Summary
L’imagerie en direct de l’exocytose lysosomale sur les cellules micropatternées permet une quantification spatiale de ce processus. La normalisation de la morphologie à l’aide de micropatterns est un outil exceptionnel pour découvrir des règles générales sur la distribution spatiale des processus cellulaires.
Abstract
L’imagerie en direct de la protéine 7 (VAMP7) associée à la pHluorine soluble soluble N-éthylmaleimide-sensible-facteur pièce jointe protéine de fixation REceptor (v-SNARE) protéine membranaire associée aux vésicules (VAMP7) par microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRFM) est un moyen simple d’explorer la sécrétion du compartiment lysosomal. Profitant de la culture cellulaire sur les surfaces micropatternées pour normaliser la forme cellulaire, une variété d’outils statistiques ont été utilisés pour effectuer une analyse spatiale des modèles sécrétoires. En utilisant la fonction K de Ripley et un test statistique basé sur la distance de voisinage la plus proche (NND), nous avons confirmé que la sécrétion de lysosomes n’est pas un processus aléatoire, mais montre un regroupement significatif. Il convient de noter que notre analyse a révélé que les événements d’exocytose sont également regroupés dans les zones de nonadhésion, ce qui indique que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui peuvent induire des points chauds sécréteurs à la membrane plasmatique. Pourtant, nous avons constaté que l’adhérence cellulaire améliore le clustering. En plus des zones adhésives et nonadhésives précisément définies, la géométrie circulaire de ces micropatterns permet l’utilisation de coordonnées polaires, simplifiant les analyses. Nous avons utilisé l’estimation de la densité du noyau (KDE) et la fonction de distribution cumulative sur les coordonnées polaires des événements d’exocytose pour identifier les zones enrichies d’exocytose. Dans les cellules micropatternes en forme d’anneau, le regroupement s’est produit à la frontière entre les zones adhésives et nonadhésives. Notre analyse illustre comment des outils statistiques peuvent être utilisés pour étudier les distributions spatiales de divers processus biologiques.
Introduction
L’exocytose est un processus cellulaire universel dans lequel une vésicule fusionne avec la membrane plasmatique et libère son contenu. La vésicule peut soit fusionner totalement avec la membrane plasmatique (fusion complète) ou créer un pore de fusion qui reste ouvert pendant un temps limité (kiss-and-run)1. Par exemple, les protéines nouvellement synthétisées sont libérées dans le milieu extracellulaire à partir de vésicules provenant du complexe golgi. Cette voie biosynthétique et antérograde est primordiale, en particulier dans les organismes multicellulaires, pour sécréter des peptides de signalisation (p. ex., hormones, neurotransmetteurs) et des composants de matrice extracellulaire (p. ex., collagène), ainsi que pour le trafic des protéines transmembrane vers la membrane plasmatique. En outre, les sécrétions peuvent provenir de différents endosomes: 1) le recyclage des endosomes afin de réutiliser les protéines transmembrane; 2) corps multivesiculaires (MVBs) pour libérer les exosomes; et 3) lysosomes pour la libération d’enzymes protéolytiques. La sécrétion endosomale s’est avérée importante pour l’excroissance de neurite, la formation de pseudopodia, la réparation de membrane de plasma, et la signalisation ATP-dépendante2.
Pour étudier l’exocytose au niveau des cellules uniques, plusieurs techniques ont été employées. Patch-clamp permet la détection d’événements d’exocytose unique avec une haute résolution temporelle dans une grande variété de cellules vivantes3. Toutefois, cette méthode ne fournit pas d’information sur la localisation des événements d’exocytose, ni sur le compartiment à partir duquel elle se produit. La microscopie électronique permet une visualisation directe d’événements exocytiques à haute résolution spatiale, et en combinaison avec l’immunolabeling fournit des informations sur la spécificité des compartiments et des molécules impliquées. Un inconvénient de cette approche est le manque d’information sur la dynamique du processus, ainsi que son incapacité à effectuer des études à haut débit. Les approches de microscopie légère telles que la microscopie de fluorescence de réflexion interne totale (TIRFM), qui exploite le champ évanescent pour éclairer les fluorophores à proximité du couvercle (100 nm), fournit une bonne résolution temporelle et spatiale pour étudier les événements d’exocytose. Toutefois, cette méthode n’est compatible qu’avec les cellules adhérentes et ne peut être appliquée qu’à la partie ventrale/inférieure des cellules.
Il est à noter que la membrane plasmatique révèle une hétérogénéité significative à base de complexes adhésifs qui ne sont présents que dans les zones réglementées. Cette hétérogénéité limite, par exemple, l’absorption de différents ligands4. De même, il a récemment été signalé que la sécrétion du complexe de Golgi est concentrée à des « oints chaud » dans la membrane plasmatique5. En outre, on sait que certaines cargaisons sont sécrétées par l’exocytose6associée à l’adhérence focale. Il convient donc d’accorder une attention particulière à la question de savoir si les événements d’exocytose sont distribués au hasard dans l’espace, ou s’ils sont concentrés à des zones spécifiques de la membrane plasmatique. Plusieurs outils statistiques basés sur la fonction K de Ripley ont été proposés pour explorer ces questions7,8,9. Notre approche combine ces outils avec le micropatternage pour contrôler la forme cellulaire et l’hétérogénéité des membranes plasmatiques. En plus de fournir un moyen de distinguer entre les zones adhésives et nonadhésives, cette technique permet également de comparer entre différentes cellules et conditions et augmente la puissance des analyses statistiques.
