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Developmental Biology

पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके Pharyngeal आर्क धमनियों का दृश्य और विश्लेषण

Published: March 31, 2020 doi: 10.3791/60797
Automatic Translation
1,2, 1
1Department of Cell Biology and Molecular Medicine, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences, 2Multidisciplinary PhD Program in Biomedical Sciences: Cell Biology, Neuroscience and Physiology Track, New Jersey Medical School, Rutgers Biomedical and Health Sciences

Summary

यहां, हम पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, ऊतक समाशोधन, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके फैरिंगियल आर्क धमनियों 3, 4 और माउस भ्रूण के 6 की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

Abstract

मूत्रार्ज आर्क धमनियों (PAAs) 3, 4, और 6 के अनुचित गठन या रीमॉडलिंग जन्मजात हृदय रोग के सबसे गंभीर रूपों में से कुछ में योगदान करते हैं। PAAs के गठन का अध्ययन करने के लिए, हम पूरे माउंट प्रतिकार का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल विकसित बेंजाइल शराब के साथ मिलकर/ यह एक ठीक सेलुलर रिज़ॉल्यूशन के साथ-साथ वास्कुलचर की 3डी कनेक्टिविटी पर फैरिंगल आर्क एंडोथेलियम के दृश्य के लिए अनुमति देता है। सॉफ्टवेयर का उपयोग करते हुए, हमने पीएए में एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसीएस) की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के साथ-साथ फैरिंगियल मेहराब 3, 4 और 6 के भीतर पीए के आसपास के संवहनी जाल के भीतर ईसीएस की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल स्थापित किया है। जब पूरे भ्रूण पर लागू किया जाता है, तो यह पद्धति भ्रूणीय वास्कुलचर का एक व्यापक दृश्य और मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करती है।

Introduction

माउस भ्रूण उत्पत्ति के दौरान, फरियांगल आर्क धमनियां (PAAs) धमनियों के सममित, द्वि-पार्श्व जोड़े के रूप में उत्पन्न होती हैं जो दिल को पृष्ठीय महाधमनी1से जोड़ती हैं। जैसे-जैसे भ्रूण विकसित होता है, पीएए के पहले और दूसरे जोड़े पीछे हटजाते हैं, जबकि3,4और6 पीए महाधमनी आर्क धमनियों2बनाने के लिए विषम रीमॉडलिंग घटनाओं की एक श्रृंखला से गुजरते हैं।

PAAs 3, 4 और 6 वास्कुलोजेनेसिस के माध्यम से विकसित होता है, जो रक्त वाहिकाओं का डी नोवो गठनहै 3। इन कट्टर धमनियों के गठन या रीमॉडलिंग में दोष विभिन्न जन्मजात हृदय दोषों को जन्म देते हैं, जैसे कि डिजॉर्ज सिंड्रोम4,5के रोगियों में देखे जाते हैं। इसलिए, PAAs के विकास को विनियमित करने वाले तंत्रों को समझना जन्मजात हृदय रोग (सीएचडी) एटिजियोलॉजी की बेहतर समझ पैदा कर सकता है।

पीएए विकास की कल्पना और विश्लेषण के लिए वर्तमान दृष्टिकोणों में ऊतक वर्गों की प्रतिरक्षण, संवहनी डाले, भारत स्याही इंजेक्शन, उच्च संकल्प एपिस्कोपिक माइक्रोस्कोपी, और/या पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री1,,4,,5,,6,,7शामिल हैं । इसके साथ, हम वॉल्यूमेट्रिक डेटा, वैस्कुलर कनेक्टिविटी और सेल पहचान को इकट्ठा करने, विश्लेषण करने और निर्धारित करने के लिए पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस, कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और 3डी इमेज रेंडरिंग के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, हम प्रत्येक फैरिंगियल आर्क में ईसीएस की संख्या को विभाजित करने और निर्धारित करने की एक विधि का विस्तार करते हैं, जो प्रत्येक फैरिंगियल आर्क वैस्कुलर प्लेक्सस के गठन और पीए में इसके पुनर्मॉडलिंग का अध्ययन करने के साधन के रूप में है। हालांकि यह प्रोटोकॉल पीएए विकास का विश्लेषण करने के लिए बनाया गया है, इसका उपयोग अन्य विकासशील संवहनी नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है।

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Protocol

रटगर्स विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा पशु उपयोग और प्रक्रियाओं को मंजूरी दी गई थी ।

1. समाधान की तैयारी

  1. 0.1% ट्राइटन-एक्स-100 (पीएसटी) और फिल्टर स्टर्लिटी के साथ फॉस्फेट बफर्ड लवण के 1 एल तैयार करें। इस समाधान को कम से कम एक वर्ष के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. पीएसटी में सामान्य गधे सीरम के 10% से मिलकर बफर को अवरुद्ध करने के 600 माइक्रोन तैयार करें। इस समाधान को हर बार ताजा करें।
  3. एक प्रवाह हुड में निम्नलिखित मेथनॉल (MeOH) कमजोर के 50 मिलीएम तैयार करें: 25% MeOH में deionized पानी (dH2O), डीएच2ओ में 50% MeOH, और 75% MeOH dH2O. Vortex मिश्रण करने के लिए। आरटी पर स्टोर करें।
  4. 50 एमएल शंकुट्यूब में निम्नलिखित बेंजाइल अल्कोहल-बेंजाइल बेंजोएट (बाब) समाधान के 50 मीटर तैयार करें।
    1. 100% बीएबी के लिए, बेंजाइल बेंजोएट के 32 एमएल को बेंजाइल अल्कोहल (2:1 वॉल्यूम प्रति वॉल्यूम रेशियो) में जोड़ें।
    2. 50% बीएबी के लिए, मेओएच के 24 एमएल में बेंजाइल बेंजोएट के 16 एमएएल और बेंजाइल अल्कोहल के 8 एमएल जोड़ें।
    3. प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में शंकुट्यूब को कवर करें। इन समाधानों को एक वर्ष तक के लिए आरटी पर संग्रहीत किया जा सकता है।
      सावधानी: बाब विषाक्त और संक्षारक है। इसे एमएसडीएस के अनुसार संभाला और निस्तारित किया जाना चाहिए।

2. भ्रूण विच्छेदन और निर्धारण

नोट: यह प्रोटोकॉल किसी भी माउस तनाव से अलग E9.5 और E10.5 माउस भ्रूण (पुरुष या महिला) के लिए उपयुक्त है। युवा और पुराने भ्रूण के लिए, ऊष्मायन समय प्रयोगात्मक रूप से फ्लोरेसेंस संकेत के शोर अनुपात के लिए संकेत को अधिकतम करने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए ।

