Quantificazione dei parametri Spatiotemporal dell'esocitosi cellulare nelle cellule micromodellate
Summary
L’imaging vivo dell’esocitosi lisosomica sulle cellule micromodelle consente una quantificazione spaziale di questo processo. La normalizzazione della morfologia tramite micromodelli è uno strumento eccezionale per scoprire le regole generali sulla distribuzione spaziale dei processi cellulari.
Abstract
L’imaging dal vivo della proteina di membrana associata alla vescicola 7 (VAMP7) con etichetta Soluble N-ethylmaleimide-sensitive Attachment protein REceptor (v-SNARE) Proteina della membrana associata alla vescicolo 7 (VAMP7) dalla microscopia a fluorescenza a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM) è un modo semplice per esplorare la secrezione dal compartimento lisosomiale. Sfruttando la coltura cellulare su superfici micromodellate per normalizzare la forma cellulare, sono stati impiegati una varietà di strumenti statistici per eseguire un’analisi spaziale dei modelli secretori. Utilizzando la funzione K di Ripley e un test statistico basato sulla distanza vicina più vicina (NND), abbiamo confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processo casuale, ma mostra un clustering significativo. Da notare, la nostra analisi ha rivelato che gli eventi di esocitosi sono raggruppati anche in aree non di aesione, indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che possono indurre punti caldi secretori alla membrana plasmatica. Tuttavia, abbiamo scoperto che l’adesione cellulare migliora il clustering. Oltre alle aree adesive e non aesive definite con precisione, la geometria circolare di questi micromodelli consente l’uso di coordinate polari, semplificando le analisi. Abbiamo usato la stima della densità del kernel (KDE) e la funzione di distribuzione cumulativa sulle coordinate polari degli eventi di esocitosi per identificare le aree arricchite di esocitosi. Nelle cellule a micromodello ad anello, il clustering si è verificato al confine tra le aree adesive e non aesive. La nostra analisi illustra come gli strumenti statistici possono essere impiegati per studiare le distribuzioni spaziali di diversi processi biologici.
Introduction
L’esocitosi è un processo cellulare universale in cui una vescica si fonde con la membrana plasmatica e rilascia il suo contenuto. La vescicola può fondersi totalmente con la membrana plasmatica (fusione completa) o creare un poro di fusione che rimane aperto durante un tempo limitato (bacio e corsa)1. Per esempio, le proteine appena sintetizzate vengono rilasciate nel mezzo extracellulare dalle vesicelle che provengono dal complesso Golgi. Questa via biosintetica e anterograda è primordiale, soprattutto negli organismi multicellulari, per seceare peptidi di segnalazione (ad esempio, ormoni, neurotrasmettitori) e componenti a matrice extracellulare (ad esempio, collagene), così come per il traffico di proteine transmembrane alla membrana plasmatica. Inoltre, le secrezioni possono verificarsi da diversi endsomes: 1) riciclare endosomi al fine di riutilizzare le proteine transmembrane; 2) corpi multiversicolari (MVB) per rilasciare esosomi; e 3) lisosomi per il rilascio di enzimi proteolitici. La secrezione endosomica ha dimostrato di essere importante per la crescita dei neuriti, la formazione di pseudopodi, la riparazione della membrana plasmatica e la segnalazione dipendentedall’ATP 2.
Per studiare l’esocitosi a livello di singola cellula, sono state impiegate diverse tecniche. Patch-clamp consente il rilevamento di singoli eventi di esocitosi con un’alta risoluzione temporale in una vasta gamma di cellule viventi3. Tuttavia, questo metodo non fornisce informazioni sulla localizzazione degli eventi di esocitosi, né dal raggruppamento che si verifica. La microscopia elettronica consente la visualizzazione diretta di eventi esoctici ad alta risoluzione spaziale, e in combinazione con l’immunoetichettazione fornisce informazioni sulla specificità dei compartimenti e delle molecole coinvolte. Uno svantaggio di questo approccio è la mancanza di informazioni sulle dinamiche del processo, nonché la sua incapacità di eseguire studi ad alto rendimento. Approcci di microscopia leggera come la microscopia a fluorescenza di riflessione interna totale (TIRFM), che sfrutta il campo evanescente per illuminare i fluorofori nelle vicinanze del cos coverslip (100 nm), fornisce una buona risoluzione temporale e spaziale per studiare gli eventi di esocitosi. Tuttavia, questo metodo è compatibile solo con le cellule aderenti e può essere applicato solo alla parte ventrale / inferiore delle cellule.
