Quantification des paramètres spatiotemporal de l’exocytose cellulaire dans les cellules micropatternées
Summary
L’imagerie en direct de l’exocytose lysosomale sur les cellules micropatternées permet une quantification spatiale de ce processus. La normalisation de la morphologie à l’aide de micropatterns est un outil exceptionnel pour découvrir des règles générales sur la distribution spatiale des processus cellulaires.
Abstract
L’imagerie en direct de la protéine 7 (VAMP7) associée à la pHluorine soluble soluble N-éthylmaleimide-sensible-facteur pièce jointe protéine de fixation REceptor (v-SNARE) protéine membranaire associée aux vésicules (VAMP7) par microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRFM) est un moyen simple d’explorer la sécrétion du compartiment lysosomal. Profitant de la culture cellulaire sur les surfaces micropatternées pour normaliser la forme cellulaire, une variété d’outils statistiques ont été utilisés pour effectuer une analyse spatiale des modèles sécrétoires. En utilisant la fonction K de Ripley et un test statistique basé sur la distance de voisinage la plus proche (NND), nous avons confirmé que la sécrétion de lysosomes n’est pas un processus aléatoire, mais montre un regroupement significatif. Il convient de noter que notre analyse a révélé que les événements d’exocytose sont également regroupés dans les zones de nonadhésion, ce qui indique que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui peuvent induire des points chauds sécréteurs à la membrane plasmatique. Pourtant, nous avons constaté que l’adhérence cellulaire améliore le clustering. En plus des zones adhésives et nonadhésives précisément définies, la géométrie circulaire de ces micropatterns permet l’utilisation de coordonnées polaires, simplifiant les analyses. Nous avons utilisé l’estimation de la densité du noyau (KDE) et la fonction de distribution cumulative sur les coordonnées polaires des événements d’exocytose pour identifier les zones enrichies d’exocytose. Dans les cellules micropatternes en forme d’anneau, le regroupement s’est produit à la frontière entre les zones adhésives et nonadhésives. Notre analyse illustre comment des outils statistiques peuvent être utilisés pour étudier les distributions spatiales de divers processus biologiques.
Introduction
L’exocytose est un processus cellulaire universel dans lequel une vésicule fusionne avec la membrane plasmatique et libère son contenu. La vésicule peut soit fusionner totalement avec la membrane plasmatique (fusion complète) ou créer un pore de fusion qui reste ouvert pendant un temps limité (kiss-and-run)1. Par exemple, les protéines nouvellement synthétisées sont libérées dans le milieu extracellulaire à partir de vésicules provenant du complexe golgi. Cette voie biosynthétique et antérograde est primordiale, en particulier dans les organismes multicellulaires, pour sécréter des peptides de signalisation (p. ex., hormones, neurotransmetteurs) et des composants de matrice extracellulaire (p. ex., collagène), ainsi que pour le trafic des protéines transmembrane vers la membrane plasmatique. En outre, les sécrétions peuvent provenir de différents endosomes: 1) le recyclage des endosomes afin de réutiliser les protéines transmembrane; 2) corps multivesiculaires (MVBs) pour libérer les exosomes; et 3) lysosomes pour la libération d’enzymes protéolytiques. La sécrétion endosomale s’est avérée importante pour l’excroissance de neurite, la formation de pseudopodia, la réparation de membrane de plasma, et la signalisation ATP-dépendante2.
Pour étudier l’exocytose au niveau des cellules uniques, plusieurs techniques ont été employées. Patch-clamp permet la détection d’événements d’exocytose unique avec une haute résolution temporelle dans une grande variété de cellules vivantes3. Toutefois, cette méthode ne fournit pas d’information sur la localisation des événements d’exocytose, ni sur le compartiment à partir duquel elle se produit. La microscopie électronique permet une visualisation directe d’événements exocytiques à haute résolution spatiale, et en combinaison avec l’immunolabeling fournit des informations sur la spécificité des compartiments et des molécules impliquées. Un inconvénient de cette approche est le manque d’information sur la dynamique du processus, ainsi que son incapacité à effectuer des études à haut débit. Les approches de microscopie légère telles que la microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRFM), qui exploite le champ évanescent pour éclairer les fluorophores à proximité du couvercle (100 nm), fournit une bonne résolution temporelle et spatiale pour étudier les événements d’exocytose. Toutefois, cette méthode n’est compatible qu’avec les cellules adhérentes et ne peut être appliquée qu’à la partie ventrale/inférieure des cellules.
Il est à noter que la membrane plasmatique révèle une hétérogénéité significative à base de complexes adhésifs qui ne sont présents que dans les zones réglementées. Cette hétérogénéité limite, par exemple, l’absorption de différents ligands4. De même, il a récemment été signalé que la sécrétion du complexe de Golgi est concentrée à des « oints chaud » dans la membrane plasmatique5. En outre, on sait que certaines cargaisons sont sécrétées par l’exocytose6associée à l’adhérence focale. Il convient donc d’accorder une attention particulière à la question de savoir si les événements d’exocytose sont distribués au hasard dans l’espace, ou s’ils sont concentrés à des zones spécifiques de la membrane plasmatique. Plusieurs outils statistiques basés sur la fonction K de Ripley ont été proposés pour explorer ces questions7,8,9. Notre approche combine ces outils avec le micropatternage pour contrôler la forme cellulaire et l’hétérogénéité des membranes plasmatiques. En plus de fournir un moyen de distinguer entre les zones adhésives et nonadhésives, cette technique permet également de comparer entre différentes cellules et conditions et augmente la puissance des analyses statistiques.
Ici, nous utilisons une variété d’outils statistiques pour étudier la distribution spatiale des événements d’exocytose à partir du compartiment lysosomal surveillé par tirfm imagerie cellulaire vivante de VAMP7-pHluorin dans des cellules hTert-RPE1 en forme de micropatternisé. Il a été confirmé que la sécrétion des lysosomes n’est pas un processus aléatoire8,9 et que les événements d’exocytose présentent le regroupement. Il convient de noter que les événements d’exocytose sont également regroupés dans les zones nonadhésives, ce qui indique que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui peuvent induire des points chauds sécrétoires à la membrane plasmatique. Néanmoins, l’adhérence cellulaire a amélioré le clustering. Notre analyse a permis d’identifier des zones enrichies d’exocytose situées à la frontière entre les zones adhésives et nonadhésives.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons surveillé les événements d’exocytose du compartiment lysosomal par l’imagerie cellulaire vivante de TIRFM de VAMP7-pHluorin dans les cellules micropatternes-normalisées en forme d’anneau et avons exécuté une analyse statistique rigoureuse des paramètres spatiaux des événements d’exocytose. En utilisant la fonction K de Ripley transformée et un test statistique basé sur la distance de voisinage la plus proche, nous avons confirmé que la sécrétion de lysosomes n’est pas un processus aléa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons vivement Thierry Galli (Centre de psychiatrie et neurosciences, INSERM) pour avoir fourni le plasmide VAMP7-pHluorin. Nous remercions Tarn Duong pour ses conseils sur l’analyse statistique et les membres du laboratoire GOUD pour les discussions fructueuses. Les auteurs reconnaissent avec beaucoup le Centre d’imagerie cellulaire et tissulaire (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg et PICT-IBiSA @Pasteur) et le Centre d’imagerie Nikon, Institut Curie (Paris), membre de l’Français Infrastructure nationale de recherche France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. a reçu le soutien de l’Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) et P.M. a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie no 666003. Ces travaux ont été soutenus par des subventions de INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), du Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) et de l’Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), ainsi que du Centre National de la Recherche Scientifique et Institut Curie.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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