  1. 1x पीबीएस के साथ एक 35 मिमी और एक 60 मिमी पेट्री व्यंजन भरें और जरूरत होने तक बर्फ पर रखें।
  2. सीओ2 साँस लेना के माध्यम से एक गर्भवती माउस इच्छामृत्यु। इच्छामृत्यु के माध्यमिक उपाय के रूप में सर्वाइकल अव्यवस्था करें।
  3. बांध के पेट के क्षेत्र को 70% इथेनॉल से साफ करें। संदंश का उपयोग करपेट क्षेत्र चुटकी लें और मिडलाइन पर पेट की दीवार के आधार से शुरू होने वाली सर्जिकल कैंची का उपयोग करके वी-जैसा चीरा बनाएं; वक्ष गुहा को खोलना जारी रखें। पेट के ऊतकों को उठाएं और गर्भाशय के सींगों को बेनकाब करने के लिए आंतों को साइड में ले जाएं।
  4. योनि नहर के आधार पर एक कट बनाओ, और संदंश के साथ, गर्भाशय को बांध से दूर खींचें। गर्भाशय को मुक्त करने के लिए प्रत्येक अंडाशय पर एक अतिरिक्त कटौती करें। गर्भाशय को ठंडे 1x पीबीएस वाले 60 मिमी पेट्री व्यंजनों में से एक में स्थानांतरित करें।
  5. सीधे कैंची का उपयोग करते हुए, प्रत्येक प्रत्यारोपण साइट के बीच गर्भाशय की दीवार को काट दें। एक गिलास पाइप के साथ एक दशमलव को उठाओ और 1x पीबीएस के साथ 35 मिमी पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे, दशमलव और गर्भाशय की दीवार के बीच अंतरिक्ष में सीधे कैंची डालें। गर्भाशय की दीवार को काटकर हटा दें।
  6. ठीक संदंश के साथ, ऊतक के साथ ट्रांसवर्स चीरों को ध्यान से बनाकर और ऊतक को जर्दी थैली से दूर खींचकर भ्रूण से डेसीदुआ और रिचर्ट की झिल्ली को हटा दें। ऊतक को सावधानीपूर्वक भ्रूण से दूर खींचकर और एलनटोइस और नाल नस पर कटौती करके जर्दी थैली और एमनियोटिक थैली निकालें।
    नोट: Yolk थैली genotyping भ्रूण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  7. प्रत्येक भ्रूण को 1x पीबीएस के 1 एमएल से भरे व्यक्तिगत 2 एमएल ट्यूबों में ग्लास पाइप्ट के साथ स्थानांतरित करें। प्रत्येक ट्यूब को एक अद्वितीय पहचानकर्ता के साथ लेबल करें।
  8. भ्रूण को ठीक करने के लिए, ध्यान से 1x पीबीएस को हटा दें और 1x पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) समाधान जोड़ें। रात भर सौम्य आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड।
    नोट: 4% पीएफए निर्धारण इस प्रोटोकॉल में उल्लिखित एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त है। हालांकि, निर्धारण प्रक्रियाओं को अतिरिक्त एंटीबॉडी के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

3. भ्रूण धुंधला

नोट: इस खंड में, भ्रूण permeabilized और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग रहे हैं । क्योंकि PAA विकास तेजी से आय, भ्रूण के चरण में मतभेद बहुत विश्लेषण डाउनस्ट्रीम को प्रभावित करेगा । इसलिए, भ्रूण को आगे जोड़तोड़ से पहले नियंत्रण और उत्परिवर्ती जोड़े से मेल खाने के लिए ध्यान से सोमाइट्स की गिनती करके उम्र-मिलान किया जाना चाहिए।

  1. भ्रूण (एस) को धोने के लिए, ध्यान से 4% पीएफए को हटा दें और 1x पीबीएस जोड़ें। धीरे-धीरे ट्यूब (एस) को कई बार उलटा करें। ट्यूब (एस) दाईं ओर रखें और भ्रूण (एस) को डूबने दें। 3 बार धोएं। ट्यूब (एस) बर्फ पर भ्रूण (ओं) के साथ रखें।
    नोट: (वैकल्पिक रोक बिंदु) वॉश के बाद, भ्रूण को धारा 1.3 के अनुसार 30 मिन प्रति कमजोर पड़ने के लिए मीओएच की वर्गीकृत श्रृंखला में निर्जलित किया जा सकता है, और बाद में 6 महीने तक उपयोग के लिए 100% MeOH में -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. E10.5 भ्रूण के लिए, एक गिलास पाइप का उपयोग करने के लिए एक ३५ मिमी पेट्री डिश ठंडा 1x PBS से भरा एक भ्रूण हस्तांतरण । ध्यान से ठीक संदंश के साथ हिंद अंग के ऊपर भ्रूण चुटकी और भ्रूण के पीछे आधा हटाने के लिए एक ट्रांसवर्स कट बनाते हैं । यह भ्रूण को चरण 4.2 के लिए एक सगित स्थिति में फ्लैट बिछाने की अनुमति देता है। ताजा 1x पीबीएस के साथ भ्रूण को 2 एलएल ट्यूब में वापस रखें।
    नोट: एक नियंत्रण और उत्परिवर्ती भ्रूण को 3.8 के माध्यम से चरण 3.3 के लिए एक ट्यूब में एक ही एंटीबॉडी समाधान के साथ जोड़ा और दाग दिया जा सकता है।
    1. यदि दो भ्रूणों को एक साथ धुंधला कर ते हैं, तो एक ट्रांसवर्स कट बनाने के लिए ठीक संदंश के साथ चुटकी लेकर पहले pharyngeal आर्क के ऊपर एक भ्रूण के सिर को काट दें। यह प्रत्येक ट्यूब के भीतर दो अलग-अलग जीनोटाइप के भ्रूण को अलग करेगा।
  3. भ्रूण (ओं) को परमीबिलाइज करने के लिए, ट्यूब से 1x पीबीएस को बाहर निकालने के लिए, भ्रूण (एस) को छूने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा है। पीएसटी के 1 एमएल जोड़ें। रात भर कोमल आंदोलन के साथ ट्यूब को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    नोट: (वैकल्पिक रोक बिंदु) भ्रूण कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर PBST समाधान में रखा जा सकता है।
  4. एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बाध्यकारी को रोकने के लिए, पहले ट्यूब से PBST को हटा दें, सावधान किया जा रहा है भ्रूण (ओं) को छूने के लिए नहीं। भ्रूण (ओं) के लिए बफर समाधान अवरुद्ध करने के 600 μL जोड़ें। रात भर कोमल आंदोलन के साथ भ्रूण को 4 डिग्री सेल्सियस पर ब्लॉक करें।
    नोट: अवरुद्ध समाधान के लिए मलबे को हटाने के लिए उपयोग से पहले तुरंत एक बेंचटॉप अपकेंद्री पर शीर्ष गति से घूमती की जरूरत है ।
  5. ईसीएस को दाग ने और निर्धारित करने के लिए, VEGFR2 और ईआरजी के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करें। एंटीबॉडी समाधान अवरुद्ध बफर में किए जाते हैं। एंटी-VEGFR2 एंटीबॉडी पतला 1:200 और ईआरजी एंटीबॉडी 1:1000 पतला है।
    नोट: एंटीबॉडी समाधान के लिए एक बेंच पर शीर्ष गति पर घूमती है शीर्ष गति पर घूमती है तुरंत पहले उपयोग करने के लिए कणों को हटाने की जरूरत है ।
    1. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ भ्रूण (एस) को इनक्यूबेट करने के लिए, ट्यूब से ब्लॉकिंग बफर समाधान को हटा दें, भ्रूण (एस) को छूने के लिए सावधान रहें। प्रत्येक ट्यूब के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 600 μL जोड़ें। 4-5 दिनों तक कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट भ्रूण (एस)।
  6. एंटीबॉडी समाधान के भ्रूण (एस) को धोने के लिए, सबसे पहले ट्यूब से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें। कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान (आरटी) पर PBST के 1 mL के साथ हर घंटे भ्रूण धोएं । दिन में 4-5 बार भ्रूण धोएं और फिर रात भर कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन दोहराएं।
  7. बफर को अवरुद्ध करने में विरोधी बकरी एलेक्सा फ्लोर 488 और एंटी-माउस एलेक्सा फ्लोर 555 1:300 को कमजोर करके माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान बनाएं। बफर को अवरुद्ध करने में स्टॉक डीपीआई 1:1000 को पतला करें।
    नोट: एंटीबॉडी समाधान कणों को हटाने के लिए उपयोग करने से तुरंत पहले एक बेंच-टॉप अपकेंद्रित्र पर शीर्ष गति से घूमती होनी चाहिए। इसके अलावा अन्य एलेक्सा फ्लोर रंगों का इस्तेमाल 488 या 555 के बदले किया जा सकता है।
    1. माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ भ्रूण (एस) को इनक्यूबेट करने के लिए, ट्यूब से PBST निकालें। प्रत्येक ट्यूब के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 600 μL जोड़ें। 4-5 दिनों तक कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट भ्रूण (एस)।
  8. एंटीबॉडी समाधान के भ्रूण (एस) को धोने के लिए, सबसे पहले ट्यूब से माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें। कोमल आंदोलन के साथ आरटी में एसपीएसटी के 1 mL के साथ हर घंटे भ्रूण (एस) धोएं । दिन में 4-5 बार भ्रूण धोएं और फिर रात भर कोमल आंदोलन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। अगले दिन दोहराएं।