Ici, nous utilisons une variété d’outils statistiques pour étudier la distribution spatiale des événements d’exocytose à partir du compartiment lysosomal surveillé par tirfm imagerie cellulaire vivante de VAMP7-pHluorin dans des cellules hTert-RPE1 en forme de micropatternisé. Il a été confirmé que la sécrétion des lysosomes n’est pas un processus aléatoire8,9 et que les événements d’exocytose présentent le regroupement. Il convient de noter que les événements d’exocytose sont également regroupés dans les zones nonadhésives, ce qui indique que les molécules d’adhérence ne sont pas les seules structures qui peuvent induire des points chauds sécrétoires à la membrane plasmatique. Néanmoins, l’adhérence cellulaire a amélioré le clustering. Notre analyse a permis d’identifier des zones enrichies d’exocytose situées à la frontière entre les zones adhésives et nonadhésives.
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Protocol
1. Préparation de cellules micropatternées
- Transfection des cellules
- Un jour avant la transfection, semer 2,5 x 10cellules 6 hTERT-RPE1 en un puits d’une plaque de puits de 12 (2 x 2 cm) dans 1 mL de milieu.
- Le jour de la transfection, préparer le mélange de transfection avec le plasmide VAMP7-pHluorine (100 μL de tampon, 0,8 μg d’ADN, 3 μL de mélange de transfection). Incuber pendant 10 min.
NOTE: VAMP7 est un lysosomal v-SNARE, fusionné avec une étiquette pHluorin luminal. La sonde pHluorin est éteinte par un faible pH, mais pendant l’exocytose protons sont libérés et pHluorin commence à émettre un signal10,11. - Ajouter le mélange de transfection aux cellules de leur milieu.
- Modifier le milieu 4 h après l’ajout du mélange de transfection sur les cellules.
- Utilisez les cellules pour des expériences au cours des 24 à 48 prochaines heures.
- Préparation des micropatterns (méthode de photolithographie)
- Laver les couvercles (25 mm de diamètre) dans l’éthanol et les laisser sécher pendant 5 min.
- Activer les couvercles par l’éclairage sous les UV profonds pendant 5 min.
- Créez une chambre humide en humidifiant soigneusement une serviette en papier sur laquelle un film de paraffine est placé. Ajouter les gouttes (30 μL pour 22 mm coverslip) de la solution Poly-L-Lysine-greffe-Polyéthylène Glycol (PLL-g-PEG) (0,1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH = 7,4) et placer des couvercles avec la surface activée sur eux. Fermer la chambre humide avec un dessus et incuber les couvercles pendant 1 h.
- Laver les couvercles 2x en PBS et 1x dans de l’eau distillée et les laisser sécher.
- Laver le photomask de quartz avec de l’eau distillée, puis avec de l’éthanol ou du propanol. Sécher le photomask avec le flux d’air filtré.
REMARQUE : Le photomask à quartz est recouvert d’un côté de chrome antirefléctif qui contient des trous sous forme de micropatternes. Un photomask contenant des micropatternes en forme d’anneau de 37 μm est utilisé dans ce protocole. Lorsque les UV profonds sont brillants sur le photomask, la lumière ne peut passer à travers ces trous12. - Exposer le photomask (côté chromé) aux UV profonds pendant 5 min pour nettoyer la surface.
- Ajouter de petites gouttes d’eau (10 μL pour une couverture de 20 mm) sur le côté chromé du masque photomasque. Placez le couvercle avec leur côté PLL-g-PEG-traité sur la goutte et sécher l’eau supplémentaire. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne se forme entre le masque et les couvercles.
REMARQUE : La force capillaire de l’eau immobilisera les couvercles. - Exposez le photomask à l’UV profond pendant 5 min avec le côté non chromé vers le haut (les couvercles sont fixés sur la surface inférieure).
REMARQUE : La lumière ne peut passer à travers les trous et modifier la surface traitée par PLL-g-PEG des couvercles sous le masque photomas. - Retirez les couvercles du masque photomas en ajoutant l’excès d’eau.
REMARQUE : Les couvercles doivent rapidement flotter. - Incuber les couvercles dans une solution de protéines matricielles extracellulaires (50 μg/mL de fibronectine, 5 μg/mL de fibrinogène fluorescent dilué dans l’eau) sur un film de paraffine dans une chambre humide (comme à l’étape 1.2.3) pendant 1 h sous un capot d’écoulement laminaire pour éviter la contamination.
REMARQUE : L’expérience peut être interrompue à ce stade en stockant les couvercles dans PBS à 4 °C.
- Ensemencement cellulaire sur les surfaces micropatternées
- Utilisez un support de couvercle magnétique qui correspond à la taille des couvercles micropatternés pour monter les couvercles. Le jour de l’acquisition, chauffer le support de couvercle à 37 °C pour éviter le choc thermique pour les cellules lors des étapes suivantes.
