Summary
在微模型细胞上对细胞外细胞的活成像允许这个过程的空间定量。使用微模式进行形态学规范化是揭示细胞过程空间分布的一般规则的杰出工具。
Abstract
通过总内部反射荧光显微镜（TIRFM）对pHluorin标记可溶性N-乙酰胺-敏感因子附件蛋白REceptor（V-SNARE）囊量相关膜蛋白7（VAMP7）进行实时成像，这是从溶酶体分泌物的一种简单方法。利用微模型表面的细胞培养来使细胞形状正常化，利用各种统计工具对分泌模式进行空间分析。使用 Ripley 的 K 函数和基于最近邻域距离 （NND） 的统计测试，我们确认来自裂酶体分泌不是随机过程，而是显示显著的聚类。值得注意的是，我们的分析显示，外细胞增多事件也聚集在非粘附区，表明粘附分子并不是能诱发血浆膜分泌热点的唯一结构。尽管如此，我们发现细胞粘附能增强聚类。除了精确定义的粘合剂和非粘性区域外，这些微模型的圆形几何形状允许使用极坐标，从而简化分析。我们使用内核密度估计（KDE）和外细胞病事件极坐标的累积分布函数来识别外细胞病的富集区。在环形微模式细胞中，聚类发生在粘合剂和非粘膜区域之间的边界。我们的分析说明了如何使用统计工具来调查不同生物过程的空间分布。
Introduction
外细胞增多是一种普遍的细胞过程，囊泡与血浆膜融合并释放其含量。囊泡可以完全与等离子膜（完全融合）融合，或创建一个融合孔，在有限的时间内保持开放（亲吻和运行）1。例如，新合成的蛋白质从来自高尔吉复合物的囊泡释放到细胞外介质中。这种生物合成，反极通路是原始的，特别是在多细胞生物体，分泌信号肽（如激素，神经递质）和细胞外基质成分（如胶原蛋白），以及交通跨膜蛋白到血浆膜。此外，分泌物可能来自不同的内膜：1） 回收内膜，以重复使用跨膜蛋白;2） 多体体（MMB）释放外体;3） 用于释放蛋白糖解酶的糖体。内染色体分泌已被证明对神经土菌生长、伪波迪亚形成、血浆膜修复和ATP依赖信号2非常重要。
为了研究单细胞水平的外细胞病，已经采用了几种技术。贴片夹允许在各种活细胞3中检测具有高时分辨率的单一外细胞病事件。但是，此方法不提供有关外细胞增多事件的定位信息，也不提供它发生的隔间的信息。电子显微镜允许以高空间分辨率直接可视化外细胞事件，并结合免疫标签提供有关所涉及的隔间和分子特异性的信息。这种方法的一个缺点是缺乏关于过程动态的信息，以及它无法进行高通量研究。光显微镜方法，如总内部反射荧光显微镜（TIRFM），利用消逝场照亮光泳在覆盖唇（100纳米）附近，为研究外细胞增多事件提供了良好的时间和空间分辨率。然而，这种方法只与粘附细胞兼容，只能应用于细胞的腹体/下同部分。
值得注意的是，等离子膜揭示了基于仅在限制区域存在的粘合复合物的显著异质性。这种异质性限制，例如，不同配体4的吸收。同样，最近有报道说，从高尔吉综合体分泌物集中在等离子膜5的"热点"。此外，众所周知，某些货物是通过焦粘附相关的外细胞增多6分泌的。因此，应特别注意外细胞增多事件是否随机分布在空间中，或者是否集中在血浆膜的特定区域。根据里普利的K函数，提出了几个统计工具来探讨这些问题7，8，9。,97,我们的方法将这些工具与微模式相结合，以控制细胞形状和等离子膜异质性。除了提供区分粘合剂和非粘性区域的方法外，该技术还允许对不同的细胞和条件进行比较，并增加统计分析的能力。
在这里，我们使用各种统计工具来研究由 TIRFM 活细胞成像 VAMP7-pHluorin 在环状微模式规范化 hTert-RPE1 细胞中监测的异细胞细胞学事件的空间分布。经证实，来自利索索姆的分泌物不是随机过程8,8，9，外细胞增多事件表现出聚类。值得注意的是，我们发现外细胞增多事件也聚集在非粘附区域，表明粘附分子并不是能诱发血浆膜分泌热点的唯一结构。然而，细胞粘附确实增强了聚类。一致地，我们的分析确定了位于粘合剂和非粘剂区域之间的边界的外细胞增多区域。
