Summary
Levende billeddannelse af lysosomal exocytose på mikropatterned celler giver mulighed for en rumlig kvantificering af denne proces. Morfologi normalisering ved hjælp af mikropatterner er et fremragende værktøj til at afdække generelle regler om den rumlige fordeling af cellulære processer.
Abstract
Levende billeddannelse af pHluorin mærket Opløselig N-ethylmaleimid-følsomme-faktor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associeret membran protein 7 (VAMP7) ved total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM) er en enkel måde at udforske sekretion fra lysosomal rum. Drage fordel af cellekultur på micropatterned overflader til at normalisere celleform, en række statistiske værktøjer blev anvendt til at udføre en rumlig analyse af sekretoriske mønstre. Ved hjælp af Ripley's K funktion og en statistisk test baseret på den nærmeste nabo afstand (NND), bekræftede vi, at sekretion fra lysosomer ikke er en tilfældig proces, men viser betydelig klyngedannelse. Bemærk, vores analyse viste, at exocytose begivenheder er også grupperet i nonadhesion områder, hvilket indikerer, at vedhæftning molekyler er ikke de eneste strukturer, der kan fremkalde sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Alligevel fandt vi, at celle vedhæftning forbedrer klyngedannelse. Ud over præcist definerede klæbende og ikke-vedhæftige områder, den cirkulære geometri af disse mikromaterialer tillader brug af polære koordinater, forenkle analyser. Vi brugte KDE (Kernel Density Estimation) og den kumulative fordelingsfunktion på polarkoordinater for exocytosehændelser til at identificere berigede områder af exocytose. I ringformede mikroceller forekom klyngedannelse ved grænsen mellem de klæbende og ikke-vedhæftige områder. Vores analyse illustrerer, hvordan statistiske værktøjer kan anvendes til at undersøge rumlige fordelinger af forskellige biologiske processer.
Introduction
Exocytose er en universel cellulær proces, hvor en vesicle sikringer med plasmamembranen og frigiver dens indhold. Vesicle kan enten smelte helt sammen med plasmamembranen (fuld fusion) eller skabe en fusion pore, der forbliver åben i en begrænset periode (kiss-and-run)1. For eksempel frigives nysyntede proteiner i det ekstracellulære medie fra vesikler, der kommer fra Golgi-komplekset. Denne biosyntetiske, anterograde vej er ur, især i flercellede organismer, at udskille signalering peptider (f.eks hormoner, neurotransmittere) og ekstracellulære matrix komponenter (f.eks kollagen), samt at trafik transmembrane proteiner til plasmamembranen. Derudover kan sekreter forekomme fra forskellige endosomer: 1) genanvendelse endosomer med henblik på at genbruge transmembrane proteiner; 2) multivesicular organer (MVBs) til at frigive exosomer; og 3) lysosomer til frigivelse af proteolytiske enzymer. Endosomal sekretion har vist sig at være vigtigt for neurite udvækst, pseudopodia dannelse, plasma membran reparation, og ATP-afhængige signalering2.
At studere exocytose på enkelt celleniveau, flere teknikker har været ansat. Patch-clamp giver mulighed for påvisning af enkelte exocytose hændelser med en høj tidsmæssig opløsning i en bred vifte af levende celler3. Denne metode indeholder dog ikke oplysninger om lokalisering af exocytosehændelser, eller fra hvilket rum den forekommer. Elektronmikroskopi giver mulighed for direkte visualisering af exocytiske hændelser med høj rumlig opløsning, og i kombination med immunmærkning giver oplysninger om specificiteten af de involverede rum og molekyler. En ulempe ved denne tilgang er manglen på oplysninger om dynamikken i processen, samt dens manglende evne til at udføre høj-throughput undersøgelser. Lysmikroskopi tilgange såsom samlede interne refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM), som udnytter evanescent feltet til at belyse fluorophores i nærheden af coverslip (100 nm), giver god tidsmæssig og rumlig opløsning til at studere exocytose begivenheder. Men, denne metode er kun kompatibel med klæbende celler og kan kun anvendes på ventrale / ringere del af celler.
Bemærk, plasmamembranen afslører betydelig heterogenitet baseret på klæbende komplekser, der kun er til stede i begrænsede områder. Denne heterogenitet begrænserf.eks. Tilsvarende er det for nylig blevet rapporteret, at sekretion fra Golgi-komplekset er koncentreret på "hot spots" i plasmamembranen5. Desuden er det kendt, at visse laster udskilles gennem fokal-vedhæftning-associeret exocytose6. Der bør derfor lægges særlig vægt på spørgsmålet om, hvorvidt exocytosehændelser er tilfældigt fordelt i rummet, eller om de er koncentreret på bestemte områder af plasmamembranen. Flere statistiske værktøjer baseret på Ripley's K-funktion er blevet foreslået at undersøge dissespørgsmål 7,8,9. Vores tilgang kombinerer disse værktøjer med mikropattering til at styre celleform og plasma membran heterogenitet. Ud over at give et middel til at skelne mellem klæbende og ikke-vedhæftige områder, denne teknik giver også mulighed for sammenligning på tværs af forskellige celler og betingelser og øger styrken af statistiske analyser.