4. अगारोज में भ्रूण एम्बेडिंग

नोट: धारा 4 में, भ्रूण (एस) अगारोज में एम्बेडेड किया जाएगा । यह एम्बेडिंग प्रक्रिया दो उद्देश्यों को पूरा करती है: इमेजिंग से पहले भ्रूण को ठीक से उन्मुख करना, और बीएबी (चरण 5.2.2 - 5.3.2) में मंजूरी देने के बाद भ्रूण का पता लगाने में सहायता करना।

  1. सभी अगारोज भंग होने तक डीएच2ओ माइक्रोवेव के 200 मिलीग्राम में अगारोज के 2 ग्राम जोड़कर 1% अगारोज समाधान के 200 मीटर तैयार करें।
    नोट: शेष अगारोज को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए फिर से गरम किया जा सकता है।
  2. प्लास्टिक पैराफिन मोल्ड और ग्लास पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे एक भ्रूण को मोल्ड में स्थानांतरित करें। भ्रूण से बीएसएसटी को सावधानी से निकालें। भ्रूण को सग्तल स्थिति में रखें। जल्दी से, मोल्ड में गर्म अगारोज के बारे में 0.5 mL जोड़ें - भ्रूण को कवर करने और मोल्ड भरने के लिए पर्याप्त है। सुनिश्चित करें कि कोई हवा बुलबुले भ्रूण के चारों ओर।
  3. बर्फ पर मोल्ड रखें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर जब तक अगारोज जम गया है।
    नोट: PBST को हटाने के बाद भ्रूण को सूखने की अनुमति न दें। Agarose समाधान काफी गर्म करने के लिए तरल रहने के लिए जब यह भ्रूण में जोड़ा जा रहा है होना चाहिए । भ्रूण को कवर करने के लिए बस पर्याप्त agarose जोड़ें, लेकिन बहुत ज्यादा नहीं है, नहीं तो यह छवि के लिए मुश्किल हो जाएगा । छवि गहराई उद्देश्य की कार्य दूरी से भाग में निर्धारित की जाती है।

5. निर्जलीकरण और ऊतक समाशोधन

नोट: इस खंड में, भ्रूण (एस) मेथनॉल श्रृंखला का उपयोग करनिर्जलित होते हैं, फिर कार्बनिक सॉल्वेंट, बाब में साफ हो जाते हैं, और रबर स्पेसर द्वारा अलग किए गए दो कवरस्लिप के बीच घुड़सवार होते हैं; इस प्रोटोकॉल में फास्ट वेल रबर स्पेसर्स का उपयोग किया जाता है। फास्ट वेल बंपर में दो तरफा चिपकने वाली सतह होती है। एक कुआं बनाने के लिए स्पेसर की जरूरत होती है, जिसमें भ्रूण को रखा जाएगा और दो कवरस्लिप के बीच रखा जाएगा ।