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Protocol
1. 微模式细胞的制备
- 细胞的转染
- 转染前一天，种子2.5 x 106 hTERT-RPE1细胞进入12井板（2 x 2厘米）的一个井在1 mL的介质。
- 在转染当天，用VAMP7-pHluorin质粒（100μL缓冲液，0.8μgDNA，3μL转染混合物）制备转染混合物。孵育10分钟。
注： VAMP7 是一个 lysosomal v -SNARE， 与发光的 pHluorin 标签融合。pHluorin探针被低pH淬火，但在外细胞形成质子释放和pHluorin开始发出信号10，11。10, - 将转染混合物添加到其介质中的细胞中。
- 在细胞上添加转染混合物后，更改介质 4 小时。
- 在未来24~48小时内使用细胞进行实验。
- 微模式制备（光刻法）
- 用乙醇清洗盖玻片（直径25毫米），让它们干燥5分钟。
- 在深紫外线下通过照明激活盖玻片 5 分钟。
- 通过彻底加湿放置石蜡薄膜的纸巾，创建一个潮湿的室。加入聚-L-莱辛-嫁接-聚乙烯乙二醇（PLL-g-PEG）溶液（0.1毫克/mL，10 mM HEPES，pH = 7.4）的滴（30 μL），并放置带激活表面的盖玻片。用顶部和孵化盖玻片关闭湿润室 1 小时。
- 在 PBS 中清洗盖玻片 2 倍，在蒸馏水中清洗 1 倍，让盖玻片干燥。
- 用蒸馏水清洗石英光掩，然后用乙醇或丙醇清洗。用过滤的气流擦干光面罩。
注：石英光掩膜的一侧涂有反光镀铬，包含微表板形式的孔。该协议使用包含 37 μm 的环形形状微模式的光掩膜。当深紫外线照射在光掩贴上时，光线只能通过这些孔12。 - 将光贴膜（镀铬侧）暴露在深紫外线下 5 分钟以清洁表面。
- 在光贴膜的镀铬侧添加小水滴（10 μL，用于 20 mm 盖玻片）。将盖玻片及其 PLL-g-PEG 处理的一侧放在水滴上，然后干燥多余的水。确保蒙版和盖玻片之间没有形成气泡。
注：水的毛细管力将固定盖玻片。 - 将光罩暴露在深紫外线下 5 分钟，将非镀铬涂层的侧面向上照射（盖玻片附着在下表面）。
注：光线只能通过孔，并修改光掩贴下方的盖玻片的 PLL-g-PEG 处理表面。 - 通过添加多余的水，从光贴上取下盖玻片。
注：盖玻片应快速浮动。 - 在湿润室（如步骤1.2.3）的石蜡膜上孵育细胞外基质蛋白溶液中的盖玻片（纤维素50微克/mL，水中稀释的荧光纤维蛋白原5微克/mL），在层压流罩下孵育1小时，以避免污染。
注：此时，通过将盖玻片存储在 PBS 中，实验可以暂停至 4 °C。
- 微模式表面上的细胞播种
- 使用符合微板盖玻片尺寸的磁性盖玻片支架安装盖玻片。在采集当天，将盖玻片支架加热至37°C，以避免在后续步骤中对电池进行热冲击。
- 通过补充DMEM/F12介质与20 mM HEPES和2%的青霉素/链霉素来准备型基。
- 将盖玻片与微型图案的侧向上放置到支架中，并在盖玻片放在支架底座上时添加图案介质。添加密封件，用磁性装置固定。用图案介质填充盖玻片支架，然后用玻璃盖合上。
注：快速，不要让盖玻片干燥。在实验之间不要用乙醇清洗盖玻片，因为密封可能会保留一些乙醇，这些乙醇会与PLL-g-PEG发生反应，并产生细胞应力。仅用肥皂水清洗盖玻片架。此外，该接头可以在37°C的型板介质中孵育1小时，以稀释残留产品。 - 通过三试（一个12井板0.5 mL）收集转染的hTERT-RPE1细胞，并加入1 mL的10%FBS DMEM/F12介质。