- Préparer le milieu de modèle en complétant le milieu DMEM/F12 avec 20 mM HEPES et 2% de pénicilline/streptomycine.
- Placez les couvercles dans le support avec le côté micropatterned vers le haut et ajoutez le milieu de modèle dès que le couvercle est sur la base de support. Ajouter le joint et immobiliser avec le dispositif magnétique. Remplissez le support de couvercle avec le support de modèle et fermez-le avec le couvercle en verre.
REMARQUE : Soyez rapide, pour ne pas laisser sécher le couvercle. Ne lavez pas le support de couvercle avec de l’éthanol entre les expériences, parce que le joint pourrait conserver un peu d’éthanol, qui peut réagir avec PLL-g-PEG et entraîner un stress cellulaire. Laver le porte-couvercles seulement avec de l’eau savonneuse. En outre, l’articulation peut être incubée dans le milieu de modèle à 37 °C pendant 1 h pour diluer le produit résiduel. - Recueillir les cellules transfectées hTERT-RPE1 par trypsinisation (0,5 mL pour une plaque de puits de 12) et ajouter 1 mL de 10% FBS DMEM/F12 moyen.
- Ajoutez 0,5 x 106 cellules hTERT-RPE1 transfectées au support de couvercle et reclusez-le. Incuber pendant 10 min dans l’incubateur.
- Laver le support de couvercle 5x avec un milieu de modèle pour enlever les cellules non attachées et les FBS résiduels en ajoutant le milieu de modèle avec une pipette et en aspirant le milieu avec une autre pipette pour créer un flux de lavage. Gardez toujours un petit volume de milieu de modèle dans le support de couvercle pour éviter le séchage des cellules sur le couvercle micropatterné, qui mènera à la mort cellulaire.
- Incuber dans l’incubateur pendant 3 h pour permettre la propagation complète des cellules.
2. Acquisition de données sur l’exocytose
- Imagerie des événements d’exocytose
- Placer le porte-couvercle sous un TIRM. Le signal doit être détecté par une caméra sensible mise en place avec le meilleur format d’imagerie disponible.
REMARQUE : Dans cette expérience, un objectif 100x et une caméra EMCCD avec une région de détection de 512 x 512 pixels ont été utilisés donnant lieu à une taille de pixel de 160 nm. - Recherche d’une cellule exprimant VAMP7-pHluorin qui est entièrement répandue (Figure 1A).
REMARQUE : Les cellules exprimant VAMP7 sont clairement identifiables, car elles présentent un signal vert. - Modifiez l’angle du laser jusqu’à ce qu’un angle TIRF qui permette la visualisation des événements d’exocytose VAMP7-pHluorin soit atteint. Effectuer une acquisition de 5 minutes à une fréquence compatible avec le taux d’exocytose et l’échelle de temps (généralement 3 Hz, figure 1D)à l’aide du logiciel microscope.
REMARQUE : les cellules hTERT-RPE1 ont un taux sécrétoire lysosomal d’environ 0,3 Hz sur les micropatternes. L’exocytose lysosomale a une durée typique de 1 s. Il est caractérisé par une intensité de pointe suivie d’une décomposition exponentielle. La diffusion de la sonde doit être évidente à ce moment (Figure 1B, C). - Pour chaque cellule, effectuer également une acquisition du micropattern à l’aide du logiciel microscope (Figure 1A).
- Placer le porte-couvercle sous un TIRM. Le signal doit être détecté par une caméra sensible mise en place avec le meilleur format d’imagerie disponible.
- Acquisition de coordonnées d’exocytose
- Ouvrez le film acquis avec ImageJ/FIJI. Utiliser le fichier | Importation | Séquence d’image. Trouvez des événements d’exocytose par oeil. Un événement d’exocytose se caractérise par l’apparition d’un signal lumineux qui se propage vers l’extérieur (figure 1).
- Utilisez l’outil de point pour marquer le centre de l’événement exocytique. Utiliser Analyser | Mesurez les coordonnées X et Y, ainsi que la coordonnée temporelle (numéro de tranche). Effectuez ces mesures pour tous les événements d’exocytose du film.
- Enregistrer les résultats (Résultats | Fichier | Enregistrer sous . Préparez un fichier texte pour chaque cellule analysée nommée « Résultats(cell_name).txt » qui contient la tranche, les coordonnées X et les coordonnées Y pour tous les événements d’exocytose dans cet ordre.
Le fichier texte est censé ressembler à ceci :
Rayon de diamètre d’ID X Y Feret
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
REMARQUE : Veillez à remplacer toutes les virgules par des points. - Mesurez le centre et le diamètre de chaque cellule à l’aide del'« outil ovale». S’adapter à un cercle parfait (ne pas utiliser un ovale) et utiliser "Mesure" pour obtenir les coordonnées X et Y et le diamètre de Feret. Enregistrez l’identité (ID), les coordonnées X et Y de chaque cellule, le diamètre et le rayon de Feret (diamètre/2) dans un fichier texte nommé « paramètre sphérique.txt ».
