный протокол микрогаважа. Метод включает в себя доставку C. difficile клеток непосредственно в кишечнике личинок зебры путем интубации через открытый рот. Этот метод инфекции тесно имитирует естественный путь инфекции C. difficile.
Introduction
C. difficile является грамположительный, спорообразующих, анаэробных и токсинопроизводящих бацилл, что является основной причиной тяжелых инфекций в желудочно-кишечном тракте1. Типичные симптомы CDI включают диарею, боли в животе, и смертельный псевдомембранный колит, и это иногда может привести к смерти1,2. Фактические данные показали, что иммунные реакции хозяина играют решающую роль как в прогрессировании, так и в исходе этого заболевания3. В дополнение к иммунному ответу, коренная микрофлора кишечника имеет решающее значение для начала и патогенеза CDI4. За последнее десятилетие, как число случаев заболевания, так и смертность от CDI значительно возросли из-за появления гипервирулентного штамма C. difficile (BI/NAP1/027)5,6. Более глубокое понимание основных иммунных механизмов и роли микробиоты во время CDI поможет привести к новым терапевтическим изменениям и достижениям, что позволит лучше контролировать эту эпидемию.
Несколько животных моделей, таких как хомяк и мышь, были разработаны, чтобы обеспечить понимание иммунной защиты от C. difficile7,8. Тем не менее, роль врожденных иммунных клеток все еще плохо понимается, тем более, что врожденное поведение иммунных клеток в основном происходит от гистологического анализа или культивированных клеток in vitro. Таким образом, создание прозрачной модели зебры, чтобы выявить врожденный иммунный ответ на C. difficile внутри живого позвоночного организма будет способствовать таким исследованиям. Личинки зебрафиш имеют функциональную врожденную иммунную систему, но им не хватает адаптивной иммунной системы до 4-6 недель после оплодотворения9. Эта уникальная особенность делает личинки зебры отличной моделью для изучения изолированной реакции и функции врожденных иммунных клеток в CDI.
В настоящем докладе описаны новые методы использования личинок зебры для изучения взаимодействий между C. difficile и врожденными иммунными клетками, такими как макрофаги и нейтрофилы. Во-первых, представлен локализованный протокол микроинъекций, который включает C. difficile inoculum и окрашивание. При использовании in vivo конфокальной визуализации покадровой прослеживание, реакция нейтрофилов и макрофагов на место заражения фиксируется, а также наблюдается фагоцитоз бактерий нейтрофилов и макрофагов. Тем не менее, было сообщено, что сама инъекция вызывает повреждение тканей и приводит к набору лейкоцитов независимо от бактерий10. Таким образом, неинвазивный протокол микрогаважа для доставки C. difficile в кишечнике личинок зебры впоследствии описывается. Предыдущие исследования показали, что коренная микрофлора желудочно-кишечного тракта защищает хозяина от колонизации C. difficile11. Таким образом, гнотобиотические личинки зебры также используются для предрасположенности зебры, которые инфицированы 12. После этого проводится вскрытие кишечника для восстановления жизнеспособного C. difficile и проверки продолжительности их присутствия в желудочно-кишечных трактах зебры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все описанные здесь работы на животных выполнялись в соответствии с правовыми нормами (EU-Directive 2010/63, лицензия АЗ 325.1.53/56.1-TUBS и лицензия АЗ 33.9-42502-04-14/1418).
1. Подготовка низкорасплавляющихся агароуз, гель плиты, и микроинъекции / микрогаважских игл
- Растворите 0,08 г низкорасплавляющей агарозы(Таблица материалов,агароз a2576) в 10 мл 30% средней Данио (0,12 мМ MgSO4, 0,18 мм Ca No32), 0,21 мМ ККЛ, 1,5 мМ HEPES (pH 7.2), и 17.4 mM NaCl, хранящийся при комнатной температуре (RT) для получения раствора 0,8%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокие или более низкие концентрации агарозы могут быть использованы. Тем не менее, необходимое время для затвердевк варьируется для различных марок агарозы, даже при той же концентрации. - Подготовка микроинъекций и микрогавагии иглы из стеклянных капилляров(Таблица материалов).