- 将 0.5 x 106 转染 hTERT-RPE1 细胞添加到盖玻片支架中，然后重新合合。在孵化器中孵育10分钟。
- 使用图案介质清洗盖玻片支架 5 倍，通过添加带一个移液器的图案介质和吸气介质以创建洗涤流，去除非连接细胞和残留 FBS。始终在盖玻片支架中保留少量图案介质，以避免微图案盖玻片上的细胞干燥，这将导致细胞死亡。
- 在培养箱中孵育3小时，允许全细胞扩散。
2. 获取外细胞增多数据
- 外细胞增多症事件的成像
- 将盖玻片支架放在 TIRM 下。信号必须由设置最佳成像格式的敏感摄像机检测。
注：在此实验中，使用了 100 倍镜头目标以及具有 512 x 512 像素检测区域的 EMCCD 摄像机，从而产生 160 nm 的像素大小。 - 搜索表示 VAMP7-pHluorin 完全传播的单元格（图1A）。
注：表示VAMP7的细胞清晰可辨，因为它们表现出绿色信号。 - 改变激光的角度，直到达到允许VAMP7-pHluorin外细胞病事件可视化的TIRF角度。使用显微镜软件，以与外细胞形成率和时间刻度兼容的频率（通常为 3 Hz，图 1D）进行5 分钟的采集。
注：hTERT-RPE1细胞在微模式上具有约0.3 Hz的卵素分泌率。Lysosomal外细胞症的典型持续时间为1 s。它的特点是峰值强度，然后是指数衰减。此时，探头的扩散应该很明显（图1B，C）。 C - 对于每个细胞，还使用显微镜软件进行显微模式的采集（图1A）。
- 将盖玻片支架放在 TIRM 下。信号必须由设置最佳成像格式的敏感摄像机检测。
- 获得外细胞增多坐标
- 使用 ImageJ/FIJI 打开获得的影片。使用文件|导入|图像序列。通过眼睛查找外细胞增多事件。外细胞增多事件的特点是出现向外传播的明亮信号（图1）。
- 使用点工具标记外细胞事件的中心。使用 分析 | 测量 X 和 Y 坐标以及时态坐标（切片编号）的度量。对影片的所有外细胞增多事件执行这些测量。
- 保存结果（结果 | 文件 | 另存为。为名为"结果（cell_name.txt"的每个分析单元格准备一个文本文件，其中包含按该顺序排列的所有外细胞病事件的切片、X 坐标和 Y 坐标。
文本文件应看起来像：
ID X Y 费雷特的直径半径
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
注：小心用点替换所有逗号。 - 使用"椭圆形工具"测量每个细胞的中心和直径。适合一个完美的圆（不要使用椭圆形），并使用"测量"获得X和Y坐标和Feret的直径。将每个单元格的标识 （ID）、X 和 Y 坐标、Feret 的直径和半径（直径/2）保存在名为"球形参数.txt"的文本文件中。
文本文件应看起来像：
ID X Y 费雷特的直径半径
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
注：小心用点替换所有逗号。 - 使用直工具测量微模式环的厚度（粘附长度），并在名为"Pattern 参数.txt"的文本文件中保存单元格 ID、单元格半径（来自文件："球形参数.txt"）和粘附长度。通过将粘附长度除以细胞半径来计算归一化附着力长度。
注：注意用点替换所有逗号。
该文件应看起来像：
ID 细胞半径附着力长度 归一化附着力长度
RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826
3. 单细胞空间分析
- R 包和安装