Le fichier texte est censé ressembler à ceci :
Rayon de diamètre d’ID X Y Feret
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
REMARQUE : Veillez à remplacer toutes les virgules par des points. - Mesurez l’épaisseur de l’anneau micropattern (longueur d’adhérence) avec l’outil droit et enregistrez l’ID de cellule, le rayon de cellule (à partir du fichier : « Spherique paramerat.txt »), et la longueur d’adhérence dans un fichier texte nommé « Pattern parameter.txt ». Calculez la longueur normalisée de l’adhérence en divisant la longueur de l’adhérence par rayon de cellule.
REMARQUE : Veillez à remplacer toutes les virgules par points.
Le fichier doit ressembler à ceci :
Longueur d’adhérence du rayon de cellule ID Longueur d’adhérence normalisée
RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826
3. Analyse spatiale à cellule unique
- R paquet et installation
REMARQUE : Le package R pour cette analyse tire parti du paquet Spatstat13 pour calculer la densité bidimensionnelle (2D) et la fonction K de Ripley. Le code est open-source et utilise des fichiers texte qui ont été précédemment décrits.- Télécharger et installer R à partir de https://www.r-project.org/ (la version 3.5.2 a été utilisée dans cette analyse).
- Téléchargez le package (et le jeu de données de démonstration) à partir de : https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- Installez le package sur R Studio à l’aide de «Tools» à l’aide de «Install Packages». Sélectionnez "Package Archive File (.zip; .tar.gz)" pour la catégorie "Installer à partir de:" et choisissez le fichier de package. Appuyez sur "Installer« .
- Chargez le package avec la fonction "bibliothèque (« ExocytosisSpatialAnalysis »)" en écrivant cette commande en studio R et en appuyant sur "Entrez« .
- Exécutez le package avec la fonction "ESA()" en écrivant cette commande en studio R et en appuyant sur "Enter« .
REMARQUE : Une interface utilisateur s’ouvre. - Sélectionnez le répertoire du jeu de données (fichiers .txt) et un répertoire pour les parcelles de sortie.
REMARQUE : Les paramètres de l’analyse (voir texte ci-dessous) peuvent être modifiés via une interface utilisateur. - Ce script démarre et exécute automatiquement l’analyse. Il fournit des fichiers .pdf de graphiques correspondants et des fichiers .txt contenant des résultats numériques.
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Representative Results
Les caractéristiques spatiotemporal des événements d’exocytose ont été analysées à partir de lysosomes visualisés par VAMP7-pHluorin10,11 dans les cellules hTert-RPE1. les cellules hTert-RPE1 sont des cellules non transformées qui adoptent bien au micropatternage et ont été largement utilisées dans des études antérieures basées sur des micropatternes4,14. VAMP7 est un lysosomal v-SNARE15 qui a été marqué avec le pHluorin super écliptique à son N-terminus et est situé dans le lumen du lysosome. À l’intérieur de la cellule, la sonde pHluorin a été éteinte par le faible pH du lysosome, mais pendant l’exocytose pHluorin a commencé à émettre un signal parce que le pH a augmenté en raison de la libération de protons. VAMP7-pHluorin a été surveillé par l’imagerie cellulaire vivante TIRFM sur des micropatternes en formed’anneau ( Figure 1A–B). Le signal de pHluorin a montré un pic pendant l’exocytose qui a représenté la libération rapide des protons lysosomal suivis de la décomposition exponentielle, représentant la diffusion 2D de la sonde à la membrane plasmatique (Figure 1C). les cellules hTERT-RPE1 ont présenté une activité de sécrétion lysosomale importante avec un taux moyen d’exocytose de 0,28 Hz (figure 1D). Cependant, une forte hétérogénéité a été observée dans le taux d’exocytose entre les cellules (écart type de 0,15 Hz), ce qui indique qu’il y avait une forte variabilité cellule-cellule dans la sécrétion des lysosomes.
Analyse spatiale à cellule unique pour déterminer si l’exocytose des lysosomes est aléatoire
Il a été possible de visualiser la distribution 2D de l’exocytose par KDE, comme précédemment effectuée pour les compartiments endomembranous14, qui pourraient révéler des différences dans les densités locales (Figure 2B). Cette approche est pertinente pour la visualisation de la répartition moyenne d’une population de cellules, mais moins informative dans les cellules individuelles en raison du nombre limité d’événements détectés (des dizaines par rapport aux plusieurs milliers obtenus par analyse basée sur la population) et d’une variabilité élevée de cellule à cellule. Par exemple, cette approche ne nous a pas permis d’évaluer si la distribution des événements d’exocytose a suivi un comportement complet de randomisme spatial (RSE) (c.-à-d. correspondait à une distribution uniforme de point dans une région observée pour une seule cellule). Un modèle de points suit un comportement de RSE lorsque les deux hypothèses suivantes sont vraies : 1) l’emplacement de chaque point est indépendant de celui des autres points ; et 2) la probabilité de trouver un point dans une sous-région ne dépend que du rapport entre la superficie de cette sous-région et la superficie totale. Il y a trois écarts possibles par rapport à la RSE : 1) regroupement (c.-à-d. agrégation); 2) la dispersion (c.-à-d. la commande à distance constante); ou 3) un mélange de regroupement et de dispersion (figure 2C). La fonction K de Ripley a été utilisée pour répondre à cette question comme dans les analyses précédentes7,8,9 ( Figure2D). La fonction K de Ripley est proche de πr² (avec d étant la distance normalisée d’un événement) dans le cas de la RSE, mais supérieure (respiratoire inférieure) à πr² dans le cas du regroupement (dispersion respiratoire). En soustrayant πr² de la fonction K de Ripley, la courbe théorique de RSE devrait être à 0. Des simulations de cas de RSE ont été effectuées en utilisant le même nombre de points que les événements observés d’exocytose pour évaluer la bonté d’ajustement pour le cas de RSE (enveloppe grise autour de la courbe théorique). La fonction K de Ripley transformée appliquée aux données expérimentales présentait des valeurs positives à l’extérieur de l’enveloppe, indiquant le regroupement (figure 2D).