- Используйте выдвижной микропайпот со следующими настройками (обратите внимание, что единицы специфичны для шкива, используемого здесь; см. Таблица Материалов):иглы микроинъекций (давление воздуха 500; тепло 400; тянуть 125; скорость 75; время 150); и иглы микрогаважа (давление воздуха - 500; тепло 400; тяга 100; скорость - 75; время - 150). Используйте наконечник микрозагрузчика, чтобы загрузить 3 Зл нуклеазы без H2O в вытащил иглы.
- Введите иглу в инжектор и закрепите его должным образом. Отрегулируйте иглу под подходящий угол для инъекций. Установите давление инъекций между 600-900 hPa для микроинъекционной иглы и 200-300 hPa для gavage иглы.
- Поместите каплю минерального масла на черный круг калибровочной горки. Используйте тонкие щипцы, чтобы обрезать кончик иглы. Введите одну каплю в минеральное масло, чтобы измерить размер капли.
- Для микроинъекции отрегулируйте время впрыска, чтобы получить капельку диаметром 0,10-0,12 мм, что равно объему 0,5-1,0 нл. Для микрогаважа получите капельку диаметром 0,18-0,20 мм, что равно объему 3-5 нл.
- Подготовка 1,5 % агарозной пластины с агарозом(Таблица материалов, 8050) в 10 см Петри блюдо в 30% Данио среды с помощью пластиковой формы, как микрогавадж формы. Хранить при 4 градусах по Цельсию, чтобы предотвратить высыхание до тех пор, пока это необходимо. Теплый до RT или 28 градусов по Цельсию до начала эксперимента.
2. Подготовка и маркировка C. difficile и спор с флуоресцентным красителем
- Подготовьте 1 мМ бульонный раствор флуоресцентного красителя(Таблица материалов). Поскольку краситель продается в 50 мкг аликвотов порошка, добавьте 69 мл DMSO в флакон, чтобы получить концентрацию запасов 1 мМ.
- Подготовьте рабочий раствор флуоресцентного красителя мощностью 100 км флуоресцентного красителя, добавив 2 л 1 мМ бульонного раствора к 18 л DMSO в центрифуге трубки, и хорошо перемешайте.
- Культура C. difficile (R20291, штамм риботипа 027) путем прививки 10 мл жидкой среды BHIS с двумя-тремя колониями из пластины в анаэробном капюшоне, не тряся на ночь. BHIS является BHI дополнен0,5% (w/v) дрожжевой экстракт и 0,1% (w/v) L-цистеин. Растворите 1 г L-цистеина в 10 мл ddH2O и стерилизуйте путем фильтрации, затем добавьте к автоклавизированной среде, чтобы получить окончательную концентрацию 1 г/л. Плиты готовятся путем добавления 15 г/л агар-агара к среде перед автоклавированием. Селективная культивирование C. difficile осуществляется с помощью хромидных C. difficile пластин (Таблица материалов).
- Окрашивание C. difficile с флуоресцентным красителем
- Урожай C. difficile при ОД600 1,0-1,2 и мыть 1x с 1 мл 1x PBS (5000 х г в течение 3 мин на RT). Приостановить в 1 мл 1 х PBS.
- Добавьте 3 зл и сто рабочий раствор флуоресцентного красителя в 1 мл суспензии бактерий. Инкубировать образец в течение 15 минут на RT в темноте. Вымойте окрашенные C. difficile один раз с 1 мл PBS для удаления остаточного красителя и resuspend в 1x PBS до OD600 из 1,0 (1,0 OD600 примерно эквивалентно 108 cfu/mL).
3. Инъекции окрашенных C. difficile в личинки зебрафиш
- Анестезия 20-30 личинки зебры в 5 дней после оплодотворения (называется здесь как 5 dpf) с 0,02%-0,04% трикаин (трикаин порошок растворяется в двойной дистиллированной воды и скорректированы до рН No 7 с 1 M Tris-HCL решение) в 30% Данио в среднем до 10 мин Инъекций. Перенесите обезопаренные личинки в свежее блюдо Петри высотой 10 см и удалите излишки 30% среды Данио.