  1. मेथनॉल डिहाइड्रेशन
    1. लेबल नई 2 mL ट्यूब, भ्रूण प्रति एक । प्रति ट्यूब 25% मीओएच का 1 एमएल जोड़ें।
    2. एक साफ स्केलपेल का उपयोग करना, धीरे से भ्रूण के चारों ओर अगागुलाब काट, भ्रूण के आसपास पर्याप्त छोड़ इतना है कि यह संदंश द्वारा उठाया जा सकता है । एम्बेडेड भ्रूण के साथ अगारोज को धीरे-धीरे हड़पने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें और इसे 25% MeOH के साथ लेबल ट्यूब में रखें। संदंश को भ्रूण को छूने की अनुमति न दें।
    3. अंधेरे में 1 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ आरटी में इनक्यूबेट भ्रूण (एस) ।
    4. ट्यूब से 25% MeOH निकालें, सावधान किया जा रहा है भ्रूण को छूने के लिए नहीं । प्रति ट्यूब 50% मीओएच का 1 एमएल जोड़ें। अंधेरे में 1 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर इनक्यूबेट ।
    5. ट्यूब से 50% MeOH निकालें, सावधान किया जा रहा है भ्रूण को छूने के लिए नहीं। प्रति ट्यूब 75% मीओएच का 1 एमएल जोड़ें। अंधेरे में 1 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर इनक्यूबेट ।
    6. ट्यूब से 75% MeOH निकालें, सावधान किया जा रहा है भ्रूण (ओं) को छूने के लिए नहीं। प्रति ट्यूब 100% मीओएच का 1 एमएल जोड़ें। अंधेरे में 1 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर इनक्यूबेट । 100% मीह धोने को दो बार दोहराएं।
  2. बाब के साथ समाशोधन
    1. ट्यूब से 100% MeOH निकालें, सावधान किया जा रहा है भ्रूण को छूने के लिए नहीं। प्रति ट्यूब 50% बीएबी का 1 एमएल जोड़ें। अंधेरे में 1 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर इनक्यूबेट ।
    2. ट्यूब से 50% BABB निकालें, सावधान किया जा रहा है भ्रूण को छूने के लिए नहीं। प्रति ट्यूब 100% बीएबी का 1 एमएल जोड़ें। अंधेरे में 1 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ आरटी पर इनक्यूबेट । 100% बब्ब धोने को दो बार दोहराएं।
      नोट: (वैकल्पिक रोक बिंदु) भ्रूण के बारे में एक सप्ताह के लिए ट्यूबों में १००% BABB में रह सकते हैं । लंबे समय तक भंडारण के कारण बाब ट्यूबों के प्लास्टिक को भंग कर देगा।
  3. इमेजिंग के लिए बढ़ते भ्रूण
    1. एक तरफ से प्लास्टिक चिपकने वाला छीलकर 24 एमएम x 60 एमएम #1.5 ग्लास कवर स्लिप पर फास्ट वेल बंपर रखें। सुनिश्चित करें कि रबर बम्पर के ऊपर प्लास्टिक चिपकने वाले पर कोमल दबाव लागू करके कवरस्लिप और बंपर के बीच कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं। धुंधला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले भ्रूण संख्या, जीनोटाइप और एंटीबॉडी के अनुसार कवरस्लिप को लेबल करें।
      नोट: किसी भी स्पेसर को कवरस्लिप के बीच रखा जा सकता है जब तक कि यह भ्रूण को कुचलने या स्क्वैशिंग को रोकने के लिए काफी मोटा हो। हम उनकी मोटाई और सुविधा के कारण फास्ट वेल स्पेसर्स का उपयोग करते हैं, जिसमें स्पेसर के दोनों ओर चिपकने वाली सतहें शामिल हैं ताकि इसे कवरस्लिप तक सुरक्षित किया जा सके।
    2. ध्यान से बाहर निकालना और ट्यूब से 100% BABB त्यागें। ट्यूब में अगारोज-एम्बेडेड भ्रूण की कल्पना करने के बाद, अगारोज लेने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें और ध्यान से तेजी से अच्छी तरह से अंदर कवरस्लिप पर भ्रूण हस्तांतरण-संदंश भ्रूण को छूने की अनुमति नहीं है ।
    3. दूसरे प्लास्टिक चिपकने वाले को बंपर से निकालें और दूसरी कवरस्लिप को ऊपर रखें। कवरस्लिप पर धीरे-धीरे दबाकर हवा के बुलबुले निकालें। शीशा न तोड़ने से सावधान रहें।
      नोट: नमूने एक साल तक के लिए आरटी में अंधेरे में एक स्लाइड धारक में फ्लैट संग्रहीत किया जा सकता है अगर सील तंग है ।

6. आंकड़ों का अधिग्रहण

नोट: निम्नलिखित चरणों में, फ़ेरनेगल मेहराब 3, 4 और 6 के एंडोथेलियम को कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके चित्रित किया जाएगा।

  1. स्लाइड्स में माइक्रोस्कोप स्टेज पर
    1. भ्रूण की छवि के लिए, 20x पानी विसर्जन उद्देश्य, संख्यात्मक अपर्चर 0.95, काम करने की दूरी 0.95 मिमी, और एनआईएस-एलिमेंट्स एआर 5.11.01 64-बिट सॉफ्टवेयर से लैस कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    2. चौड़े क्षेत्र फ्लोरेसेंस का उपयोग करके, नेत्रहीन फ़ेरनेंगियल मेहराब का पता लगाते हैं। 4 PAA के आसपास क्षेत्र देखने केंद्र ।
    3. यदि उद्देश्य का दृश्य क्षेत्र पूरे फैरिंगियल आर्क क्षेत्र को कैप्चर नहीं करता है, तो 1% ओवरलैप के साथ छवियों के एक बड़े पैनल को लें और सिलाई करें। बड़ी छवि के अधिग्रहण के दौरान नमूने के आंदोलन को रोकने के लिए, धीरे-धीरे मोल्डिंग मिट्टी का उपयोग करके कवर स्लिप असेंबली को मंच पर सुरक्षित करें।
  2. अधिग्रहण मापदंडों की स्थापना
    1. पिनहोल का आकार 1.0 तक सेट करें।
    2. एनडी अधिग्रहण टैब के तहत मोटे एडजस्टमेंट का इस्तेमाल करते हुए इमेजिंग की टॉप और बॉटम लिमिट सेट करें। सॉफ्टवेयर स्पेसिफिकेशंस के हिसाब से जेड स्टेप साइज सेट करें। मोटाई है कि उद्देश्य की काम दूरी और नमूने की स्पष्टता से छवि जा सकता है निर्धारित करें ।
    3. भ्रूण की मोटाई के कारण, जेड-स्टैक में लाभ को समायोजित करें। प्रत्येक चैनल (405, 488 और 555) के लिए जेड-स्टैक के बीच में लेजर तीव्रता और लाभ सेट करें और जेड तीव्रता सुधार टैब के तहत मूल्यों को आवंटित करें। नीचे के स्लाइस के लिए समान मूल्य निर्धारित करें।
    4. भ्रूण के माध्यम से स्क्रॉल करें जब तक फ्लोरेसेंस सिग्नल मंद दिखाई देने लगते हैं। प्रत्येक चैनल का लाभ तब तक बढ़ाएं जब तक कि सिग्नल तीव्रता पिछले सेगमेंट के समान दिखाई न दे। जेड तीव्रता सुधार टैब के तहत नया मूल्य आवंटित करें। जेड-स्टैक पूरा होने तक दोहराएं। आयात सेटिंग्स एनडी अधिग्रहणके लिए वापस ।
    5. रन जेड करेक्शन ऑप्शन का इस्तेमाल करके स्कैन चलाएं।

7. Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण

नोट: इन चरणों में, माइक्रोस्कोपी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, इमरिस संस्करण 9.2.0 का उपयोग करके कॉन्फोकल छवियों का विश्लेषण किया जाएगा। इस विश्लेषण के दौरान, हम पहले सतहों का निर्माण करके विश्लेषण किए जाने वाले हित के क्षेत्रों का चयन करेंगे। इसके बाद, हम इन क्षेत्रों को नेत्रहीन रूप से अलग करने के लिए मास्क फ़ंक्शन का उपयोग करेंगे। अंत में, हम ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के भीतर ईसीएस की संख्या निर्धारित करने के लिए स्पॉट फ़ंक्शन का उपयोग करेंगे।