Pour étudier si le regroupement des événements d’exocytose était dû à l’adhérence cellulaire comme précédemment rapporté6, nous avons effectué une analyse semblable sur des données provenant exclusivement de la zone de cellules nonadhésives dans le centre (Figure 2A, zone adhésive dans le gris, zone centrale de cellules nonadhesive en blanc). Il convient de noter que les événements d’exocytose dans la zone nonadhésive ont également été regroupés (figure 2E), ce qui indique que les molécules d’adhérence n’étaient pas les seules structures qui induisaient des points chauds sécrétoires aux membranes plasmatiques.
Étant donné que la fonction K de Ripley est une statistique descriptive qui ne fournit pas de valeur P, un test statistique a été mis en place en comparant les événements d’exocytose cellulaire avec les simulations de RSE. La méthode NND(i) de distance voisine la plus proche a été utilisée. NDD est défini comme la distance euclidienne minimale entre un point i et tous les autres points. Le NND(i) moyen de tous les événements exocytiques d’une cellule a été calculé et comparé à la RSE obtenue avec un nombre élevé de simulations de Monte Carlo (Figure 2F). Nous avons constaté que le NND moyen de la cellule unique analysée à la figure 2F était inférieur à la moyenne de la distribution simulée du cas de RSE, indiquant des voisins plus proches en moyenne et donc le regroupement. Dans le cas de la dispersion, on s’attendait à une valeur plus élevée pour le NND moyen (figure 2C). Cette comparaison a permis le calcul d’une valeur P pour chaque cellule. La valeur P représente le pourcentage de simulations qui présentaient un NND plus extrême (d’une manière à deux faces). Pour être précis, la valeur P impartiale a été calculée comme (k+1)/(N+1) avec N étant le nombre total de simulations monte-carlo (10.000), et k le nombre de ces simulations qui était plus extrême que le mesurent observé16. L’histogramme de toutes les valeurs P a été tracé pour la zone cellulaire totale (figure 2G) et la zone cellulaire nonadhésive (Figure 2I). Si H0: « L’exocytose est un processus de RSE » était vrai, une répartition uniforme des valeurs P était attendue. Si H0 était faux, on s’attendait à un pic à faible valeur P. Exécution d’un test Kolmogorov-Smirnov sur les histogrammes de valeur P, une valeur P inférieure à 0,001 a été obtenue, montrant une déviation significative de la RSE dans les deux cas (Figures 2G et 2I). En outre, un coefficient de regroupement de 0,955 pour la zone cellulaire totale et de 1.000 pour la zone cellulaire nonadhésive a indiqué que l’exocytose lysosomale était un processus groupé indépendant de l’adhérence cellulaire. Le coefficient de regroupement représente le pourcentage de cellules qui étaient plus proches d’un comportement de regroupement que de dispersion. Ce résultat était compatible avec la fonction K de Ripley.
Pour évaluer le rôle de l’adhérence cellulaire dans le regroupement, nous avons comparé le NND moyen dans la zone nonadhésive avec celui dans la zone globale pour chaque cellule individuelle (Figure 2H). Parce que le NND moyen était inversement proportionnel à la densité de surface, nous avons normalisé le NND moyen de la zone nonadhésive en utilisant l’homothésité. Le NND moyen significativement plus grand des événements d’exocytose dans la zone nonadhésive a indiqué moins de regroupement (figure 2H). Ainsi, bien que la sécrétion des grappes de lysosomes dans les zones nonadhésives, l’adhérence cellulaire semblait améliorer le regroupement.