- Поместите падение 0,8% низкой плавления агарозы на личинки зебры, чтобы покрыть. Аккуратно отрегулируйте личинки в боковое положение. Поместите чашку Петри на лед в течение 30-60 с, чтобы позволить низкой таяния агарозы затвердеть. Добавьте 30% среды Данио, содержащей 0,02%-0,04% трикаин для покрытия агарозы.
- Подготовьте раствор для инъекций. Добавьте 1 зл 0,5% фенола красного цвета в растворе PBS в 9 л окрашенных красителями C. difficile inoculum, чтобы визуализировать процесс инъекций.
- Загрузите откалиброванные микроинъекционные иглы с помощью инъекционного раствора с помощью микрозагрузчика. Установите заряженную иглу на микроманипулятор и расположите ее под стереомикроскопом.
- Отрегулируйте давление инъекций между 600-900 hPa. Установите время инъекции до 0,1-0,3 с, чтобы получить 0,5-1,0 нл. Установите иглу в микроманипулятор под углом 45 градусов, указывая на встроенные личинки.
- Поместите кончик иглы над желудочно-кишечным трактом близко к урогенитальной поре. Прокалывая через агарозу затем мышцы с кончиком иглы, а затем вставить его в просвет кишечника и вводить 0,5-1,0 нл C. difficile. Используйте флуоресцентный микроскоп для мониторинга инъекционных личинок и подобрать правильно вводили личинки для конфокальной визуализации.
4. Поколение гнотобиотиков червей зебрафиш
- Используйте устоявшийся метод естественного размножения для генерации гноотобиотических эмбрионов зебры, в том числе: экстракорпоральное оплодотворение, промывка с антибиотикосодержащей средой (1 мкг/мЛ амфотерицина В, 10 мкг/мл канамицин, и 20 мкг/мл ампициллин), промывание с 0,1% wt/vol поливинил пирролидон-йод (PVP-I) раствор, и инкубация эмбриона в клетке.
- Поддерживать все гнотобиотические личинки зебры в гнотобиоических условиях до 5 dpf или непосредственно перед gavage. После гаважа личинки зебры будут переданы в стандартный инкубатор, но со стерильным 30% среды Данио.
5. Гаваж из личинки зебрафиш
- Калибровать иглу микрогаважа, как описано в шаге 1.2.
- Измерьте диаметр кончика иглы, поместив иглу на калибровочной горке с одной каплей минерального масла. Убедитесь, что наконечник 30-40 мкм в диаметре, тупой и гладкой. Откажитесь от острых или грубых игл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Острые края иглы могут быть притуплены быстрым пылающим. - Подготовьте решение gavage, как описано в шаге 3.3.
- Загрузите и установите иглу на микроманипулятор, как описано в шаге 3.4. Отрегулируйте микроманипулятор, чтобы расположить иглу под углом 45 градусов.
- Анестезия личинок зебры, упомянутых в шаге 3.1. Когда личинки перестанут двигаться, перенесите их в паз микрогаважа с помощью пипетки Pasteur.
- Поместите падение 0,8% низкой плавления агарозы на личинки зебры, чтобы покрыть. Аккуратно отрегулируйте личинки головками, обращенными в вертикальное, под углом 45 градусов в пазе и хвостами к стене канавки. Убедитесь, что углы головок примерно одинаковы, чтобы они были выровнены под углом иглы gavage. Поместите форму микрогаважа на лед на 30-60 с, что позволяет низкоплавающей агарозы затвердеть, чтобы стабилизировать позиции личинок.
- Отрегулируйте давление инъекций между 200-300 hPa. Установите время инъекции до 0,1-0,3 с, чтобы получить объем инъекции 3-5 nL C. difficile.
- Аккуратно работать иглы через агарозу затем в рот личинки зебры, через пищевод. После того, как кончик иглы находится внутри передней кишечной лампы, нажмите на педаль инъекций, чтобы освободить бактерии. Заполните просвет кишечника с доставленным объемом. Не позволяйте ему перетекать из пищевода или клоаки. Аккуратно вынять иглу из уст зебры.