注：此分析的 R 包利用 Spatstat 封装13 计算二维 （2D） 密度和 Ripley 的 K 函数。该代码是开源的，并使用前面描述的文本文件。- 从应用程序下载并https://www.r-project.org/ R（本分析使用了 3.5.2 版）。
- 下载包（和演示数据集）自： https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- 使用 [工具] 使用 [安装包] 在 RStudio 上安装包。选择"包存档文件 （.zip;..tar.gz）"为类别"安装从："，并选择包文件。按 "安装"。
- 通过在R工作室中编写此命令并按"输入"，加载具有"库"功能（"异细胞性空间分析"）的包。
- 通过在 R 工作室中编写此命令并按"输入"，运行具有函数 "ESA（）"的包。
注：用户界面将打开。 - 选择数据集目录（.txt 文件）和输出绘图目录。
注：分析的参数（参见下面的文本）可以通过用户界面更改。 - 此脚本将自动启动和执行分析。它提供相应绘图的 .pdf 文件和包含数值结果的 .txt 文件。
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Representative Results
从VAMP7-pHluorin10、11hTert-RPE1细胞中可视化的异细胞病事件的时10,11空特征分析。hTert-RPE1细胞是非转化细胞，很好地采用微模式，在以往的基于微模式的研究4，14中被广泛使用。VAMP7 是一个 lysosomal v-SNARE15，在其 N 术语处被标记与超级黄道法林， 位于利索索姆的流明中。在细胞内，pHluorin探针被异体的低pH值淬火，但在外细胞形成期间，普洛林开始发出信号，因为pH值由于质子释放而增加。VAMP7-pHluorin由TIRFM在环状微模式上进行活细胞成像监测（图1A+B）。BpHluorin信号在外细胞形成期间表现出一个峰值，它表示利索索马质子的快速释放，然后是指数衰减，代表等离子体膜上探针的二维扩散（图1C）。hTERT-RPE1细胞呈现一种重要的细胞分泌活性，平均外细胞病率为0.28赫兹（图1D）。然而，在细胞间的外细胞形成率（标准偏差为0.15赫兹）中观察到高异质性，表明从异体分泌中有很强的细胞间变异性。
单细胞空间分析，研究异体体外细胞病是否是随机的
可以像以前对子宫内膜隔间14那样，可视化KDE外细胞病的2D分布，这可能揭示局部密度的差异（图2B）。这种方法与细胞总体平均分布的可视化有关，但由于检测到的事件数量有限（数十个事件与基于群体的分析获得的数千个事件）和高细胞对细胞变异性，在单个细胞中的信息量较少。例如，这种方法不允许我们评估外细胞病事件的分布是否遵循完整的空间随机性 （CSR） 行为（即对应于单个细胞的观测区域中的均匀点分布）。当以下两个假设为 true 时，点模式遵循 CSR 行为：1） 每个点的位置与其他点的位置无关;1） 每个点的位置与其他点的位置无关;1） 每个点的位置与其他点的位置无关。2） 在次区域找到一个点的概率仅取决于该次区域区域与总面积之间的比率。与 CSR 有三种可能偏差：1） 聚类（即聚合）;2） 分散（即以恒定距离排序）;或 3） 聚类和分散的混合物 （图 2C） 。Ripley 的 K 函数用于回答这个问题，如在以前的分析7、8、9（,8,9图 2D） 中。在 CSR 中，Ripley 的 K 函数接近 2（与事件的规范化距离），但在聚类（呼吸分散）的情况下，则优于 α2（呼吸差）。通过从 Ripley 的 K 函数中减去 α2，理论 CSR 曲线应为 0。使用与观察到的外细胞增多事件相同的点数对 CSR 案例进行模拟，以评估 CSR 病例的拟合优度（理论曲线周围的灰色包络）。应用于实验数据的实验数据转换后的 Ripley 的 K 函数在包络外显示正值，表示聚类（图 2D）。