Analyse spatiale des événements d’exocytose à l’aide de coordonnées polaires
La géométrie circulaire du micropattern en forme d’anneau a permis l’utilisation des coordonnées polaires communes, ce qui a simplifié les analyses, comme précédemment trouvé17. Chaque événement d’exocytose pourrait ainsi être décrit par un module (distance de l’origine, ici le centre du plan inférieur de la cellule) et un angle (selon un axe arbitraire fixe). En outre, le module peut être normalisé en le divisant par le rayon de la cellule. L’histogramme des événements d’exocytose a été tracé selon le module pour une cellule représentative (Figure 3A). Cela a révélé un pic autour de la frontière entre les zones adhésives/nonadhésives. Une grande variabilité entre les cellules a également été observée. Par conséquent, nous avons mis en commun n = 22 cellules pour obtenir une distribution moyenne des événements d’exocytose. Cependant, afin de donner le même poids statistique à chaque cellule, le même nombre d’événements de chaque cellule a été choisi au hasard. Cette sélection aléatoire n’a pas modifié les schémas globaux observés. Pour obtenir une distribution moyenne continue des distributions individuelles de cellules individuelles, un KDE a été utilisé (figure 3B). Toutefois, comme le module normalisé se situe entre 0 et 1, il a fallu tenir compte des conditions de bord. Un noyau bêta qui change de forme à côté des bords a été utilisé18. Une bande d’erreur a été calculée avec une stratégie bootstrap. La distribution moyenne observée a été comparée à une distribution hypothétique de RSE qui a montré plus d’événements à un module plus élevé, parce que la zone a augmenté avec un module plus élevé. Parce que l’intégrale d’une densité de probabilité devrait être un, la distribution de RSE était 2r (avec sont le rayon normalisé, sans unités). Une bande de confiance a été calculée autour de la courbe théorique à l’aide d’un grand nombre de simulations CSR Monte Carlo (5 000 chacune). Les1er et99 e percentiles de la distribution du module de ces simulations ont été tracés. Nous avons constaté que la distribution moyenne des événements d’exocytose dévié de l’hypothétique à 0,7rmax, ce qui correspond au début de la zone adhésive de la cellule.
Nous avons cherché à vérifier si la distribution observée du module était différente de celle théorique. Étant donné que les distributions moyennes, comme en l’espèce, ne peuvent pas être testées avec précision par un critère de bonté de l’ajustement (p. ex., Kolmogorov-Smirnov), une autre méthode proposée par Pecot et coll. a été utilisée. Cette méthode mesure la différence entre la variation d’une population et la variation à l’intérieur d’une population, et permet ainsi des tests indépendants pour chaque coordonnée (c.-à-d. le module et l’angle)17. Ce test a été utilisé pour comparer nos données à des données simulées représentant des événements d’exocytose CSR (le même nombre de cellules et d’événements d’exocytose que les données observées), et a trouvé une différence statistiquement significative dans les variations (p < 0,001 avec le test Wilcoxon-Mann-Whitney, n = 22 cellules), ce qui indique que la distribution moyenne observée d’exocytose n’était pas la RSE. Cependant, lorsque deux simulations de RSE (avec 5 000 simulations chacune) ont été comparées, nous avons constaté que l’histogramme de valeur P ne montrait pas une distribution uniforme, mais présentait un pic près de 1, ce qui indique que ce test manquait probablement de sensibilité.
Étant donné que l’estimation KDE repose sur un choix non trivial de bande passante du noyau et est sensible aux effets de bord, la fonction de distribution cumulative a également été calculée, ce qui surmonte les problèmes inhérents à l’estimation KDE (Figure 3D). Cette fonction est définie entre 0 et 1 et ne contient aucun paramètre ou biais arbitraire (p. ex., biais de bord). Les bandes d’erreur et de confiance ont été calculées de la même manière que pour la distribution du module. La fonction de distribution cumulative a confirmé que les événements d’exocytose n’ont pas suivi une distribution de RSE mais ont été surconcentrés à moduli autour de 0.7rmax. Cette analyse nous a donc permis d’identifier les zones cellulaires où le regroupement s’est produit. Une question intéressante que ce résultat soulève est de savoir si la surconcentration à 0,7rmax était en raison de la présence de zones adhésives / nonadhesive du micropattern en forme d’anneau ou un effet des zones périphériques / centrales de sécrétion des cellules.
Comme la distribution moyenne des événements d’exocytose a dévié du cas de RSE dans les secteurs nonadhésifs aussi bien que adhésifs, nous nous sommes également demandé où la densité d’exocytose était la plus élevée. Les densités de surface de l’exocytose dans les zones d’adhérence et de nonadhésion ont été calculées et comparées. Nous avons constaté que la densité de surface était plus faible dans la zone d’adhérence que dans la zone de nonadhésion par une analyse jumelée (figure 3C). Cela pourrait s’expliquer par la forte diminution de l’exocytose à la périphérie cellulaire (0,85 – 1rmax, figure 3B).