Da notare, la membrana plasmatica rivela una significativa eterogeneità basata su complessi adesivi che sono presenti solo in aree ristrette. Questa eterogeneità limita, ad esempio, l’adozione di diversi ligandi4. Allo stesso modo, è stato recentemente riferito che la secrezione dal complesso di Golgi è concentrata in “punti caldi” nella membranaplasmatica 5. Inoltre, è noto che alcuni carichi sono secreti attraverso l’esocitosi associata all’adesione focale6. Pertanto, si dovrebbe prestare particolare attenzione alla questione se gli eventi di esocitosi siano distribuiti casualmente nello spazio o se siano concentrati in aree specifiche della membrana plasmatica. Diversi strumenti statistici basati sulla funzione K di Ripley sono stati proposti per esplorare questedomande 7,8,9. Il nostro approccio combina questi strumenti con micromodello per controllare la forma delle cellule e l’eterogeneità della membrana plasmatica. Oltre a fornire un mezzo per distinguere tra aree adesive e non analizzate, questa tecnica consente anche il confronto tra diverse cellule e condizioni e aumenta la potenza delle analisi statistiche.
Qui impieghiamo una varietà di strumenti statistici per studiare la distribuzione spaziale degli eventi di esocitosi dal compartimento lisosomiale monitorato dall’imaging cellulare vivo TIRFM di VAMP7-pHluorin nelle cellule hTert-RPE1 normalizzate a micromodello ad anello. È stato confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processocasuale 8,9 e che gli eventi di esocitosi esibiscono il clustering. Da notare, abbiamo scoperto che gli eventi di esocitosi sono raggruppati anche in aree non aesive, indicando che le molecole di adesione non sono le uniche strutture che possono indurre punti caldi secretori alla membrana plasmatica. Tuttavia, l’adesione cellulare ha migliorato il clustering. Coerentemente, la nostra analisi ha identificato aree arricchite di esocitosi che si trovavano al confine tra le aree adesive e non aesive.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo monitorato gli eventi di estosi dal compartimento lisosomiale dall’imaging cellulare live TIRFM di VAMP7-pHluorin in cellule normalizzate a micromodello a forma di anello ed abbiamo eseguito una rigorosa analisi statistica dei parametri spaziali degli eventi di esocitosi. Impiegando la funzione K di Ripley trasformata e un test statistico basato sulla distanza vicina più vicina, abbiamo confermato che la secrezione dai lisosomi non è un processocasuale 8,9</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo molto Thierry Galli (Centro di Psichiatria e Neuroscienze, INSERM) per aver fornito il plasmide VAMP7-pHluorin. Ringraziamo Tarn Duong per i consigli sull’analisi statistica e i membri del laboratorio GOUD per le discussioni fruttuose. Gli autori riconoscono molto il Cell and Tissue Imaging Facility (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg e PICT-IBiSA @Pasteur) e il Nikon Imaging Center, Institut Curie (Parigi), membro dell’Infrastruttura Nazionale francese di ricerca Francia-BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L. è stato sostenuto dall’Associazione pour la Recherche sur le Cancer (ARC) e P.M. ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell’Unione europea nell’ambito dell’accordo di sovvenzione n. 666003 dell’Unione europea. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni di INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), il Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-003) Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL), così come il Centre National de la Recherche Scientifique e Institut Curie.
Materials
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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