为了研究外细胞增多事件的聚类是否如先前报告的第6条那样是由于细胞粘附引起的，我们对来自中心非粘性细胞区域的数据进行了类似的分析（图2A，灰色粘合区，白色非粘附细胞中心区域）。值得注意的是，我们发现非粘附区域的外细胞增多事件也聚集在一起（图2E），表明粘附分子并不是诱导血浆膜分泌热点的唯一结构。
由于 Ripley 的 K 函数是一个不提供 P 值的描述性统计，因此建立了统计测试，将细胞外细胞病事件与 CSR 模拟进行比较。使用了最近的相邻距离 NND（i） 方法。NDD 定义为点 i 和所有其他点之间的最小欧克利迪安距离。计算了一个细胞所有外细胞事件的平均NND（i），并与通过大量蒙特卡罗模拟获得的CSR进行比较（图2F）。我们发现图2F中分析的单单元的平均 NND 低于 CSR 案例模拟分布的平均值，表示平均邻域较近，从而聚类。在分散的情况下，预期平均 NND 的值更高（图2C）。此比较允许计算每个单元格的 P 值。P 值表示显示更极端的 NND（以双面方式）的模拟的百分比。确切地说，无偏 P 值的计算为 （k+1）/（N+1），N 是蒙特卡罗模拟的总数 （10，000），k 这些模拟的数量比观测到的测量值 16 更极端。绘制了所有P值的直方图，用于总单元格面积（图2G）和非辅助细胞面积（图2I）。如果H0："异细胞增多是一个CSR过程"是真的，那么P值的分布是预期的。如果 H0为 false，则预期为低 P 值的峰值。在P值直方图上执行 Kolmogorov-Smirnov 测试时，获得了低于 0.001 的 P 值，在这两种情况下都显示出与 CSR 的显著偏差（图 2G 和 2I）。此外，总细胞面积的聚类系数为0.955，非粘附细胞区域的聚类系数为1.000，表明裂异细胞增多是一个独立于细胞粘附的聚类过程。聚类系数表示更接近聚类行为而不是分散的单元格的百分比。此结果与 Ripley 的 K 函数一致。
为了评估细胞粘附在聚类中的作用，我们比较了非粘附区域中的平均ND与每个单个细胞的整体区域的平均ND（图2H）。由于平均 NND 与表面密度成反比，因此我们使用同性对非辅助区域的平均 NND 进行归一化。非困难区域外细胞增多事件的平均 NND 明显较大，表示聚类较少（图 2H）。因此，虽然来自非粘附区域的裂索体聚类的分泌物，但细胞粘附似乎增强了聚类。
使用极坐标对外细胞病事件进行空间分析
环形微模型的圆形几何允许使用共同的极坐标，这简化了分析，如先前发现17。因此，每个外细胞形成事件都可以通过模量（距离原点的距离，这里是细胞的下平面中心）和一个角度（根据固定的任意轴）来描述。此外，可以通过除以单元格的半径来使模数正常化。外细胞病事件的直方图是按照代表性细胞的模态绘制的（图3A）。这揭示了粘合剂/非粘性区域之间的边界周围的峰值。也观察到细胞之间的大变异性。因此，我们汇集n= 22个细胞，以获得外细胞病事件的平均分布。但是，为了给每个单元格提供相同的统计权重，随机从每个单元格中随机选择相同的事件数。这种随机选择并没有改变看到的整体模式。为了获得单个细胞的单个分布的连续平均分布，使用了KDE（图3B）。但是，由于规范化模数介于 0 和 1 之间，因此必须考虑边缘条件。18 使用了在边缘旁边更改形状的beta 内核。使用引导策略计算了错误带。观察到的平均分布与假设的CSR分布进行比较，该分布显示在较高模量下发生的事件更多，因为面积随着模量的增加而增加。由于概率密度的积分应为 1，因此 CSR 分布为 2r（具有规范化半径，不带单位）。使用大量的 CSR 蒙特卡罗模拟（每个 5，000 个）在理论曲线周围计算置信带。绘制了这些 模拟模态分布的第1 个和 99 个百分位数。我们发现，外细胞病事件的平均分布偏离假设的0.7r最大值，这相当于细胞粘合区域的开始。