Figure 1. Exocytose des lysosomes dans les cellules hTert-RPE1 : (A) Micropattern en forme d’anneau (rouge) et cellule hTert-RPE1 a adhésif transfecté avec VAMP7-pHluorin (vert) photographié par TIRFM. La flèche montre un événement d’exocytose. Barres d’échelle = 10 μm. (B) Kymographe des événements d’exocytose. Les flèches montrent des événements d’exocytose. Barre d’échelle = 2 μm, barre d’échelle dans le temps = 5 s. (C) Profil d’intensité normalisée de l’exocytose lysosomale de 22 cellules. Chaque point est une moyenne d’au moins 1 530 événements d’exocytose. Les données sont présentées ± SEM. (D) Taux d’exocytose des 22 cellules. L’écart moyen +/- standard est tracé en rouge. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Analyse spatiale des événements d’exocytose lysosomal. (A) Scatter parcelle d’événements exocytose au cours de l’acquisition de 5 min. Chaque point représente un événement d’exocytose. La zone adhésive est indiquée en gris. (B) Estimation de la densité du noyau 2D (KDE) de la parcelle de dispersion de A. La couleur représente la densité locale des événements d’exocytose. (C) Représentation schématique des modèles de points possibles. Les quatre cas, Complete Spatial Randomness (CSR), Clustering, Dispersion, et Mixed sont affichés, et plusieurs distances voisines (NND) les plus proches sont tracées (lignes pointillées) pour montrer comment le NND moyen a diminué dans le regroupement et a augmenté avec la dispersion. (D) Analyse d’une cellule représentative à l’aide de la fonction K de Ripley. La ligne en pointillés rouge est égale à la fonction K de Ripley - πr² pour les événements CSR, l’enveloppe grise représente la bonté estimée des simulations de Monte Carlo avec le même nombre de points que les événements d’exocytose(N événement = 81). La ligne solide noire est égale à la « fonction K de Ripley – πr² » pour les événements observés d’exocytose(événement N = 81). Son écart positif par rapport à la courbe rouge de l’enveloppe grise indique le regroupement des événements d’exocytose. La fonction K de Ripley a été normalisée pour avoir une valeur maximale de 1. (E) Analyse de la zone nonadhésive de la même cellule en utilisant la fonction K de Ripley comme dans D. L’écart positif par rapport à la courbe rouge à l’extérieur de l’enveloppe grise indique un regroupement d’événements d’exocytose dans la zone nonadhésive. (F) Comparaison de la distribution moyenne de NND à partir d’une cellule représentative (ligne rouge) avec le KDE de la RSE obtenue à partir de simulations monte carlo (courbe bleue). La valeur P a été calculée comme le pourcentage de valeurs simulées qui étaient plus extrêmes que la valeur observée. (G) Hétogramme de valeur P obtenu à partir du test NND comme dans F pour n = 26 cellules. Le pic à faible valeur P signifie que l’hypothèse nulle « exocytose suit RSE » a été rejetée avec un test Kolmogorov-Smirnov, indiquant que l’exocytose lysosomale n’était pas RSE. (H) Trace de boîte de NND moyen des événements d’exocytose dans les secteurs nonadhésifs (blanc) et les secteurs totaux de cellules (gris). Les deux points de données d’une même cellule sont rejoints par une ligne. Le NND moyen était plus grand dans la zone nonadhésive, p < 0,001 avec un test de Wilcoxon jumelé (n = 25 cellules), indiquant beaucoup moins de regroupement dans la zone nonadhésive. (I) Même que G pour la zone nonadhésive pour n = 26 cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. Analyse spatiale des événements d’exocytose lysosomale mis en commun : (A) Histogramme des événements d’exocytose d’une cellule représentative au cours d’une acquisition de 5 min avec n = 161 événements d’exocytose en fonction du module normalisé; 0 représente le centre cellulaire et 1 la périphérie cellulaire. La zone adhésive de la cellule est indiquée en gris et correspond au moduli de 0,65–1 pour les cellules indiquées. Il ya un pic au début de la zone adhésive autour moduli entre 0,6 et 0,7. (B) KDE des événements d’exocytose en fonction du module normalisé pour n = 22 cellules avec 56 événements dans chaque cellule; 0 représente le centre cellulaire et 1 la périphérie cellulaire. La zone adhésive moyenne est indiquée en gris et correspond en moyenne au moduli de 0,61–1. La courbe bleue en pointillés est la courbe théorique attendue dans le cas de la RSE. Cette courbe théorique est accompagnée d’une enveloppe qui représente le 1er-99e percentiles de RSE obtenu à l’aide de la simulation de Monte Carlo. La courbe KDE des données observées est en rouge et accompagnée d’une bande d’erreur générée par bootstrapping. La zone adhésive est en gris +/- SEM. (C) Analyse jumelée des densités de surface dans les zones d’adhérence et de nonadhésion. La densité de surface de l’exocytose a été calculée comme nombre d’événements par zone normalisée et par seconde. Ici, *p < 0,05 d’un t-test étudiant jumelé (n = 22 cellules). La normalité a déjà été testée par un test Shapiro-Wilk. (D) Fonction de distribution cumulative des données en B (ligne rouge) et à partir des simulations CSR de Monte Carlo (ligne bleue pointillée). Les enveloppes ont été générées comme dans B. Notez que la ligne rouge s’écarte de la RSE théorique à environ 0,7rmax. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous avons surveillé les événements d’exocytose du compartiment lysosomal par l’imagerie cellulaire vivante de TIRFM de VAMP7-pHluorin dans les cellules micropatternes-normalisées en forme d’anneau et avons exécuté une analyse statistique rigoureuse des paramètres spatiaux des événements d’exocytose. En utilisant la fonction K de Ripley transformée et un test statistique basé sur la distance de voisinage la plus proche, nous avons confirmé que la sécrétion de lysosomes n’est pas un processus aléatoire8,9. Les deux analyses statistiques ont montré de manière convaincante que les événements d’exocytose présentent un regroupement (figures 2D et 2G). En appliquant des outils similaires à la zone cellulaire nonadhésive, nous avons constaté que les événements d’exocytose sont également regroupés dans les zones nonadhésives (figures 2E et 2I). Ainsi, les molécules d’adhérence qui ont été précédemment rapportées pour permettre le regroupement6 ne sont pas les seules structures qui peuvent induire des points chauds sécréteurs à la membrane plasmatique. Toutefois, l’adhérence cellulaire a amélioré le regroupement : la distance moyenne de voisinage la plus proche entre les événements d’exocytose était significativement plus grande dans les zones nonadhésives (figure 2H). Constamment, notre analyse basée sur l’estimation de la densité du noyau et la fonction de distribution cumulative a identifié des zones enrichies d’exocytose qui étaient situées à la frontière entre les zones adhésives et nonadhésives dans les cellules micropatternes en forme d’anneau. D’autres travaux sont nécessaires pour déterminer les mécanismes moléculaires sous-jacents au regroupement, comme l’adhérence ou un ciblage spécifique du lysosome dans cette région. Fait intéressant, nous avons observé une hétérogénéité élevée dans le taux d’exocytose à travers les cellules hTERT-RPE1 (écart type de 0,15 Hz pour le taux moyen d’exocytose de 0,28 Hz, figure 1D), ce qui indique que la sécrétion des lysosomes a une forte variation intercellulaire. Par conséquent, les analyses de sous-population devraient être envisagées dans les travaux futurs. Il serait particulièrement intéressant d’examiner si cette variation reflète la diversité des compartiments lysosomal, les différences dans les cargaisons ou la dépendance à l’égard des machines d’exocytose.