- После gavage, спасти инфицированных личинок зебры из агарозы с гибкой микропогрузчик отзыв, сначала резки агарозы прочь, то, подняв личинки. Перенесите эти личинки в стерильную 30% среды Данио. Промыть личинки в стерильной среде в два раза. Перенесите личинки в свежее 10 см чашку Петри. Личинки будут поддерживаться до 11 dpf.
6. Конфокальная микроскопия Анализ инъекционных личинки зебрафиш
- Анестезия личинки зебры относится к шагу 3.1. Сделайте отверстие в нижней части 35 мм Петри блюдо со стеклянной горкой прилагается к отверстию, называется камеры изображения. Перенос эмбрионов на дно камеры изображения с достаточным количеством 30% среды Данио.
- Добавьте 200-300 л из 1% низкоплавленной агарозы, чтобы покрыть анестезированные личинки. Так как используется перевернутый конфокальный микроскоп, поместите зараженную область личинок к стеклянной горке как можно ближе.
- Пусть агароуз затвердеет на льду на 30-60 с. Погрузите агароз у 30% Данио, содержащего 0,02%-0,04% трикаин.
- Изображение личинок с конфокального лазерного сканирования микроскопа(Таблица материалов).
7. Рассечение кишечника Larval Зебрафиш для восстановления жизнеспособного C. difficile
- Изолировать желудочно-кишечные тракты от личинок для анализа бактериальной нагрузки. Начните с эвтаназии личинок зебры с 0,4% трикаина.
- Промыть зебры кратко стерильной 1x PBS и передать их в свежей пластине агарозы.
- Рассечение зебры
- Вставьте иглу в ствол доза личинок зебры близко к голове, чтобы обездвижить зебры. Снимите голову за жабры с ланцетом.
- Вставьте вторую иглу в середину туловища. Вставьте третью иглу в брюшную полость зебры и вытащите кишечник из полости тела.
ПРИМЕЧАНИЕ: Крайняя осторожность необходима для изоляции нетронутой кишечника. Если это трудно сделать, выполнить дополнительные тянет, чтобы отделить остальную часть кишечника от остальных внутренних органов. - Используйте иглу микроинъекции для передачи 10-15 кишечника в трубку 1,5 мл, содержащую 200 л стерильных 1x PBS.
- Гомогенизировать кишечник с пестиком, чтобы нарушить ткани и подготовить гомогенаты. Убедитесь, что пестик достигает нижней части трубки, чтобы нарушить все кишечника полностью.
- Инкубировать гомогенаты в C. difficile воспитания среды, содержащей D-циклоцерин и цефокситин, с или без таурохолата (TCA, зародышевой C. difficile спор) в анаэробной камере.
- Инкубировать пластину анаэробически в течение 48 ч при 37 градусах Цельсия.
- Используйте бактериальную культуру для 16S rRNA-PCR.
- Приостановите колонию в 50 л H2O и варите ее при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 15 мин. Пеллетли лисиченые обломки центрифугации (14000 об/мин в течение 2 мин на RT) и использовать 2 злицу супернатанта в качестве шаблона в 25 ЗЛ ПЦР-реакции с использованием C. difficile-специфическихпраймеров (Cdiff16Sfw: 5' GTG AGC CAG TAC AGG 3'; Cdiff16Srev: 5' TTA AGG AGA TGT CAT TGG 3').
- При использовании бактерий из жидкой культуры, урожай 1 мл культуры и мыть один раз с 1 мл PBS (14000 об/мин в течение 2 мин на RT). Приостановите гранулы в 100 Л H2Odd и обработайте, как это делается выше. Для дальнейшей характеристики бактериальных колоний, полоса на BHIS- или хромид-пластины(Таблица материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. difficile строго анаэробный, но хромофор флуоресцентных белков обычно требует кислорода, чтобы созреть. Чтобы преодолеть эту проблему, флуоресцентный краситель был использован для окрашива тькоцита C. difficile клеток, которые активно росли (R20291, штамм риботипа 027; Рисунок 1А). Используя систему Gal4/UAS, были созданы стабильные трансгенные линии зебры для живой визуализации, в которой промоутеры mpeg1.1 или ly' управляли выражением флуоресцентного белка EGFP в макрофагах и нейтрофилах (соответственно) зависимым от Gal4 образом.