Her anvender vi en række statistiske værktøjer til at studere den rumlige fordeling af exocytose hændelser fra lysosomal rum overvåget af TIRFM levende celle billeddannelse af VAMP7-pHluorin i ringformet mikropattern-normaliseret hTert-RPE1 celler. Det blev bekræftet, at sekretion fra lysosomer ikke er en tilfældigproces 8,9 og at exocytose begivenheder udviser klyngedannelse. Bemærk, at vi fandt, at exocytose begivenheder er også grupperet i ikke-vedhæftige områder, hvilket indikerer, at vedhæftning molekyler er ikke de eneste strukturer, der kan fremkalde hemmelighedsfulde hot spots på plasmamembranen. Ikke desto mindre, celle vedhæftning gjorde forbedre klyngedannelse. Konsekvent identificerede vores analyse berigede områder af exocytose, der var placeret ved grænsen mellem klæbemidlet og ikke-vedhæftige områder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af mikropatternede celler
- Transinfektion af celler
- En dag før transfektion, frø 2,5 x 106 hTERT-RPE1 celler i en brønd af en 12 brønd plade (2 x 2 cm) i 1 ml medium.
- På transfektionsdagen forberedes transinfektionsblandingen med VAMP7-pHluorin plasmid (100 μL buffer, 0,8 μg DNA, 3 μL transfektionsblanding). Inkuber i 10 min.
BEMÆRK: VAMP7 er en lysosomal v-SNARE, sammensmeltet med et luminalt pHluorin-mærke. PHluorinsonden slukkes ved lav pH, men under exocytose protoner frigives og pHluorin begynder at udsende et signal10,11. - Tilsæt transfektionsblandingen til cellerne i deres medium.
- Skift mediet 4 timer efter tilsætning af transfektionsblandingen på cellerne.
- Brug cellerne til eksperimenter i løbet af de næste 24-48 timer.
- Mikropattern forberedelse (fotolitografi metode)
- Dækslerne (25 mm diameter) vaskes i ethanol, og de tørres i 5 min.
- Aktiver dækslips ved belysning under dyb UV i 5 min.
- Opret et fugtigt kammer ved grundigt befugtning en køkkenrulle, som en paraffin film er placeret. Der tilsættes dråber (30 μL til 22 mm dæksl) af Poly-L-Lysin-graft-Polyethylenglycol (PLL-g-PEG) opløsning (0,1 mg/ml, 10 mM HEPES, pH = 7,4) og læg dækslerne med den aktiverede overflade på. Luk det fugtige kammer med en top og inkuber dækslæber i 1 time.
- Dæksler 2x i PBS og 1x i destilleret vand og lad dem tørre.
- Vask kvarts fotomaske med destilleret vand og derefter med ethanol eller propanol. Tør fotomasken med filtreret luftstrøm.
BEMÆRK: Kvarts fotomaske er belagt på den ene side med antireflective krom, der indeholder huller i form af mikropatterner. En fotomaske, der indeholder ringformede mikropatterner på 37 μm, anvendes i denne protokol. Når dyb UV er skinnede på fotomasken, kan lyset kun passere gennem disse huller12. - Udsæt fotomasken (krombelagt side) for dyb UV i 5 min. for at rengøre overfladen.
- Tilsæt små vanddråber (10 μL for en 20 mm dækslæb) på fotomaskens krombelagte side. Placer dækslæbet med deres PLL-g-PEG-behandlede side på dråben og tør det ekstra vand. Sørg for, at der ikke dannes luftbobler mellem masken og dækslerne.
BEMÆRK: Vandets kapillær kraft vil immobilisere dækslerne. - Udsæt fotomasken for dyb UV i 5 min. med den ikke-krombelagte side op (dækslerne er fastgjort på den nederste overflade).
BEMÆRK: Lyset kan kun passere gennem hullerne og ændre PLL-g-PEG-behandlede overflade af dæksæber under fotomasken. - Fjern dækslæberne fra fotomasken ved at tilsætte overskydende vand.
BEMÆRK: Dækslæber skal hurtigt flyde af. - Inkuber dæksæberne i en opløsning af ekstracellulære matrixproteiner (50 μg/ml fibronectin, 5 μg/ml fluorescerende fibrinogen fortyndet i vand) på paraffinfilm i et fugtigt kammer (som i trin 1.2.3) i 1 time under en laminar flow-emhætte for at undgå kontaminering.
BEMÆRK: Forsøget kan sættes på pause på dette tidspunkt ved at opbevare dækslerne i PBS ved 4 °C.
- Cellesåning på mikropatterned overflader
- Brug en magnetisk dækslædholder, der passer til størrelsen af de mikropatterned coverslips til montering af dækslerne. På erhvervelsesdagen opvarmes dækslæbholderen til 37 °C for at undgå termisk stød for cellerne under de efterfølgende trin.