Ces résultats illustrent comment des outils statistiques peuvent être utilisés pour étudier les paramètres spatiaux de divers processus biologiques. En outre, les micropatternes facilitent l’étude de l’effet de l’adhérence cellulaire d’une manière impartiale à l’aide de différentes géométries de micropatternes (p. ex., en forme d’anneau par rapport à l’apanage). En particulier, l’utilisation de formes rondes facilite les analyses parce que des coordonnées polaires peuvent être utilisées. Étant donné que les outils statistiques nécessitent une certaine quantité de données pour être significatives, des cellules ayant plus de 30 événements ont été utilisées pour notre analyse. Cependant, il est possible que les cellules avec 30 événements ou moins sont significatives. Ainsi, des cellules d’échantillonnage de 30 événements ou moins pourraient être effectuées afin d’obtenir suffisamment d’événements pour l’analyse afin de déterminer si c’est le cas. De même, il est difficile d’estimer le nombre de cellules à analyser, en particulier s’il y a une forte variation intercellulaire. Une façon de contourner cela est de sélectionner au hasard le même nombre d’événements de chaque cellule afin de donner le même poids statistique à chaque cellule lors de leur mise en commun. Cependant, nous recommandons que les analyses sur moins de 15 cellules soient effectuées avec précaution. Comme les distributions moyennes de cellules mises en commun ne peuvent pas être testées avec précision par des tests de bonté d’ajustement (p. ex., Kolmogorov-Smirnov), nous avons utilisé une statistique d’essai proposée par Pecot et coll., qui mesure la différence dans les variations des populations17. Bien que ce test nous ait permis de trouver une différence statistiquement significative dans les variations des distributions moyennes, nous soupçonnons que ce test a une faible sensibilité parce que l’histogramme de valeur P n’était pas plat (c.-à-d. a montré une distribution uniforme) lors de la comparaison de différentes simulations de RSE pour les valeurs p proches de 1. Par conséquent, cette procédure statistique peut devoir être améliorée.
Un inconvénient de nos analyses est la détection manuelle des événements d’exocytose, ce qui réduit considérablement la vitesse de l’analyse. Les limitations dans la détection automatique sont souvent dues à une forte hétérogénéité dans le paramètre unique et simple analysé (p. ex., intensité des événements d’exocytose). Les réseaux neuronaux pourraient être potentiellement puissants pour la détection automatique, car ils peuvent être formés pour reconnaître de nombreuses fonctionnalités.
L’analyse présentée ici peut être appliquée à d’autres processus dynamiques observés par TIRFM, tels que la sécrétion d’autres compartiments et la distribution de la microdomaine membranaire ou de la présentation de l’antigène. Des analyses similaires peuvent également être appliquées aux cellules fixes afin d’étudier la distribution spatiale des protéines. Nous espérons que nos travaux renforceront l’intérêt croissant pour l’analyse de la distribution spatiale en biologie cellulaire.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous reconnaissons vivement Thierry Galli (Centre de psychiatrie et neurosciences, INSERM) pour avoir fourni le plasmide VAMP7-pHluorin. Nous remercions Tarn Duong pour ses conseils sur l’analyse statistique et les membres du laboratoire GOUD pour les discussions fructueuses. Les auteurs reconnaissent avec beaucoup le Centre d’imagerie cellulaire et tissulaire (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg et PICT-IBiSA @Pasteur) et le Centre d’imagerie Nikon, Institut Curie (Paris), membre de l’Français Infrastructure nationale de recherche France-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. a reçu le soutien de l’Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) et P.M. a reçu un financement du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie no 666003. Ces travaux ont été soutenus par des subventions de INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), du Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) et de l’Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), ainsi que du Centre National de la Recherche Scientifique et Institut Curie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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