Kvantificering af spatiotemporale parametre for cellulær exocytose i mikropatterned celler
Summary
Levende billeddannelse af lysosomal exocytose på mikropatterned celler giver mulighed for en rumlig kvantificering af denne proces. Morfologi normalisering ved hjælp af mikropatterner er et fremragende værktøj til at afdække generelle regler om den rumlige fordeling af cellulære processer.
Abstract
Levende billeddannelse af pHluorin mærket Opløselig N-ethylmaleimid-følsomme-faktor Attachment protein REceptor (v-SNARE) Vesicle-associeret membran protein 7 (VAMP7) ved total intern refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM) er en enkel måde at udforske sekretion fra lysosomal rum. Drage fordel af cellekultur på micropatterned overflader til at normalisere celleform, en række statistiske værktøjer blev anvendt til at udføre en rumlig analyse af sekretoriske mønstre. Ved hjælp af Ripley’s K funktion og en statistisk test baseret på den nærmeste nabo afstand (NND), bekræftede vi, at sekretion fra lysosomer ikke er en tilfældig proces, men viser betydelig klyngedannelse. Bemærk, vores analyse viste, at exocytose begivenheder er også grupperet i nonadhesion områder, hvilket indikerer, at vedhæftning molekyler er ikke de eneste strukturer, der kan fremkalde sekretoriske hot spots på plasmamembranen. Alligevel fandt vi, at celle vedhæftning forbedrer klyngedannelse. Ud over præcist definerede klæbende og ikke-vedhæftige områder, den cirkulære geometri af disse mikromaterialer tillader brug af polære koordinater, forenkle analyser. Vi brugte KDE (Kernel Density Estimation) og den kumulative fordelingsfunktion på polarkoordinater for exocytosehændelser til at identificere berigede områder af exocytose. I ringformede mikroceller forekom klyngedannelse ved grænsen mellem de klæbende og ikke-vedhæftige områder. Vores analyse illustrerer, hvordan statistiske værktøjer kan anvendes til at undersøge rumlige fordelinger af forskellige biologiske processer.
Introduction
Exocytose er en universel cellulær proces, hvor en vesicle sikringer med plasmamembranen og frigiver dens indhold. Vesicle kan enten smelte helt sammen med plasmamembranen (fuld fusion) eller skabe en fusion pore, der forbliver åben i en begrænset periode (kiss-and-run)1. For eksempel frigives nysyntede proteiner i det ekstracellulære medie fra vesikler, der kommer fra Golgi-komplekset. Denne biosyntetiske, anterograde vej er ur, især i flercellede organismer, at udskille signalering peptider (f.eks hormoner, neurotransmittere) og ekstracellulære matrix komponenter (f.eks kollagen), samt at trafik transmembrane proteiner til plasmamembranen. Derudover kan sekreter forekomme fra forskellige endosomer: 1) genanvendelse endosomer med henblik på at genbruge transmembrane proteiner; 2) multivesicular organer (MVBs) til at frigive exosomer; og 3) lysosomer til frigivelse af proteolytiske enzymer. Endosomal sekretion har vist sig at være vigtigt for neurite udvækst, pseudopodia dannelse, plasma membran reparation, og ATP-afhængige signalering2.
At studere exocytose på enkelt celleniveau, flere teknikker har været ansat. Patch-clamp giver mulighed for påvisning af enkelte exocytose hændelser med en høj tidsmæssig opløsning i en bred vifte af levende celler3. Denne metode indeholder dog ikke oplysninger om lokalisering af exocytosehændelser, eller fra hvilket rum den forekommer. Elektronmikroskopi giver mulighed for direkte visualisering af exocytiske hændelser med høj rumlig opløsning, og i kombination med immunmærkning giver oplysninger om specificiteten af de involverede rum og molekyler. En ulempe ved denne tilgang er manglen på oplysninger om dynamikken i processen, samt dens manglende evne til at udføre høj-throughput undersøgelser. Lysmikroskopi tilgange såsom samlede interne refleksion fluorescens mikroskopi (TIRFM), som udnytter evanescent feltet til at belyse fluorophores i nærheden af coverslip (100 nm), giver god tidsmæssig og rumlig opløsning til at studere exocytose begivenheder. Men, denne metode er kun kompatibel med klæbende celler og kan kun anvendes på ventrale / ringere del af celler.
Bemærk, plasmamembranen afslører betydelig heterogenitet baseret på klæbende komplekser, der kun er til stede i begrænsede områder. Denne heterogenitet begrænserf.eks. Tilsvarende er det for nylig blevet rapporteret, at sekretion fra Golgi-komplekset er koncentreret på “hot spots” i plasmamembranen5. Desuden er det kendt, at visse laster udskilles gennem fokal-vedhæftning-associeret exocytose6. Der bør derfor lægges særlig vægt på spørgsmålet om, hvorvidt exocytosehændelser er tilfældigt fordelt i rummet, eller om de er koncentreret på bestemte områder af plasmamembranen. Flere statistiske værktøjer baseret på Ripley’s K-funktion er blevet foreslået at undersøge dissespørgsmål 7,8,9. Vores tilgang kombinerer disse værktøjer med mikropattering til at styre celleform og plasma membran heterogenitet. Ud over at give et middel til at skelne mellem klæbende og ikke-vedhæftige områder, denne teknik giver også mulighed for sammenligning på tværs af forskellige celler og betingelser og øger styrken af statistiske analyser.
Her anvender vi en række statistiske værktøjer til at studere den rumlige fordeling af exocytose hændelser fra lysosomal rum overvåget af TIRFM levende celle billeddannelse af VAMP7-pHluorin i ringformet mikropattern-normaliseret hTert-RPE1 celler. Det blev bekræftet, at sekretion fra lysosomer ikke er en tilfældigproces 8,9 og at exocytose begivenheder udviser klyngedannelse. Bemærk, at vi fandt, at exocytose begivenheder er også grupperet i ikke-vedhæftige områder, hvilket indikerer, at vedhæftning molekyler er ikke de eneste strukturer, der kan fremkalde hemmelighedsfulde hot spots på plasmamembranen. Ikke desto mindre, celle vedhæftning gjorde forbedre klyngedannelse. Konsekvent identificerede vores analyse berigede områder af exocytose, der var placeret ved grænsen mellem klæbemidlet og ikke-vedhæftige områder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi overvågede exocytose hændelser fra lysosomalrummet ved TIRFM levende celle billeddannelse af VAMP7-pHluorin i ringformede mikropattern-normaliserede celler og udførte en streng statistisk analyse af de rumlige parametre for exocytose hændelser. Ved hjælp af den transformerede Ripley’s K-funktion og en statistisk test baseret på den nærmeste naboafstand bekræftede vi, at sekretion fra lysosomer ikke er en tilfældigproces 8,,9. Begge statistiske analyse…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi anerkender i høj grad Thierry Galli (Center for Psykiatri og Neurovidenskab, INSERM) for at give VAMP7-pHluorin plasmid. Vi takker Tarn Duong for rådgivning om statistisk analyse og medlemmer af GOUD-laboratoriet for frugtbare diskussioner. Forfatterne anerkender i høj grad Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg og PICT-IBiSA @Pasteur) og Nikon Imaging Center, Institut Curie (Paris), medlem af den franske nationale forskningsinfrastruktur Frankrig-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. blev støttet af Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC), og P.M. modtog støtte fra Eu’s Horizon 2020 forsknings- og innovationsprogram under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftale nr. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) og Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) samt Centre National de la Recherche Scientifique og Institut Curie.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion “Hotspots” Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. . Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