  1. 6 चरण में उपयोग किए जाने वाले इमेजिंग सॉफ्टवेयर के आधार पर, इमेज को आईमारिस फ़ाइल कनवर्टरका उपयोग करके .आईएमएस में परिवर्तित करें।
  2. आईआईएमएस फाइलें खोलें। कैमरा/लेबल के तहत ऑर्थोगोनल के लिए छवि सेट करें । कैमरा टाइप पैनल।
  3. PAAs का पता लगाएं और सरफेसिंग के लिए छवि उन्मुख।
    नोट: जब फ़ाइलें पहली बार खोली जाती हैं, तो वे इमेजकिए गए सभी स्लाइस के 3डी संकलन के रूप में दिखाई देंगे। इस चरण में, पीए3 डी छवि को 2डी छवि में बनाकर स्थित होगा। 2D छवि तो PAAs के लिए ठीक से विश्लेषण के लिए उन्मुख होने की अनुमति देता है ।
    1. गुण पैनल के तहत, वॉल्यूमबंद करें। प्रॉपर्टीपैनल के तहत, ऐड न्यू ऑर्थो स्लाइसरपर क्लिक करें। XY विमानके लिए स्लाइस ओरिएंटेशन सेट करें । PAAs खोजने तक छवि के माध्यम से स्क्रॉल करने के लिए स्लाइस स्थिति का उपयोग करें।
    2. यदि PAAs छवि के ऊपर और नीचे के समानांतर नहीं हैं, तो माउस कर्सर का उपयोग करके छवि को स्वतंत्र रूप से घुमाएं ताकि PAAs स्क्रीन के पार बाएं से दाएं चले। इमेज प्रोसेसिंग ड्रॉप डाउन मेन्यू के तहत फ्री रोटेट का चयन करें और ओकेपर क्लिक करें।
  4. 3 Pharyngeal आर्क सरफेसिंग rd (चित्रा 2ए, बी-बी")
    नोट: इन चरणों में, फरिंगियल मेहराब और PAAs को ब्याज के 'सामने' क्षेत्र उत्पन्न करने के लिए सतह उपकरण का उपयोग करके पता लगाया जाएगा। यह ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए नेत्रहीन आसपास के ऊतकों से अलग होने की अनुमति देगा । इसमें हम 3आरडी फ्रेनेगियल आर्क के एंडोथेलियल घटकों को सतह और विश्लेषण करने के चरणों का वर्णन करते हैं। Pharyngeal मेहराब 4 और 6 इसी तरह का विश्लेषण कर रहे हैं ।
    1. पूरे 3 pharyngeal आर्कrd में एंडोथेलियम सतह करने के लिए, गुण पैनल के तहत स्थित ऐड न्यू सरफेस बटन पर क्लिक करें। सतह 1 पर डबल क्लिक करें और नई सतह का नाम बदलकर "3rd Pharyngeal आर्क" कर दिया।
    2. स्किप स्वचालित निर्माण का चयन करें, मैन्युअल रूप से संपादित करें। वाईजेड प्लेन (कोरोनल ओरिएंटेशन) के लिए सरफेस ओरिएंटेशन सेट करें। स्लाइस पोजीशन का उपयोग 3आरडी फैरिंगल आर्क सरफेस प्लेन को रखने के लिए करें जहां 3आरडी पीएए और डोर्सल ऑर्टा कनेक्ट होते हैं।
    3. छवि को घुमाएंrd ताकि 3 फ़ेरनेगल आर्क सरफेस प्लेन देखने में लगे। ऑर्थो स्लाइसर 1 बंद करें।
    4. ड्रा के तहत । समोच्च । मोड टैब, दूरस्थ ड्राइंग मोड फ़ंक्शन का चयन करें। जरूरत पड़ने पर पैरामीटर सेटिंग को एडजस्ट करें। नमूनों के बीच लगातार सरफेसिंग मापदंडों को बनाए रखें। इस उदाहरण के लिए, वर्टेक्स स्पेसिंग 10 माइक्रोन है।
    5. सरफेसिंग शुरू करने के लिए ईएससी कुंजी दबाएं और फिर ड्रा बटन पर क्लिक करें। माउस कर्सर के साथ 3आरडी फ्रेनेगल आर्क की परिधि का पता लगाएं। 10-25 स्लाइस स्थानांतरित करने के लिए स्लाइस स्थिति का उपयोग करें। फैरिंगल आर्क की परिधि का पता लगाएं। जब तक फैरिंगल आर्क पूरी तरह से पता नहीं लगा या नहीं, तब तक दोहराएं।
    6. पता लगाया क्षेत्र की सतह उत्पन्न करने के लिए, गुण पैनल में बनाएं सतह बटन का चयन करें।
  5. 3 पीएए (चित्रा 2सी - सी"सरफेसिंग)
    1. 3पीएए के एंडोथेलियम को सतह पर लाने के लिए, पहले 3आरडी फ्रेरंगल आर्क सरफेस बॉक्स का चयन करके, चरण 7.4 से सामने आए क्षेत्र को बंद कर दें। इसके बाद फिर से ऐड न्यू सरफेस बटन पर क्लिक करें। सतह 1 पर डबल क्लिक करें और नई सतह का नाम बदलकर "3पीएए" कर दिया जाए।
    2. स्किप स्वचालित निर्माण का चयन करें, मैन्युअल रूप से संपादित करें। वाईजेड प्लेन (कोरोनल ओरिएंटेशन) के लिए सरफेस ओरिएंटेशन सेट करें। स्लाइस स्थिति का उपयोग करने के लिए3 PAA सतह विमान जगह है जहां3 PAA और Dorsal Aorta कनेक्ट, तो कदम 7.4 दोहराएं।
  6. सामने आई संरचनाओं का मास्किंग
    नोट: निम्नलिखित चरणों में, ब्याज का प्रत्येक सामने वाला क्षेत्र नकाबपोश होगा। मास्किंग ब्याज के क्षेत्र को बाकी इमेज्ड ऊतक ों से नेत्रहीन रूप से अलग होने की अनुमति देता है और ब्याज की इन विशिष्ट संरचनाओं की मात्रा के लिए अनुमति देता है। नीचे, हम आईएरिस में चरणों का वर्णन करने के लिए कल्पना और PAA एंडोथेलियम का विश्लेषण, साथ ही जाल - pharyngeal मेहराब के भीतर PAAs आसपास के छोटे वासलेना। इन चरणों में, धारा 7.7 में वर्णित स्पॉट फ़ंक्शन का उपयोग करके केवल पीए पर विश्लेषण करने और विश्लेषण करने के लिए 3पीएए सतह को नकाबपोश किया जाएगा।
    1. सभी नकाबपोश चैनलों की कल्पना करने के लिए वॉल्यूम का चयन करें। छवि को घुमाने और छवि को XY स्थिति में रखने के लिए ईएससी कुंजी दबाएं।
    2. एडिट टैब के तहत 3पीएए के लिए मास्क सेलेक्शन का चयन करें। DAPI चैनल का चयन करें और OKक्लिक करें । शेष चैनलों के लिए दोहराएं।
    3. कीबोर्ड पर, डिस्प्ले एडजस्टमेंट पैनल देखने के लिए Ctrl + D दबाएं। प्रत्येक नए चैनल का चयन करें और उन्हें बदलने के लिए यह स्पष्ट है कि प्रत्येक चैनल क्या दिखाता है । उदाहरण के लिए, इससे तीन नए चैनल होंगे: "3पीएडीए डीपीआई", "3पीएए ईआरजी", और "3आरडी पीएए VEGFR2"।
      नोट: चरण 7.6.4-7.6.7 में हम केवल pharyngeal आर्क प्लेक्सस के लिए चैनल बनाएंगे।
    4. पीएए से अलग एंडोथेलियल प्लेक्सस की कल्पना करने के लिए, हम पहले 3पीएए सतह के लिए मास्क चयन का चयन करेंगे। डीपीआई चैनल का चयन करें। सतह के बाहर वोक्सल का चयन करें और सतह से बटन के अंदर चुनिंदा वोक्सल की जांच करें, सतह के अंदर चुनिंदा स्वर शून्य परसेट करें। ओकेपर क्लिक करें ।
    5. शेष चैनलों के लिए दोहराएं। इस ऑपरेशन से पीएए वाले क्षेत्र को नए नकाबपोश चैनलों से बाहर कर दिया जाएगा । चैनलों का नाम बदलकर यह स्पष्ट कर दिया जाए कि प्रत्येक चैनल क्या दिखाता है। उदाहरण के लिए, इससे तीन नए चैनल होंगे: "गैर-पीएडीए डीपीआई", "गैर-पीएए ईआरजी", और "गैर-पीएए VEGFR2"।
    6. 3 pharyngeal आर्क के भीतरrd एंडोथेलियल प्लेक्सस की कल्पना करने के लिए, 3rd Pharyngeal आर्क सतह के लिए एडिट टैब के तहत मुखौटा चयन का चयन करें। गैर पीएए डीपीआई चैनल का चयन करें। ओकेपर क्लिक करें ।
    7. शेष गैर-पीएए चैनलों के लिए दोहराएं। चैनलों का नाम बदलकर यह स्पष्ट कर दिया जाए कि प्रत्येक चैनल क्या दिखाता है। उदाहरण के लिए, इससे तीन नए चैनल होंगे: "प्लेक्सस डीपीआई", "प्लेक्सस ईआरजी", और "प्लेक्सस VEGFR2"।
  7. ईसी नंबरों का परिमाणीकरण
    नोट: ईआरजी की अभिव्यक्ति एंडोथेलियल न्यूक्लिकी को चिह्नित करती है जिससे ईसी नंबरों की मात्रा निर्धारित करना सुविधाजनक हो जाता है। इन चरणों में, पीएए और प्लेक्सस में ईआरजी अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित प्रत्येक ईसी के लिए एक स्थान उत्पन्न करने के लिए स्पॉट फ़ंक्शन का उपयोग करके ईसीएस की संख्या की मात्रा निर्धारित की जाएगी। धारा 7.7 में, नकाबपोश पीएए में प्रत्येक ईआरजी-पॉजिटिव सेल के लिए स्पॉट उत्पन्न किए जाएंगे, जिसके बाद ईआरजी-पॉजिटिव, VEGFR2-नकारात्मक कोशिकाओं में स्पॉट का चयन किया जाएगा।
    1. कीबोर्ड पर, डिस्प्ले एडजस्टमेंट पैनल देखने के लिए Ctrl + D दबाएं। पीएए ईआरजी को छोड़कर सभी चैनलबंद करें।
    2. प्रॉपर्टी टैब के नीचे ऐड न्यू स्पॉट बटन पर क्लिक करें। स्पॉट 1 पर क्लिक करें और इसे "पीएए कुल संख्या ईसीएस" में बदल दें। नीले तीर बटन पर क्लिक करें। स्रोत चैनलके लिए, PAA ERG चैनल का चयन करें । अनुमानित XY व्यास को 4 माइक्रोन में समायोजित करें। नीले तीर बटन पर क्लिक करके अगले पैनल के लिए आगे बढ़ें।
    3. स्लाइडिंग स्केल का उपयोग करके देखे गए स्थानों की संख्या को समायोजित करें, यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रत्येक ईसी नाभिक (ईआरजी अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित) एक स्थान द्वारा दर्शाया जाता है। ग्रीन डबल एरो बटन पर क्लिक करें।
    4. डिस्प्ले एडजस्टमेंट में पीएए ईआरजी चैनल बंद करें। पीएए एंडोथेलियम की कल्पना करने के लिए पीएए VEGFR2 चैनल चालू करें।
    5. ईसीएस की संख्या को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए, हम यह सुनिश्चित करते हैं कि प्रत्येक स्थान ईसी मार्कर, ईआरजी और VEGFR2 दोनों को व्यक्त करता है। ऐसा करने के लिए, संपादित टैब के तहत ऑब्जेक्ट की सतह का चयन करें। पैनल जोड़ें/हटाएं। ईएससी कुंजी दबाएं और किसी भी धब्बे को हटा दें जो VEGFR2 सकारात्मक नहीं हैं, नीचे शिफ्ट पकड़कर और स्थान का चयन करके।
      नोट: निम्नलिखित चरण में, नकाबपोश प्लेक्सस में प्रत्येक ईईजी-पॉजिटिव सेल के लिए स्पॉट उत्पन्न किए जाएंगे, जिसके बाद ईईजी-पॉजिटिव, VEGFR2-नकारात्मक कोशिकाओं में स्पॉट का चयन किया जाएगा।
    6. प्रॉपर्टी टैब के नीचे ऐड न्यू स्पॉट बटन पर क्लिक करें। स्पॉट 1 का चयन करें और "ईसीएस की प्लेक्सस कुल संख्या" का नाम बदलें। नीले तीर बटन पर क्लिक करें। सोर्स चैनल के लिए प्लेक्सस ईजी चैनल का चयन करें। अनुमानित XY व्यास को 4 माइक्रोन में समायोजित करें। ईसीएस की कुल संख्या प्लेक्सस के लिए 7.7.1 - 7.7.5 चरण दोहराएं।
    7. 3पीएए और फैरंगल आर्क प्लेक्सस में ईसीएस की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए प्रत्येक स्पॉट फ़ंक्शन के स्टैटिस्टिक्स टैब पर क्लिक करें।
    8. शेष PAAs और pharyngeal आर्क प्लेक्सस के लिए 7.7.1 - 7.7.6 दोहराएं।