Окрашенные C. difficile был введен в кишечном тракте зебры на 5 dpf, и инфицированных сайтов были изображены после 1 ч инкубации. Time-lapse изображений показали, что как нейтрофилы и макрофаги достигли инфекции сайтов(Рисунок 1В), и число этих двух врожденных иммунных клеток увеличилось до тех пор, пока C. difficile был очищен. Очистка произошла при фагоцитозе и пищеварении помеченных C. difficile. Рисунок 1C показывает, что активированный макрофаг фагоцитированных двух Бактерий C. difficile (см. Дополнительный фильм 1).
Рисунок 1: Окрашивание и заражение C. difficile у зебры. (A) Флуоресцентно помечены C. difficile бактерий в инфицированных зебрафиш после микроинъекции. Шкала бар No 5 мкм. (B) Confocal й-стек проекции показаны зеленые флуоресцентные нейтрофилы в двойной трансгенной зебры Tg (лик: KalTA4)bz17/Tg (4xUAS-E1b: EGFP)hzm3 накопленных на C. difficile инфекции сайта на 2 ч после инфекции (hpi). Нейтрофилы показаны зеленым цветом, а C. difficile красным цветом. Шкала бар 50 мкм. (C) Confocal промежуток времени изображения, показывающие GFP-маркированных макрофагов фагоцитозных красных флуоресцентных окрашенных C. difficile. Шкала бар 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Хотя микроинъекция является наиболее распространенным методом заражения личинок зебры патогенными микроорганизмами, этот метод неизменно вызывает повреждение тканей, что может повлиять на экспериментальные результаты. Чтобы избежать этой проблемы, микрогаваж был использован для доставки флуоресценции помечены C. difficile в кишечных просвет макрофаг и нейтрофил репортер линий на 5 dpf, который имитирует естественный путь CDI (Рисунок 2A). Однако нейтрофилы и макрофаги не показали очевидной миграции в желудочно-кишечный тракт на срок до 12 ч после микрогаважа(рисунок 2В). В то же время, флуоресценция помечены C. difficile исчезли после примерно 5 ч после микрогважа, вероятно, из-за либо 1) ферментативного разрушения, 2) неуместные уровни рН в кишечнике зебры, или 3) начало образования прерывий и сопутствующих мембранных изменений в бактериях(Рисунок 2B). Таким образом, метод вскрытия кишечника был создан для обнаружения C. difficile.
Рисунок 2: Микрогаваж личинок зебры с C. difficile. (A) Представитель изображение личинок зебры на 5 dpf gavaged с флуоресценцией окрашенных C. difficile. Изображение было записано около 3 ч после gavage, показывая, что C. difficile присутствовали в задней кишки зебры. Шкала бар No 100 мкм. (B) Конфокальный промежуток времени изображения, демонстрирующие подвижность макрофагов. Двойные трансгенные личинки зебры Tg (mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg (4xUAS-E1b)hzm3 при 5 dpf были gavaged с флуоресценцией помечены C. difficile. Конфокальная визуализация покадровой работы была выполнена на срок до 12 ч. Шкала бар 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Чтобы подтвердить, удалось ли C. difficile обитать в зебры, кишечник зебры отделялся в разные временные точки после gavage. Затем изолированные кишечники были однородны пластиковыми пестями, а гомогенаты инкубировались в C. difficile среду, содержащую D-циклоцерин и цефокситин, с или без TCA. Тем не менее, активно растущие C. difficile клетки были обнаружены только до 24 ч после инфекции как с tCA и без (данные не показаны). Предполагается, что коренные микробные сообщества в обычных личинках предотвратили вторжение C. difficile из-за их устойчивости к колонизации.