- Mønstermediet forberedes ved at supplere DMEM/F12-mediet med 20 mM HEPES og 2 % penicillin/streptomycin.
- Læg dækslæberne i holderen med den mikropatterned side op og tilsæt mønstermediet, så snart dækslet er på holderens bund. Tilsæt forseglingen og immobilisere med den magnetiske enhed. Fyld dækholderen med mønstermediet og luk den med glaslåget.
BEMÆRK: Vær hurtig, for ikke at lade dækslæbet tørre. Dækslingholderen må ikke vaskes med ethanol mellem forsøgene, da forseglingen kan beholde noget ethanol, som kan reagere med PLL-g-PEG og resultere i cellestress. Dækslingholderen vaskes kun med sæbevand. Desuden kan leddet inkuberes i mønstermediet ved 37 °C i 1 time for at fortynde restproduktet. - Indsaml transfekterede hTERT-RPE1-celler ved trypsinisering (0,5 ml for en 12 brøndplade) og tilsæt 1 ml 10% FBS DMEM/F12-medium.
- Der tilsættes 0,5 x 106 transficerede hTERT-RPE1-celler til dækslæbholderen, og den skal lukkes igen. Inkuber i 10 min i rugemaskinen.
- Dæksletholderen 5x med mønstermedium for at fjerne de 10 liggende celler og den resterende FBS ved at tilsætte mønstermediet med en pipette og aspirere mediet med en anden pipette for at skabe et vaskeflow. Hold altid et lille mønstermedium i dæksletholderen for at undgå tørring af cellerne på den mikropatterned coverslip, hvilket vil føre til celledød.
- Inkuber i inkubatoren i 3 timer for at tillade fuld cellespredning.
2. Erhvervelse af exocytosedata
- Billeddannelse af exocytose hændelser
- Placer dækslæbholderen under en TIRM. Signalet skal registreres af et følsomt kamera, der er konfigureret med det bedste billedformat til rådighed.
BEMÆRK: I dette eksperiment blev der brugt en 100x linsemålsætning og et EMCCD-kamera med 512 x 512 pixeldetektionsområde, hvilket gav anledning til en pixelstørrelse på 160 nm. - Søg efter en celle, der udtrykker VAMP7-pHluorin, der er fuldt spredt(Figur 1A).
BEMÆRK: Celler, der udtrykker VAMP7, kan tydeligt identificeres, fordi de udviser et grønt signal. - Skift laserens vinkel, indtil en TIRF vinkel, der gør det muligt at visualisere VAMP7-pHluorin exocytose begivenheder er nået. Udfør en 5 min erhvervelse med en frekvens, der er kompatibel med exocytosis hastighed og tidsskala (typisk 3 Hz, Figur 1D) ved hjælp af mikroskop software.
BEMÆRK: hTERT-RPE1-celler har en lysosomal sekretorisk hastighed på ca. 0,3 Hz på mikropatterner. Lysosomal exocytose har en typisk varighed på 1 s. Det er kendetegnet ved en topintensitet efterfulgt af et eksponentielt forfald. Sondens diffusion skal være tydelig på nuværende tidspunkt (figur 1B, C). - For hver celle skal du også foretage en erhvervelse af mikropattern ved hjælp af mikroskopsoftwaren (Figur 1A).
- Placer dækslæbholderen under en TIRM. Signalet skal registreres af et følsomt kamera, der er konfigureret med det bedste billedformat til rådighed.
- Erhvervelse af exocytose koordinater
- Åbn den erhvervede film med ImageJ/FIJI. Brug fil | Import | Billedsekvens. Find exocytose hændelser med øjet. En exocytose begivenhed er kendetegnet ved fremkomsten af et lyst signal, der spreder udad (Figur 1).
- Brug punktværktøjet til at markere midten af den exocytiske hændelse. Brug Analysér | Mål for at måle X- og Y-koordinaterne samt den tidsmæssige koordinat (skivenummer). Udfør disse målinger for alle exocytose begivenheder i filmen.
- Gem resultaterne (Resultater | Sag | Gem som). Forbered en tekstfil for hver analyseret celle med navnet "Resultater(cell_name).txt", der indeholder udsnits-, X-koordinaterne og Y-koordinaterne for alle exocytosehændelser i den pågældende rækkefølge.
Tekstfilen skal se sådan ud:
ID X Y Ferets radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
BEMÆRK: Vær omhyggelig med at udskifte alle kommaer med punkter. - Mål midten og diameteren af hver celle ved hjælp af "Oval Tool". Sæt en perfekt cirkel (brug ikke en oval) og brug "Measure" for at opnå X- og Y-koordinaterne og Ferets diameter. Gem hver celles identitet (ID), X- og Y-koordinater, Ferets diameter og radius (diameter/2) i en tekstfil med navnet "Sfærisk parameter.txt".