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Representative Results

यहां प्रस्तुत पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल स्पष्ट और स्वच्छ परिणाम पैदा करता है, जो फारिंगियल आर्क एंडोथेलियम के 3डी पुनर्निर्माण के लिए अनुमति देता है, जैसा कि चित्रा 1एमें देखा जाता है । नमूने के माध्यम से पूर्ण प्रवेश सुनिश्चित करने के साथ-साथ एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद भ्रूण को अच्छी तरह से धोने के लिए प्रत्येक एंटीबॉडी समाधान में पर्याप्त मात्रा में समय के लिए भ्रूण को इनक्यूबेट करना महत्वपूर्ण है। चित्रा 1बीमें, बड़े, उज्ज्वल बिंदु या तो एंटीबॉडी या ब्लॉकिंग बफर समाधान में कण ों के परिणामस्वरूप दिखाई देते हैं। हमने पाया है कि प्रत्येक एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद पीएसटी वॉश के उपयोग और लंबी अवधि से पहले प्रत्येक समाधान को अपकेंद्रित करना इस समस्या को हल करता है।

चित्रा 2 प्रोटोकॉल की धारा 7 में वर्णित विश्लेषण के लिए एक pharyngeal आर्क और एक पीएए को सतह पर लाने के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया को दिखाता है। नकाबपोश फ़ंक्शन का उपयोग करके, इमरिस सॉफ्टवेयर सामने आने वाले क्षेत्रों को नेत्रहीन रूप से अलग और स्वतंत्र रूप से विश्लेषण करने की अनुमति देता है।