Также использовались личинки гнотобиотиков зебры. Кишечные образцы 24 hpi были расчленены и показали рост бактерий в среде с TCA или без TCA, в то время как никакие бактерии выросли в контрольной группе(Рисунок 3A). Однако, в более поздние часы (т.е. 48 hpi, 72 hpi, и 120 hpi) инкубированные образцы только вырос в среде, содержащей TCA, который предположил, что общее C. difficile в кишечнике образовались споры(Рисунок 3B). Это дает возможное объяснение потери флуоресценции маркировки.
16S rDNA PCR затем был использован для идентификации выращенных бактерий как C. difficile, который произвел конкретные ампликоны ПЦР предсказуемого размера (800 bp; Рисунок 3C). Этот результат был дополнительно подтвержден путем секвенирования этих продуктов ПЦР. После этого бактериальные культуры были распространены на пластине BHIS. Несколько одиночных колоний после этого были перенесены на хромид-пластину, которая поддерживала только рост C. difficile. Бактерии появились как типичные черные колонии, которые также показали, что бактерии из кишечника зебры были C. difficile (Рисунок 3D).
Рисунок 3: Обнаружение C. difficile в кишечнике зебры после инфекции. Для каждого из независимых экспериментов, 15-20 гнотобиотические личинки зебры на 5 dpf были инфицированы 3-5 nL из 108 CFUs/mL C. difficile или PBS в качестве отрицательного контроля микрогавагов. ( A) Гомогенаты расчлененных кишечника были культивированы. Бактерии росли в среде, содержащей TCA 72 ч после заражения гнотобиотические личинки зебры (1, неинфицированная контрольная группа; 2, R20291-инфицированных зебры; n No 3). (B) Схемаическая иллюстрация общих результатов эксперимента после 24 ч, 48 ч, 72 ч, и 120 ч после инфекции с C. difficile (n No 3) (C) Бактериальные образцы были протестированы 16S rDNA ПЦР на 72 ч пост-микрогаважа (1, неинфицированных контрольной группы; 2, R20291-в zebrafishfected; (D) Рост C. difficile на хромid-пластине; обратите внимание на черный цвет C. difficile, который является особенностью этих пластин (n No 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительный фильм 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть этот файл (Право нажмите, чтобы скачать).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Представленные методы изменить и расширить существующий подход к заражению личинок зебры, выполняя как инъекции и микрогаваж10,14. Он также демонстрирует подход к изучению анаэробных патогенов с личинками зебры22. Кроме того, протокол облегчает анализ врожденных иммунных реакций клеток in vivo на CDI и после колонизации C. difficile у зебры. Метод воспроизводим и прост в проведении в обычной лаборатории или клинической среде.
Для мониторинга фагоцитоза C. difficile лейкоцитами, для визуализации макрофагов (KalTA4: 3: оптимизированный Gal4-variant) были использованы две стабильные трансгенные линии зебры (например, Tg'mpeg1.1: KaltA4)bz17 и визуализация нейтрофилов при пересечении с трансгенным фономTg(4xUz. Из-за анаэробной среды, которая необходима для роста C. difficile, генетические инструменты для отслеживания C. difficile ограничены. Хотя кодон-оптимизированный mCherryOpt было сообщено, чтобы маркировать их, C. difficile бактерии должны быть исправлены до выставки флуоресценции до его использования в настройках живой визуализации13. Таким образом, флуоресцентный краситель был использован здесь, чтобы пятно жить C. difficile с красной флуоресценцией, которые могут быть объединены с многочисленными доступными зелеными флуоресцентными трансгенными штаммами зебры. Этот метод может быть легко применен к другим кишечным анаэробным бактериям, таким как Bacteroides fragilis и Helicobacter hepaticus. Репрезентативные результаты показывают, что как нейтрофилы, так и макрофаги могут распознавать и фагоцитоз C. difficile у инфицированных зебрафиш.
Как погружения и микроинъекции методы регулярно используются для заражения зебры20,21,22. Использование методов погружения является простым, но этот подход делает его трудно точно контролировать время вторжения бактерий в кишечнике. Микроинъекция является наиболее распространенным методом заражения эмбрионов зебры патогенными микроорганизмами, но она неизменно вызывает повреждение тканей. Таким образом, микрогаваж был использован для имитации естественного маршрута инфекции.