Tekstfilen skal se sådan ud:
ID X Y Ferets radius
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
BEMÆRK: Vær omhyggelig med at udskifte alle kommaer med punkter. - Mål tykkelsen af mikromønsterringen (vedhæftningslængde) med det lige værktøj, og gem celle-id'et, celleradius (fra filen: "Sfærisk parameter.txt") og adhæsionslængde i en tekstfil med navnet "Mønsterparameter.txt". Den normaliserede friktionslængde beregnes ved at dividere friktionslængden med celleradius.
BEMÆRK: Vær omhyggelig med at udskifte alle kommaer med punkter.
Filen skal se sådan ud:
ID Celle radius vedhæftning længde Normaliseret vedhæftning længde
RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826
3. Enkeltcellesydleanalyse
- R-pakke og installation
BEMÆRK: R-pakken til denne analyse udnytter Spatstat-pakken13 til at beregne den todimensionale (2D) tæthed og Ripleys K-funktion. Koden er open source og bruger tekstfiler, der tidligere er beskrevet.- Download og installer R fra https://www.r-project.org/ (version 3.5.2 blev brugt i denne analyse).
- Download pakken (og demodatasættet) fra: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- Installer pakken på R Studio ved hjælp af "Tools" ved hjælp af "Installer pakker". Vælg "Package Archive File (.zip; .tar.gz)" for kategorien "Installer fra:" og vælg pakkefilen. Tryk på "Installer".
- Læg pakken med funktionen"library("ExocytosisSpatialAnalysis")" ved at skrive denne kommando i R-studiet og trykke på "Enter".
- Kør pakken med funktionen "ESA() "ved at skrive denne kommando i R-studiet og trykke påEnter".
BEMÆRK: Der åbnes en brugergrænseflade. - Vælg mappen til datasættet (.txt-filer) og en mappe til outputområder.
BEMÆRK: Parametre for analysen (se teksten nedenfor) kan ændres via en brugergrænseflade. - Dette script starter og udfører automatisk analysen. Det giver .pdf-filer af tilsvarende plots og .txt filer, der indeholder numeriske resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De spatiotemporale egenskaber exocytose hændelser blev analyseret fra lysosomer visualiseret af VAMP7-pHluorin10,11 i hTert-RPE1 celler. hTert-RPE1-celler er ikke-transformerede celler , der anvender godt til mikropatterning og har været flittigt anvendt i tidligere mikropatternbaseredeundersøgelser 4,14. VAMP7 er en lysosomal v-SNARE15, der blev mærket med super eklipti pHluorin på sin N-terminus og er placeret i lumen af lysosomet. Inde i cellen blev pHluorinsonden slukket af lysosomets lave pH, men under exocytose pHluorin begyndte at udsende et signal, fordi pH-værdien steg på grund af protonudgivelse. VAMP7-pHluorin blev overvåget af TIRFM levende celle billeddannelse på ringformede mikropatterner (Figur 1A–B). PHluorinsignalet udviste en top under exocytose, der repræsenterede hurtig frigivelse af lysosomale protoner efterfulgt af eksponentiel forfald, der repræsenterer sondens 2D-diffusion vedplasmamembranen ( Figur 1C). hTERT-RPE1-celler præsenterede en vigtig lysosomal sekretion med en gennemsnitlig exocytosehastighed på 0,28 Hz (Figur 1D). Der blev imidlertid observeret høj heterogenitet i exocytosehastigheden på tværs af celler (standardafvigelse på 0,15 Hz), hvilket indikerer, at der var stærk celle-til-celle variation i udskillelsen fra lysososomerne.
Enkeltcellesgummisk analyse for at undersøge, om exocytose af lysosomer er tilfældig
Det var muligt at visualisere 2D-fordelingen af exocytose af KDE, som tidligere udført for endomembranøse rum14, som kunne afsløre forskelle i lokale tætheder (Figur 2B). Denne fremgangsmåde er relevant for visualisering af den gennemsnitlige fordeling af en population af celler, men mindre informativ i enkelte celler på grund af det begrænsede antal hændelser, der opdages (titusindvis i forhold til de flere tusinde, der opnås ved befolkningsbaseret analyse) og høj celle-til-celle variation. For eksempel gav denne tilgang os ikke mulighed for at vurdere, om fordelingen af exocytose hændelser fulgte en komplet rumlig tilfældighed (CSR) adfærd (dvs. svarede til en ensartet punktfordeling i et observeret område for en enkelt celle). Et pointmønster følger en CSR-adfærd, når de to følgende hypoteser er sande: 1) hvert punkts placering er uafhængig af de andre punkters; og 2) sandsynligheden for at finde et punkt i en underregion afhænger kun af forholdet mellem denne underregions areal og det samlede areal. Der er tre mulige afvigelser fra CSR: 1) klyngedannelse (dvs. aggregering); 2) spredning (dvs. bestilling med konstant afstand); eller 3) en blanding af klyngedannelse og spredning (figur 2C). Ripleys K-funktion blev brugt til at besvare dette spørgsmål som i tidligereanalyser 7,8,9 ( Figur2D). Ripley's K funktion er tæt på πr² (med d er den normaliserede afstand fra en begivenhed) i tilfælde af CSR, men overlegen (respiratorisk ringere) til πr² i tilfælde af klyngedannelse (respiratorisk spredning). Ved at trække πr² fra Ripleys K-funktion skal den teoretiske CSR-kurve være ved 0. Simuleringer af CSR-tilfælde blev udført med det samme antal punkter som de observerede exocytosehændelser for at vurdere godheden i csr-sagen (grå kuvert omkring den teoretiske kurve). Den transformerede Ripleys K-funktion, der blev anvendt på forsøgsdataene, udviste positive værdier uden for konvolutten, hvilket indikerer klyngedannelse (Figur 2D).