我们试图测试观察到的模态分布是否与理论分布不同。因为平均分布，如在这种情况下，不能通过拟合优度测试（例如，Kolmogorov-Smirnov）准确测试，因此采用了Pecot等人提出的替代方法。此方法测量总体之间的变化和总体内的变化之间的差值，从而允许对每个坐标（即模量和角度）进行独立测试 17。此测试用于比较我们的数据与表示 CSR 外细胞病事件的模拟数据（与观测数据相同的细胞数量和外细胞病事件），并发现变异性差异（p < 0.001 与 Wilcoxon-Mann-Whitney 测试，n = 22 个细胞），表明观察到的平均外细胞病分布不是 CSR。但是，当比较两个 CSR 模拟（每个模拟 5，000 个）时，我们发现 P 值直方图没有显示均匀的分布，而是显示接近 1 的峰值，表明此测试可能缺乏灵敏度。
由于 KDE 估计依赖于内核带宽的非简单选择，并且对边缘效应敏感，因此还计算了累积分布函数，从而克服了 KDE 估计中固有的问题（图 3D）。此函数在 0 和 1 之间定义，不包含任何任意参数或偏置（例如边缘偏置）。错误和置信带的计算方式与模量分布的计算方式相同。累积分布函数证实，外细胞增多事件没有遵循CSR分布，但在0.7r最大时被过度集中。因此，这种分析使我们能够确定发生聚类的细胞区域。这个结果提出了一个有趣的问题是，0.7r最大值 的超集中是否由于环状微模式的粘合/非粘性区域的存在，还是细胞的周围/中央分泌区域的影响。
由于外细胞病事件的平均分布偏离了非粘性区域的CSR情况，我们也想知道外细胞病密度最高的地方。计算和比较了附着力区外细胞增多的表面密度。通过配对分析，我们发现附着力区的表面密度低于非粘附区（图3C）。这可以解释为细胞外围外细胞病的显著减少（最大0.85~1r，图3B）。max
图1。来自hTer-RPE1细胞中叶酸体的外细胞病：（ A ）环状微模式（红色）和粘合剂hTert-RPE1细胞与VAMP7-pHlorin（绿色）进行转染，由TIRFM成像。箭头显示外细胞增多事件。比例线 = 10 μm. （B） 外细胞病事件的 Kymograph.箭显示外细胞增多事件。比例杆 = 2 μm，时间刻度杆 = 5 s. （C） 22 个细胞的细胞外细胞异常异常的规范化强度轮廓。每个点是至少1，530个外细胞增多事件的平均值。数据呈现 [SEM. （D） 22个细胞的外细胞形成率.平均 +/- 标准偏差以红色绘制。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2.异细胞增多症事件的空间分析。 （A） 5分钟采集外细胞增多事件的散射图。每个点代表一个外细胞增多事件。粘合剂区域显示为灰色。（B） A的散射图的二元内核密度估计 （KDE）。颜色表示外细胞增多事件的局部密度。（C） 可能点模式的示意图。显示了四种情况，即"完全空间随机性"（CSR）、聚类、分散和混合，并绘制了几个最近的相邻距离（NND），以显示平均 NND 在聚类中如何减少，并随着分散而增加。（D） 使用里普利的K函数分析一个代表性细胞。红色虚线等于 CSR 事件的"Ripley 的 K 函数 - \r2"，灰色包络表示蒙特卡罗模拟的估计拟合优度，其点数与外细胞病事件相同（N 事件 = 81）。