Тем не менее, было установлено, что краситель окрашенных C. difficile стал обнаружить около 5 ч после микрогаважа. Причины этого в настоящее время неясны, но могут быть связаны либо с 1) непереносимостью фторфора в кишечных условиях или 2) начало формирования спори цифергеи C. difficile клеток. Кроме того, было установлено, что C. difficile не были обнаружены в культуре цельных личинок гомогенатов. Таким образом, кишечник каждой инфицированной зебры был рассечен, то культивируется, чтобы определить, является ли C. difficile еще населяли кишечной ткани зебры.
Из-за коренных микробиоты обычных мышей, только мыши предварительно обработанные антибиотиком коктейль или гноотобиотических мышей восприимчивы к C. difficile16. Кроме того, было установлено, что C. difficile был обнаружен только в кишечнике гнотобиотической зебры, но не в обычных диких типа зебры 24 ч после инфекции. Интересно, что кишечные образцы 48 ч, 72 ч и 120 ч послеинфекции зебры только вырос в средствах массовой информации, содержащей TCA. Как описано выше, TCA стимулирует C. difficile spore прорастание в пробирке. Этот результат свидетельствует о том, что активные C. difficile клетки уже сформировали вегетативные споры в кишечнике зебры, и споры полученных колоний были обнаружены с помощью микрогаважа подход.
Интересно, что без микробов зебрафиш до сих пор не представляют никаких симптомов CDI, таких как приток нейтрофилов кишечника или даже смерть зебры. Это показывает, что инфекция путем инъекций может активировать врожденные иммунные клетки, ранив и что только активированные макрофаги и нейтрофилы способны быстро обнаружить C. difficile. Кроме того, вероятное объяснение отсутствия видных CDI у зебры основано на структурных различиях между зебрафишами и кишечником млекопитающих17. В кишечнике зебры не хватает кишечных склепов, где C. difficile часто расположены18. Наряду с более низкой температурой обслуживания зебры по сравнению с млекопитающими, было сделать вывод, что начало CDI у зебры происходит не так быстро, как в моделях млекопитающих. Тем не менее, две анаэробные бактерии человеческой микробиоты, Lactobacillus paracasei и Eubacterium лимузин, было доказано, растут внутри кишечника зебры19. Технические достижения, представленные здесь, будут стимулировать применение этого метода для изучения C. difficile и других бактерий или патогенов, полученных из кишечника млекопитающих в молекулярно tractable личинки зебры in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарны Тимо Фричу за отличный уход за животными. Мы благодарим сотрудников лабораторий Кёстер и Штайнерт за поддержку и полезные обсуждения. Мы благодарим доктора Дандана Хана за критическое чтение рукописи. Мы с благодарностью признательны за финансирование со стороны федеральной штата Нижняя Саксония, Nieders'chsisches Вораб (ВВЗН2889).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A2576 | Ultra-low gelling agarose |
| Agarose low-melting (LM) | Pronadisa | 8050 | It is used in agarose plates |
| BacLight Red Bacterial Stain | Thermo Fisher Scientific | B35001 | Fluorescent dye |
| Brain-Heart-Infusion Broth | Carl Roth GmbH | X916.1 | |
| Brass (wild-type) | deficient in melanin synthesis, used to generate stable transgenic lines | ||
| Calcium nitrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | |
| Capillary Glass | Harvard Apparatus | 30-0019 | Injection needles |
| Clostridioides difficile | R20291,, a ribotype 027 strain, TcdA+/TcdB+/CDT+ production | ||
| DMSO | Carl Roth GmbH | A994 | |
| FIJI | open-source platform | Image processing | |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 6763 | |
| Horizontal needle puller | Sutter instrument Inc | P-87 | |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | 168149 | |
| Leica Application Suite X (LAS X) | Leica | Image processing | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | P026 | |
| Micro injector | eppendorf | 5253000017 | |
| Microinjection molds | Adaptive Science Tools | TU1 | |
| Leica SP8 confocal microscope | Leica | ||
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Potassium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 5346 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265 | |
| Taurocholate | Carl Roth GmbH | 8149 | |
| Tg(lyZ: KalTA4)bz17/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the lyZ promoters drive the expression of EGFP fluorescent protein in neutrophils | ||
| Tg(mpeg1.1: KalTA4)bz16/Tg(4xUAS-E1b:EGFP)hzm3 | stable transgenic line in which in which the mpeg1.1 drive the expression of EGFP fluorescent protein in macrophages | ||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| Yeast extract | BD Bacto | 212750 |
References
- Rupnik, M., Wilcox, M. H., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection: new developments in epidemiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 7, 526-536 (2009).