For at undersøge, om klyngedannelse af exocytosehændelser skyldtes cellevedhæftning som tidligere rapporteret6, udførte vi en lignende analyse af data fra udelukkende det ikke-vedhæftige celleområde i midten (Figur 2A, klæbeområde i gråt, ikke-vedhæftigt cellecenterområde i hvid). Bemærk, at vi fandt, at exocytose begivenheder i det ikke-vedhæftige område også var grupperet(Figur 2E),hvilket indikerer, at vedhæftning molekyler ikke var de eneste strukturer, der inducerede hemmelighedsfulde hot spots på plasmamembraner.
Da Ripleys K-funktion er en beskrivende statistik, der ikke giver en P-værdi, blev der oprettet en statistisk test, der sammenlignede cellulære exocytosehændelser med CSR-simuleringer. Den nærmeste naboafstand NND(i) metode blev brugt. NDD er defineret som den minimale euklimatiske afstand mellem et punkt i og alle andre punkter. Den gennemsnitlige NND(i) fra alle exocytic hændelser i en celle blev beregnet og sammenlignet med CSR opnået med et stort antal Monte Carlo simuleringer (figur 2F). Vi fandt, at den gennemsnitlige NND af den enkelte celle analyseret i figur 2F var lavere end gennemsnittet af den simulerede fordeling af CSR-sagen, hvilket indikerer tættere naboer i gennemsnit og dermed klyngedannelse. I tilfælde af spredning forventedes der en højere værdi for den gennemsnitlige NND (figur 2C). Denne sammenligning gjorde det muligt at beregne en P-værdi for hver celle. P-værdien repræsenterer den procentdel af simuleringer, der udviste en mere ekstrem NND (på en tosidet måde). For at være præcis blev den upartiske P-værdi beregnet som (k+1)/(N+1), hvor N var det samlede antal Monte Carlo simuleringer (10.000), og k antallet af disse simuleringer, der var mere ekstreme end den observeredemålepunkt 16. Histogrammet af alle P-værdier blev afbildet for det samlede celleområde (Figur 2G) og det ikke-vedhæftige celleområde (Figur 2I). Hvis H0: "Exocytose er en CSR-proces" var sandt, forventedes en ensartet fordeling af P-værdier. Hvis H0 var falsk, forventedes et højdepunkt ved en lav P-værdi. Udførelse af en Kolmogorov-Smirnov test på P-værdien histogrammer, en P-værdi ringere end 0,001 blev opnået, viser en betydelig afvigelse fra CSR i begge tilfælde (Figur 2G og 2I). Desuden viste en klyngekoefficient på 0,955 for det samlede celleareal og 1.000 for det ikke-vedhæftige celleområde, at lysosomal exocytose var en klyngeproces uafhængigt af cellevedhæftning. Klyngekoefficienten repræsenterer den procentdel af celler, der var tættere på en klyngefunktionsfunktion end dispersion. Dette resultat var i overensstemmelse med Ripley's K funktion.
For at evaluere cellevedhæftnings rolle i klyngedannelse sammenlignede vi den gennemsnitlige NND i det ikke-vedhæftige område med den i det samlede område for hver enkelt celle (Figur 2H). Fordi den gennemsnitlige NND var omvendt proportional med overfladetætheden, normaliserede vi den gennemsnitlige NND for det ikke-vedhæftige område ved hjælp af homotesitet. Den signifikant større gennemsnitlige NND for exocytosehændelser i det ikke-vedhæftige område indikerede mindre klyngedannelse (figur 2H). Således, selv om sekretion fra lysosomer klynger i ikke-vedhæftige områder, celle vedhæftning syntes at forbedre klyngedannelse.