对于观察到的外细胞增多事件（N事件= 81），黑色实线等于"Ripley的K函数+\r2"。其与灰色包络的红色曲线的正偏差表示外细胞病事件的聚类。Ripley 的 K 函数被规范化为最大值为 1。（E） 使用里普利的K函数分析同一细胞的非辅助区域，如在 D中。与灰色包络外的红色曲线的正偏差表示非阻塞区域中外细胞病事件的聚类。（F） 从蒙特卡罗模拟（蓝色曲线）获得的企业社会责任 KDE 中，从一个代表性单元格（红线）的平均 NND 分布进行比较。P 值的计算为比观测到的值更极端的模拟值的百分比。（G） P 值直方图从 NND 测试获得，如 在 F 中对于 n = 26 个单元格。低P值的峰值意味着"外细胞病跟随CSR"的零假设被科尔莫戈罗夫-斯米尔诺夫测试所拒绝，表明利索马外细胞增多不是CSR。（H） 非辅助区域（白色）和总细胞区（灰色）中外细胞病事件的平均 NND 的框图。同一单元格中的两个数据点由一条线连接。在非辅助区域中，平均 NND 更大，p < 0.001 与配对的 Wilcoxon 测试 （n = 25 个细胞）， 表示非辅助区域的聚类明显减少。（I） n = 26个单元格的非辅助区域与 G 相同。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3.池状细胞外细胞 增多事件的空间分析：（ A） 一个代表性细胞的外细胞细胞发生率的直方图，在5分钟内采集 n = 161 外细胞病事件作为正常化模态的函数;0 表示单元格中心，1 表示单元格外围。细胞的粘合区域以灰色显示，与显示的细胞的模组 0.65~1 相对应。在模组周围的粘合区域开始时有一个峰值，在 0.6 和 0.7 之间。（B） 外细胞病事件的KDE作为 n = 22个细胞的规范化模态函数，每个细胞有56个事件;0 表示单元格中心，1 表示单元格外围。平均粘合区域显示为灰色，与 0.61+1 之间的模组平均对应。虚线蓝色曲线是 CSR 中预期的理论曲线。此理论曲线附带一个信封，表示使用蒙特卡罗模拟获得的 CSR 的第 1-99 个百分位数。从观测到的数据中的 KDE 曲线为红色，并伴有引导生成的误差带。粘合剂区域为灰色 +/- SEM. （C） 附着力和非粘附区的表面密度配对分析。外细胞增多表面密度计算为每个规范化区域和每秒的事件数。此处，*p < 0.05 来自配对的学生 t 测试 （n = 22 个单元格）。正常性先前曾通过夏皮罗-威尔克测试。（D） B（红线）和 蒙特卡罗CSR 模拟（虚线蓝线）中数据的累积分布函数。信封生成与 B 中一样。请注意，红线偏离理论CSR在约0.7r最大。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
通过TIRFM活细胞成像VAMP7-pHluorin在环状微模式规范化细胞中监测出状细胞的外细胞细胞发生事件，对外细胞细胞事件的空间参数进行了严格的统计分析。使用转换的Ripley的K函数和基于最近邻域距离的统计测试，我们确认从裂酶体分泌不是一个随机过程,8，9。两项统计分析都令人信服地表明，外细胞增多事件表现出聚类（图2D和2G）。将类似的工具应用于非辅助细胞区域，我们发现外细胞病事件也聚集在非辅助区域（图2E和2I）。因此，先前报告允许聚类6的粘附分子并不是能够诱导等离子膜中分泌热点的唯一结构。然而，细胞粘附增强聚类：外细胞病事件之间的平均近邻距离在非粘附区域明显较大（图2H）。一致地，基于内核密度估计和累积分布函数的分析确定了位于环状微层细胞粘合区和非粘膜区边界的外细胞病富集区。需要做更多的工作来确定聚类基础的分子机制，如粘附或向该区域特定定位裂酶体。有趣的是，我们观察到hTERT-RPE1细胞外细胞形成率的高异质性（平均外细胞形成率为0.28Hz的标准偏差为0.15Hz，图1D），表明来自细胞间细胞的分泌具有很高的细胞间变异。因此，今后的工作应考虑亚人口分析。调查这种变异是否反映了异体子室的多样性、货物差异或对外细胞增多机制的依赖性，将特别令人感兴趣。