चित्रा 3 फ़ेरनेजियल मेहराब ों में विभिन्न संवहनी डिब्बों के व्यक्तिगत मास्किंग को दर्शाता है: पीएए(चित्रा 3ए, बी, सी)और प्लेक्सस(चित्रा 3ए', बी', सी')। मास्किंग प्रत्येक संरचना में अलग से चुनाव आयोग की संख्या के विश्लेषण और मात्राकरण के लिए अनुमति देता है। चित्रा 3सी-सी 'में, स्पॉट फीचर का उपयोग ईआरजी व्यक्त करने वाले प्रत्येक नाभिक के लिए एक ही स्थान निर्दिष्ट करके पीएए और प्लेक्सस दोनों में ईसीएस की कुल संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि स्पॉट फ़ंक्शन के लिए उपयोग किया जाने वाला एल्गोरिदम एक निर्दिष्ट आकार के किसी भी पिक्सेल के लिए एक डॉट उत्पन्न करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। ईआरजी, जिसका उपयोग यहां ईसी नाभिक के मार्कर के रूप में किया जाता है, तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं8में भी व्यक्त किया जाता है ; तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाएं VEGFR2 को व्यक्त नहीं करती हैं। चित्रा 3डी एक ईआरपी-पॉजिटिव (ग्रीन), VEGFR2-निगेटिव (पिंक) स्पॉट का एक उदाहरण दिखाता है जो इमरिस स्पॉट फंक्शन द्वारा जेनरेट किया गया है। नतीजतन, यह सत्यापित करना आवश्यक है कि प्रत्येक डॉट एक ही ईसी का प्रतिनिधित्व करता है और ईआरजी और VEGFR2 दोनों के साथ लेबल किया गया है।

चरण समय तापमान
1 पीएसटी वॉश/परमीबिलाइजेशन 24 घंटे या O/N 4 डिग्री सेल्सियस
2 बफर अवरुद्ध 25 घंटे या O/N 4 डिग्री सेल्सियस
3 प्राथमिक एंटीबॉडी 4-5 दिन 4 डिग्री सेल्सियस
4 पीएसटी वॉश 2 दिनों के लिए दिन में 4-5 बार आर टी (या 4 डिग्री सेल्सियस यदि O/N)
5 सेकेंडरी एंटीबॉडी 4-5 दिन 4 डिग्री सेल्सियस
6 पीएसटी वॉश 2 दिनों के लिए दिन में 4-5 बार आर टी (या 4 डिग्री सेल्सियस यदि O/N)
7 एम्बेड N/A प्रारंभ
8 मेथनॉल डिहाइड्रेशन और बाब प्रति चरण 1 घंटा प्रारंभ

तालिका 1: पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का अवलोकन। O/N-रातोंरात; आर टी - कमरे का तापमान।

Figure 1
चित्रा 1: पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेंस के बाद स्वच्छ और गंदे छवियों की तुलना। E10.5 भ्रूण के Sagittal विचार पीएए एंडोथेलियम की कल्पना करने के लिए एंटी-VEGFR2 एंटीबॉडी (सफेद) का उपयोग दिखाते हैं। भ्रूण अच्छी तरह से PBST पोस्ट एंटीबॉडी ऊष्मायन(ए)के साथ धोया एक उच्च संकेत से शोर अनुपात है और एक क्लीनर छवि का उत्पादन, जब भ्रूण है कि अच्छी तरह से धोया नहीं कर रहे है(बी)के साथ तुलना में । बी में तीर शोर/गंदगी के क्षेत्रों को दिखाते हैं जो छवि में दिखाई दिए हैं जब कोई भ्रूण अच्छी तरह से धोया नहीं जाता है या एंटीबॉडी समाधान को सेंट्रलाइज्ड नहीं किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: pharyngeal आर्क (PA) और PAA के सरफेसिंग । कॉन्फोकल इमेज में पीएए के स्थान की पहचान करने के लिए 2डी सिटटल व्यू(ए)का उपयोग किया जाता है। एक कोरोनल ऑर्थो स्लाइसर(ए, येलो लाइन)PAAs के माध्यम से जगह है। इसके बाद इमरिस में डिस्टेंस ड्राइंग टूल का इस्तेमाल करते हुए कोरोनल ओरिएंटेशन में फेरेंगल आर्क(बी)और पीएए(सी)सामने आते हैं । दूरी ड्राइंग उपकरण, 10 माइक्रोन के लिए सेट, 3rd pharyngeal आर्क(बी)या PAA(सी)की परिधि का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है । रूपरेखा पूरे मेहराब(बी', सी'के माध्यम से हर 10-25 स्लाइस तैयार कर रहे हैं । रूपरेखा को फ़रेंगल आर्क(बी"या पीएए(सी"की 3 डी सतह उत्पन्न करने के लिए जोड़ा जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एक PAA और एक जाल में चुनाव आयोग की संख्या का परिमाणीकरण । 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग पीएए में या ईसी प्लेक्सस में पोत संरचना और ईसी मार्कर की अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए अलग से किया जाता है। पैनल ए-ए 'पीएए (ए, पीला)और प्लेक्सस(ए', गुलाबी)में VEGFR2 की अभिव्यक्ति दिखाते हैं। पैनल ए "पीएए और प्लेक्सस VEGFR2 अभिव्यक्ति के विलय को दिखाता है। पैनल बी-बी ' पीएए(बी, लाल)और प्लेक्सस(बी', ग्रीन)में ईआरजी की अभिव्यक्ति दिखाते हैं । पैनल बी "पीएए और प्लेक्सस के विलय को दिखाता है। सी-सी'। इमरिस में स्पॉट फंक्शन का उपयोग पीएए या प्लेक्सस में ईसीएस की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पीएए में प्रत्येक ईआरजी-पॉजिटिव सेल(सी, रेड)या प्लेक्सस(सी', ग्रीन)को एक ही ईसी को चिह्नित करने के लिए एक ही स्थान सौंपा जाता है। सी-डी में तीर एक उदाहरण ईआरजी-पॉजिटिव, VEGFR2-नकारात्मक स्थान को दिखाता है जो इमरिस स्पॉट फ़ंक्शन द्वारा उत्पन्न किया गया है। इस स्थान को मात्राकरण से बाहर रखा गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