Rumlig analyse af exocytosehændelser ved hjælp af polære koordinater
Den cirkulære geometri af den ringformede mikropattern tillod brugen af de fælles polære koordinater, som forenklede analyser, som tidligere fundet17. Hver exocytose begivenhed kunne således beskrives ved en modulus (afstand fra oprindelsen, her midten af det nederste plan af cellen) og en vinkel (i henhold til en fast vilkårlig akse). Derudover kan modulus normaliseres ved at dividere det med cellens radius. Histogrammet af exocytose hændelser blev plottet i henhold til modulus for en repræsentativ celle (Figur 3A). Dette afslørede en top omkring grænsen mellem de klæbende / ikke-vedhæftige områder. Der blev også observeret en stor variation mellem cellerne. Derfor har vi samlet n = 22 celler for at opnå en gennemsnitlig fordeling af exocytose hændelser. Men for at give den samme statistiske vægt til hver celle blev det samme antal hændelser fra hver celle tilfældigt udvalgt. Denne tilfældige udvælgelse ændrede ikke de samlede mønstre, der blev set. For at opnå en kontinuerlig gennemsnitlig fordeling af de enkelte fordelinger af enkelte celler blev der anvendt en KDE (figur 3B). Men da den normaliserede modulus er mellem 0 og 1, måtte der tages hensyn til kantforholdene. Der blev brugt en betakerne, der ændrer figur ud forkanterne 18. En fejl band blev beregnet med en bootstrap strategi. Den observerede gennemsnitlige fordeling blev sammenlignet med en hypotetisk CSR-fordeling, der viste flere hændelser ved en højere modulus, fordi området steg med en højere modulus. Da integreretheden af en sandsynlighedstæthed skulle være en, var CSR-fordelingen 2r (med er den normaliserede radius uden enheder). Et konfidensbånd blev beregnet omkring den teoretiske kurve ved hjælp af et stort antal CSR Monte Carlo simuleringer (5.000 hver). De 1st og 99th percentiler af modulus fordelingen fra disse simuleringer blev plottet. Vi fandt, at den gennemsnitlige fordeling af exocytose begivenheder afveg fra den hypotetiske en på 0,7rmax,hvilket svarer til begyndelsen af det klæbende område af cellen.
Vi forsøgte at teste, om den observerede fordeling af modulus var forskellig fra den teoretiske. Da de gennemsnitlige fordelinger, som i dette tilfælde, ikke kan testes nøjagtigt ved en godhedstest (f.eks. Denne metode måler forskellen mellem variationen mellem en population og variationen i en population og muliggør således uafhængig testning for hver koordinat (dvs. modulus og vinkel)17. Denne test blev brugt til at sammenligne vores data med simulerede data, der repræsenterer CSR exocytose hændelser (det samme antal celler og exocytose hændelser som de observerede data), og fandt en statistisk signifikant forskel i variationerne (p < 0,001 med Wilcoxon-Mann-Whitney test, n = 22 celler), hvilket indikerer, at den observerede gennemsnitlige exocytose distributionsfordeling ikke var CSR. Men når to CSR simuleringer (med 5.000 simuleringer hver) blev sammenlignet, fandt vi, at P-værdien histogram ikke viste en ensartet fordeling, men udstillede et højdepunkt nær 1, hvilket indikerer, at denne test sandsynligvis manglede følsomhed.
Da KDE-vurderingen er baseret på et ikke-trivielt valg af kernebåndbredde og følsom over for kanteffekter, blev den kumulative fordelingsfunktion også beregnet, hvilket overvinder de problemer, der er forbundet med KDE-estimering (Figur 3D). Denne funktion er defineret mellem 0 og 1 og indeholder ingen vilkårlige parametre eller skævheder (f.eks. kantbias). Fejl- og tillidsbåndene blev beregnet på samme måde som for modulus-fordelingen. Den kumulative fordelingsfunktion bekræftede, at exocytosehændelser ikke fulgte en CSR-fordeling, men blev overkoncentreret ved moduli omkring 0,7 amaks. Denne analyse gav os således mulighed for at identificere celleområder, hvor klyngedannelse fandt sted. Et interessant spørgsmål, at dette resultat rejser, er, om overkoncentration på 0,7 rmax var på grund af tilstedeværelsen af klæbende / ikke-vedhæftige områder af ringformet mikropattern eller en effekt af perifere / centrale sekretion områder af celler.
Da den gennemsnitlige fordeling af exocytose hændelser afveg fra CSR-sagen i ikke-vedhæftige såvel som klæbende områder, vi også spekulerede på, hvor exocytose tæthed var højest. Overfladetætheden af exocytose i vedhæftnings- og ikke-vedhæftningsområder blev beregnet og sammenlignet. Vi fandt, at overfladetætheden var lavere i vedhæftningsområdet end i nonadhæsionområdet ved en parret analyse (Figur 3C). Dette kan forklares ved det kraftige fald i exocytose i celleperiferiet (0,85 – 1rmax, Figur 3B).