- Yang, Z., et al. Mechanisms of protection against Clostridium difficile infection by the monoclonal antitoxin antibodies actoxumab and bezlotoxumab. Infection and Immunity. 83, 822-831 (2015).
- Kelly, C. P., Kyne, L. The host immune response to Clostridium difficile. Journal of Medical Microbiology. 60, 1070-1079 (2011).
- Britton, R. A., Young, V. B. Interaction between the intestinal microbiota and host in Clostridium difficile colonization resistance. Trends in Microbiology. 20, 313-319 (2012).
- Goorhuis, A., et al. Emergence of Clostridium difficile Infection Due to a New Hypervirulent Strain, Polymerase Chain Reaction Ribotype 078. Clinical Infectious Diseases. 47, 1162-1170 (2008).
- Pépin, J., et al. Emergence of fluoroquinolones as the predominant risk factor for Clostridium difficile-associated diarrhea: a cohort study during an epidemic in Quebec. Clinical Infectious Diseases. 41, 1254-1260 (2005).
- Merrigan, M. M., Sambol, S. P., Johnson, S., Gerding, D. N. Prevention of Fatal Clostridium difficile -Associated Disease during Continuous Administration of Clindamycin in Hamsters. The Journal of Infectious Diseases. 188, 1922-1927 (2003).
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122, 1-12 (2014).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
- Theriot, C. M., Young, V. B. Interactions Between the Gastrointestinal Microbiome and Clostridium difficile. Annual Review of Microbiology. 69, 445-461 (2015).
- Pham, L. N., Kanther, M., Semova, I., Rawls, J. F. Methods for generating and colonizing gnotobiotic zebrafish. Nature Protocols. 3, 1862-1875 (2008).
- Ransom, E. M., Ellermeier, C. D., Weiss, D. S. Use of mCherry red fluorescent protein for studies of protein localization and gene expression in Clostridium difficile. Applied and Environmental Microbiology. 81 (5), 1652-1660 (2015).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F.
- Chen, X., et al. A Mouse Model of Clostridium difficile-Associated Disease. Gastroenterology. 135 (6), 1984-1992 (2008).
- Hutton, M. L., Mackin, K. E., Chakravorty, A., Lyras, D. Small animal models for the study of Clostridium difficile disease pathogenesis. FEMS Microbiology Letters. 352, 140-149 (2014).
- Brugman, S. The zebrafish as a model to study intestinal inflammation. Developmental & Comparative Immunology. 64, 82-92 (2016).
- Goulding, D., et al. Distinctive profiles of infection and pathology in hamsters infected with Clostridium difficile strains 630 and B1. Infection and Immunity. 77, 5478-5485 (2009).
- Toh, M. C., et al. Colonizing the Embryonic Zebrafish Gut with Anaerobic Bacteria Derived from the Human Gastrointestinal Tract. Zebrafish. 10, 194-198 (2013).
- Bloemberg, G. V., et al. Comparison of static immersion and intravenous injection systems for exposure of zebrafish embryos to the natural pathogen Edwardsiella tarda. BMC Immunology. 12, 58 (2011).
- Díaz-Pascual, F., Ortíz-Severín, J., Varas, M. A., Allende, M. L., Chávez, F. P. In vivo host-pathogen interaction as revealed by global proteomic profiling of zebrafish larvae. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 1-11 (2017).
- Valenzuela, M. J., et al. Evaluating the capacity of human gut microorganisms to colonize the zebrafish larvae (Danio rerio). Frontiers in Microbiology. 9, (2018).