这些结果表明了如何使用统计工具来调查不同生物过程的空间参数。此外，微模式借助于不同的微模式几何学（例如，环状与圆盘阴影），以公正的方式促进细胞粘附效果的研究。特别是，使用圆形形状便于分析，因为可以使用极坐标。由于统计工具需要一定数量的数据才能有意义，因此使用具有 30 多个事件的单元格来分析。但是，具有 30 个或更少事件的单元格可能有意义。因此，可以执行具有 30 个或更少事件的采样单元格，以便获得足够的事件进行分析，以确定是否为这种情况。同样，很难估计应分析多少细胞，尤其是在细胞间变化强烈的情况下。规避这种情况的一个方法就是从每个单元格中随机选择相同数量的事件，以便在池中每个单元格时为每个单元格提供相同的统计权重。然而，我们建议在预防措施下对少于15个细胞进行分析。由于池细胞的平均分布无法通过拟合优度测试（例如，Kolmogorov-Smirnov）进行精确测试，因此我们采用了Pecot等人提出的测试统计数据，用于测量17岁人群变异的差异。尽管此测试使我们能够在平均分布的变异中发现具有统计显著性的差异，但我们怀疑此测试的灵敏度较低，因为在比较接近 1 的 p 值的不同 CSR 模拟时，P 值直方图并不平坦（即显示均匀分布）。因此，这一统计程序可能需要改进。
我们分析的一个缺点是手动检测外细胞增多事件，这大大降低了分析的速度。自动检测的限制通常是由于所分析的独特和简单的参数（例如，外细胞增多事件的强度）中强烈的异质性。神经网络对于自动检测可能非常强大，因为它们可以经过训练来识别许多功能。
此处介绍的分析可应用于 TIRFM 观察到的其他动态过程，例如来自其他隔离室的分泌物以及膜微域或抗原呈现的分布。类似的分析也可以应用于固定细胞，以研究蛋白质的空间分布。我们希望我们的工作将提高细胞生物学中对空间分布分析的兴趣。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们非常感谢蒂埃里·加利（精神病学和神经科学中心，INSERM）提供VAMP7-pHluorin质粒。我们感谢Tarn Duong就统计分析提供法律意见，并感谢高德实验室成员进行富有成果的讨论。作者非常肯定细胞和组织成像设施（PICT-IBiSA @Burg、PICT-EM @Burg 和 PICT-IBISA @Pasteur）和尼康成像中心，居里研究所（巴黎），法国国家研究基础设施法国-生物成像（ANR10-INBS-04）的成员。H.L.得到癌症治疗协会（ARC）的支持，根据玛丽·斯考多夫斯卡-库里赠款协议第666003号，P.M.从欧洲联盟的Horizon 2020研究和创新方案获得资助。这项工作得到了感染-ERA（ANR-14-IFEC-0002-04）、Labex CelTisPhyBio（ANR-10-LBX-0038）和伊德克斯巴黎科学与莱特雷斯（ANR-10-IDEX-0001-02 PSL）以及国家恢复科学中心和居里研究所的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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