3 डी में माउस भ्रूण में एंडोथेलियम की कल्पना करने की क्षमता ने उनके विकास3में नई अंतर्दृष्टि प्रदान की है । यहां हम एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो भ्रूण के उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3डी इमेजिंग, संवहनी कनेक्टिविटी की दृश्यकरण और पीएए गठन के मात्रात्मक विश्लेषणों के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल को देखने के लिए कैसे आनुवंशिक परिवर्तन या पर्यावरण अपमान पीएए विकास प्रभाव नियोजित किया जा सकता है । यहां रिपोर्ट की गई प्रक्रिया PAA गठन की कल्पना करने और ईसी नंबर की मात्रा निर्धारित करने के लिए VEGFR2 और ERG के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करती है; हालांकि, अतिरिक्त एंटीबॉडी का उपयोग आर्क धमनी विकास के अन्य पहलुओं की कल्पना और विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है, जैसे तंत्रिका शिखर भर्ती या चिकनी मांसपेशी सेल भेदभाव। यदि इस प्रक्रिया का उपयोग भ्रूण उत्पत्ति के पहले के चरणों में किया जाना है, तो यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल में पाए गए कुछ एंटीजन (उदाहरण के लिए, ईआरजी) अभी तक व्यक्त नहीं किए जा सकते हैं। इस तरह के DAPI या DRAQ5 या परमाणु टैग ट्रेसर के साथ वंश लेबलिंग के रूप में अंय परमाणु दाग चुनाव आयोग की संख्या की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम हैं: यह सुनिश्चित करना कि 1) भ्रूण समाधान परिवर्तनों के बीच नहीं हो जाते हैं; 2) भ्रूण को एंटीबॉडी ऊष्मायन के बाद अच्छी तरह से धोया जाता है; और 3) कि भ्रूण पूरी तरह से BabB के साथ ऊतक समाशोधन से पहले MeOH के साथ निर्जलित कर रहे हैं ।

ऊतक समाशोधन से पहले मेथनॉल धोता दो उद्देश्यों की सेवा करता है: फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति के कारण फ्लोरेसेंस को खत्म करने के लिए (उदाहरण के लिए भ्रूण में वंश ट्रेसिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले ईजीएफपी या टीडीमैटोटो की अभिव्यक्ति) और ऊतक को निर्जलित करने के लिए। फ्लोरोसेंट प्रोटीन से फ्लोरेसेंस का उन्मूलन इमेजिंग के लिए फ्लोरोफोर्स के किसी भी संयोजन के उपयोग के लिए अनुमति देता है। ईजीएफपी और टीडीटोमैटो (चेरी) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग इन फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, मेओएच को फ्लोरोसेंट प्रोटीन9के फ्लोरेसेंस को संरक्षित करने के लिए टेट्राहाइड्रोफुरन द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है।

हमने पाया है कि जिन भ्रूणों को बाब समाशोधन से पहले ठीक से निर्जलित नहीं किया गया है, वे प्रकाश बिखरने के कारण छवि के लिए मुश्किल हैं । बीएबी एक हाइड्रोफोबिक समाधान है जिसके लिए अपारदर्शी ऊतक को साफ करने के लिए एक कार्बनिक विलायक में पूर्ण निर्जलीकरण की आवश्यकता होती है। पूर्ण समाशोधन भ्रूण10,11के भीतर गहरे संभव स्तर पर छवियों को प्राप्त करने की क्षमता सुनिश्चित करता है । इस प्रोटोकॉल में, हमने अपने प्रयोगों के समय अपनी लंबी कार्य दूरी और उपलब्धता के कारण 20x जल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग किया। तेल विसर्जन उद्देश्य इस प्रोटोकॉल के लिए बेहतर उपयुक्त हैं, क्योंकि बाब और तेल में पानी और बाब की तुलना में करीब अपवर्तक सूचकांक होते हैं। हालांकि, अपवर्तक सूचकांक में अंतर के बावजूद, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले जल विसर्जन उद्देश्य ने उत्कृष्ट छवि गुणवत्ता प्रदान की।

इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं हैं। यहां उपयोग किए जाने वाले बम्ब समाशोधन विषैले और संक्षारक11,12,13हैं . बाब गोंद और प्लास्टिक को भंग कर देता है। यदि इमेजिंग के दौरान नमूनों को ठीक से नहीं संभाला जाता है, तो माइक्रोस्कोप ऑब्जेक्टल लेंस को बाब द्वारा क्षतिग्रस्त किया जा सकता है जो कवरस्लिप में दरारों या फास्ट वेल बंपर और कवरस्लिप के बीच टूटी हुई सील के माध्यम से नमूने से बच सकता है। स्पष्टता जैसे कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग नहीं करने वाले तरीकों को साफ़ करने के तरीकों का उपयोगविकल्प 10,11,,14के रूप में किया जा सकता है।, स्पष्टता के अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान में पानी के समान एक अपवर्तक सूचकांक होता है, जो पानी विसर्जन उद्देश्य का उपयोग करते समय इसे एक उपयुक्त समाशोधन विधि बनाता है। इस प्रोटोकॉल की एक अतिरिक्त सीमा यह है कि इसे केवल गैर-जीवित ऊतकों पर किया जा सकता है, इस प्रकार लाइव इमेजिंग के लिए इसके आवेदन को रोकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इस पांडुलिपि को सावधानीपूर्वक पढ़ने और संपादन के लिए ब्रिएना अलेक्जेंडर, काओलान ओ डोनेल और माइकल वारकला का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान के एनआईएच R01 HL103920, R01 HL134935, R21 OD025323-01 से एसए के वित्तपोषण द्वारा समर्थित किया गया था; एजेआर को NHLBI HL103920-08S1 और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ आर्थराइटिस एंड मस्कुलोस्केलेटल एंड स्किन डिजीज ट्रेनिंग ग्रांट T32052283-11 द्वारा समर्थित है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x PBS MP Biomedicals PBS10X02
20x water immersion objective Nikon MRD77200
Agarose Bio-Rad Laboratories 1613101
Alexa Fluor 488 anti-goat Invitrogen A-11055
Alexa Fluor 555 anti-mouse Invitrogen A-31570
Analysis Software Imaris 9.2.0
Benzyl Alcohol Sigma-Aldrich 305197
Benzyl Benzoate Sigma-Aldrich 8.18701.0100
Cover Slips VWR 16004-312
DAPI (5 mg/mL stock) Fisher Scientific D3571
Eppendorf Tubes (2.0 mL) Fisher Scientific 05-408-138
Ethanol VWR 89370-084
Falcon tubes (50 mL) Corning 352098
Fast wells Grace Bio Labs 664113
Forceps Roboz RS-5015
Goat anti-VEGFR2 R&D Systems, Inc. AF644
Methanol VWR BDH1135-4LP
Microscope Nikon A1HD25
Mouse anti-ERG Abcam ab214341
Normal Donkey Serum Sigma-Aldrich D9663
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15710
Pasteur pipets Fisher Scientific 13-678-20D
Petri dishes (35 mm) Genesee Scientific 32-103
Petri dishes (60 mm) Genesee Scientific 32-105
Plastic Molds VWR 18000-128
Scapels Exelint International Co. 29552
Triton-X-100 Fisher Scientific BP 151-500

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 157 एंडोथेलियल कोशिकाएं फैरंगियल आर्क धमनी विकास पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस टिश्यू क्लियरिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी 3 डी पुनर्निर्माण
पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और 3 डी पुनर्निर्माण का उपयोग करके Pharyngeal आर्क धमनियों का दृश्य और विश्लेषण
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Ramirez, A., Astrof, S.… More

Ramirez, A., Astrof, S. Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction. J. Vis. Exp. (157), e60797, doi:10.3791/60797 (2020).

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