Figur 1. Eksocytose fra lysosomer i hTert-RPE1-celler: (A) Ringformet mikropattern (rød) og klæbende hTert-RPE1 celle transfekteret med VAMP7-pHluorin (grøn) afbilledet af TIRFM. Pilen viser en exocytose begivenhed. Skalastænger = 10 μm. (B) Kymograph af exocytose hændelser. Pile viser exocytose begivenheder. Skalabar = 2 μm, skalabjælke i tid = 5 s. (C) Normaliseret intensitetsprofil for lysosomal exocytose fra 22 celler. Hvert punkt er et gennemsnit på mindst 1.530 exocytose hændelser. Data præsenteres ± SEM. (D) Exocytose rate af de 22 celler. Den gennemsnitlige +/- standardafvigelse afbildes med rødt. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Rumlig analyse af lysosomale exocytosehændelser. (A) Scatter plot af exocytose begivenheder i løbet af 5 min erhvervelse. Hver prik repræsenterer en exocytose begivenhed. Klæbeområdet vises med gråt. bB) 2D-kernetæthedsestimering (KDE) af spredningsplot af A. Farven repræsenterer den lokale tæthed af exocytose begivenheder. cC) Skematisk repræsentation af mulige punktmønstre. De fire tilfælde, Complete Spatial Randomness (CSR), Clustering, Dispersion og Mixed vises, og flere nærmeste naboafstande (NND) afbildes (stiplede linjer) for at vise, hvordan den gennemsnitlige NND faldt i klyngedannelse og øges med spredning. (D)Analyse af en repræsentativ celle ved hjælp af Ripleys K-funktion. Den røde stiplede linje er lig med "Ripley's K-funktion - πr²" for CSR-hændelser, den grå kuvert repræsenterer den anslåede godhed-of-fit fra Monte Carlo simuleringer med det samme antal point som exocytose begivenheder (Nbegivenhed = 81). Den sorte streg er lig med "Ripley's K-funktion – πr²" for observerede exocytosehændelser(N-hændelse = 81). Dens positive afvigelse fra den røde kurve ud fra den grå kuvert indikerer klyngedannelse af exocytose hændelser. Ripley's K-funktion blev normaliseret til at have en maksimal værdi på 1. (E) Analyse af det ikke-vedhæftige område af samme celle ved hjælp af Ripleys K-funktion som i D. Den positive afvigelse fra den røde kurve uden for den grå kuvert indikerer en klyngedannelse af exocytosehændelser i det ikke-vedhæftige område. f)Sammenligning af den gennemsnitlige NND-fordeling fra en repræsentativ celle (rød linje) med KDE for CSR fra Monte Carlo simuleringer (blå kurve). P-værdien blev beregnet som den procentdel af simulerede værdier, der var mere ekstreme end den observerede værdi. gG) P-værdi histogram fra NND-testen som i F for n = 26 celler. Toppen ved lave P-værdier betyder, at null-hypotesen "exocytose følger CSR" blev afvist med en Kolmogorov-Smirnov-test, hvilket indikerer, at lysosomal exocytose ikke var CSR. (H) Box-plot af gennemsnitligE NND fra exocytose hændelser i ikke-vedhæftige områder (hvid) og samlede celleområder (grå). De to datapunkter fra den samme celle samles af en linje. Den gennemsnitlige NND var større i det ikke-vedhæftige område, p < 0,001 med en parret Wilcoxon-test (n = 25 celler), hvilket indikerer betydeligt mindre klyngedannelse i det ikke-vedhæftige område. (I) Samme som G for det ikke-vedhæftige område for n = 26 celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Rumlig analyse af poolede exocytose-hændelser: (A) Histogram af exocytosehændelser af en repræsentativ celle under en 5 min erhvervelse med n = 161 exocytose hændelser som funktion af den normaliserede modulus; 0 repræsenterer cellecentret og 1 celleperiferi. Cellens klæbende område vises med gråt og svarer til moduli fra 0,65-1 for de viste celler. Der er et højdepunkt i begyndelsen af det klæbende område omkring moduli mellem 0,6 og 0,7. B) KDE af exocytose-hændelserne som funktion af den normaliserede modulus for n = 22 celler med 56 hændelser i hver celle 0 repræsenterer cellecentret og 1 celleperiferi. Den gennemsnitlige klæbemiddel område er vist i grå og svarer i gennemsnit til moduli fra 0,61-1. Den stiplede blå kurve er den teoretiske kurve, der forventes i tilfælde af CSR. Denne teoretiske kurve er ledsaget af en kuvert, der repræsenterer 1st-99th percentiler af CSR opnået ved hjælp af Monte Carlo simuleringen. KDE-kurven fra de observerede data er i rødt og ledsaget af et fejlbånd genereret af bootstrapping. Klæbeområdet er i grå +/- SEM. (C)Parret analyse af overfladetæthederne i vedhæftnings- og ikke-vedhæftningsområder. Exocytose overfladetætheden blev beregnet som antallet af hændelser pr. normaliseret område og pr. sekund. Her * p < 0,05 fra en parret studerende t-test (n = 22 celler). Normaliteten blev tidligere testet af en Shapiro-Wilk test. dD) Kumulativ fordelingsfunktion af dataene i B (rød linje) og fra Monte Carlo CSR-simuleringer (stiplet blå linje). Konvolutter blev genereret som i B. Bemærk, at den røde linje afviger fra den teoretiske CSR på omkring 0,7rmax. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi overvågede exocytose hændelser fra lysosomalrummet ved TIRFM levende celle billeddannelse af VAMP7-pHluorin i ringformede mikropattern-normaliserede celler og udførte en streng statistisk analyse af de rumlige parametre for exocytose hændelser. Ved hjælp af den transformerede Ripley's K-funktion og en statistisk test baseret på den nærmeste naboafstand bekræftede vi, at sekretion fra lysosomer ikke er en tilfældigproces 8,,9. Begge statistiske analyser viste overbevisende, at exocytose hændelser udviser klyngedannelse (Figur 2D og 2G). Anvendelse af lignende værktøjer til nonadhesive celle område, fandt vi, at exocytose begivenheder er også grupperet i ikke-vedhæftige områder (Figur 2E og 2I). Således, vedhæftning molekyler, der tidligere er blevet rapporteret til at tillade klyngedannelse6 er ikke de eneste strukturer, der kan fremkalde sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Cellevedhæftning forbedrede klyngedannelse: Den gennemsnitlige nærmeste naboafstand mellem exocytosehændelser var signifikant større i ikke-vedhæftige områder (Figur 2H). Konsekvent identificerede vores analyse baseret på skøn over kernetætheden og den kumulative fordelingsfunktion berigede områder af exocytose, der var placeret ved grænsen mellem de klæbende og ikke-vedhæftige områder i ringformede mikroceller. Mere arbejde er nødvendigt for at bestemme de molekylære mekanismer, der ligger til grund for klyngedannelse, såsom vedhæftning eller en specifik målretning af lysosomet til denne region. Interessant, vi observeret høj heterogenitet i exocytose sats på tværs af hTERT-RPE1 celler (standardafvigelse på 0,15 Hz for gennemsnitlig exocytose sats på 0,28 Hz, Figur 1D), hvilket indikerer, at sekretion fra lysosomer har høj intercellulær variation. Derfor bør delpopulationanalyser overvejes i det fremtidige arbejde. Det ville være særlig interessant at undersøge, om denne variation afspejler mangfoldigheden af lysosomale rum, forskelle i laster eller afhængighed af exocytosemaskiner.
Disse resultater illustrerer, hvordan statistiske værktøjer kan anvendes til at undersøge rumlige parametre for forskellige biologiske processer. Desuden letter mikropatterner studiet af effekten af cellevedhæftning på en upartisk måde ved hjælp af forskellige mikropatterngeometri (f.eks. ringformet versus diskformet). Brugen af runde former letter især analyser, fordi der kan anvendes polære koordinater. Da statistiske værktøjer kræver, at en vis mængde data giver mening, blev celler med mere end 30 hændelser brugt til vores analyse. Der er dog en mulighed for, at celler med 30 eller færre hændelser giver mening. Der kan således udtages prøver af celler med 30 eller færre hændelser for at opnå tilstrækkelige hændelser til analyse til at afgøre, om dette er tilfældet. På samme måde er det vanskeligt at vurdere, hvor mange celler der skal analyseres, især hvis der er en stærk intercellulær variation. En måde at omgå dette på er at vælge det samme antal hændelser tilfældigt fra hver celle for at give den samme statistiske vægt til hver celle, når de grupperes. Vi anbefaler dog, at analyser af færre end 15 celler udføres med forsigtighed. Da den gennemsnitlige fordeling af poolede celler ikke kan testes nøjagtigt ved hjælp af godhedstest (f.eks.17 Selv om denne test gav os mulighed for at finde en statistisk signifikant forskel i variationerne i de gennemsnitlige fordelinger, har vi mistanke om, at denne test har lav følsomhed, fordi P-værdien histogram ikke var flad (dvs. viste ensartet fordeling), når man sammenligner forskellige CSR simuleringer for p værdier tæt på 1. Det kan derfor være nødvendigt at forbedre denne statistiske procedure.
En ulempe ved vores analyser er manuel påvisning af exocytose hændelser, som drastisk reducerer hastigheden af analysen. Begrænsninger i automatisk detektion skyldes ofte stærk heterogenitet i den unikke og enkle parameter, der analyseres (f.eks. intensiteten af exocytose hændelser). Neurale netværk kan være potentielt magtfulde til automatisk detektion, fordi de kan trænes til at genkende mange funktioner.
Analysen her kan anvendes på andre dynamiske processer observeret af TIRFM, såsom sekretion fra andre rum og fordelingen af membranmikrodomæne eller antigenpræsentation. Lignende analyser kan også anvendes på faste celler for at studere den rumlige fordeling af proteiner. Vi håber, at vores arbejde vil øge den stigende interesse for rumlig distribution analyse i cellebiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi anerkender i høj grad Thierry Galli (Center for Psykiatri og Neurovidenskab, INSERM) for at give VAMP7-pHluorin plasmid. Vi takker Tarn Duong for rådgivning om statistisk analyse og medlemmer af GOUD-laboratoriet for frugtbare diskussioner. Forfatterne anerkender i høj grad Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg og PICT-IBiSA @Pasteur) og Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), medlem af den franske nationale forskningsinfrastruktur Frankrig-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. blev støttet af Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC), og P.M. modtog støtte fra Eu's Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) og Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) samt Centre National de la Recherche Scientifique og Institut Curie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
