Summary
Mikro desenli hücrelerde izosomal ekzositozun canlı görüntülemesi bu sürecin mekansal bir niceleifikasyonuna olanak sağlar. Mikro desenler kullanarak morfoloji normalleştirme hücresel süreçlerin mekansal dağılımı hakkında genel kuralları ortaya çıkarmak için olağanüstü bir araçtır.
Abstract
PHluorin etiketli Çözünür N-etilmaleimid-duyarlı faktör Ek protein ReEceptor (v-SNARE) Vezikül ilişkili membran protein 7 (VAMP7) toplam iç yansıma floresan mikroskop (TIRFM) tarafından canlı görüntüleme lisosomal bölmesi salgıyı keşfetmek için basit bir yoldur. Hücre şeklini normalleştirmek için mikro desenli yüzeylerdeki hücre kültüründen yararlanarak, salgı desenlerinin mekansal analizini yapmak için çeşitli istatistiksel araçlar kullanılmıştır. Ripley'in K fonksiyonunu ve en yakın komşu mesafesine (NND) dayalı istatistiksel bir test kullanarak, lizozomlardan salgılanmanın rastgele bir süreç olmadığını, ancak önemli kümelenmeler gösterdiğini doğruladık. Analizlerimiz eksozis olaylarının da yapışmaz bölgelerde kümelenmiş olduğunu ortaya çıkararak, plazma zarında salgılayıcı sıcak noktalara neden olabilecek tek yapının yapışma molekülleri olmadığını göstermektedir. Yine de, hücre yapışmanın kümeleme artırır bulundu. Tam olarak tanımlanmış yapışkan ve yapışkan olmayan alanlara ek olarak, bu mikro desenlerin dairesel geometrisi kutupsal koordinatların kullanılmasına olanak sağlar ve analizleri basitleştirir. Eksozisin zenginleştirilmiş alanlarını belirlemek için Çekirdek Yoğunluk Tahmini (KDE) ve eksozis olaylarının polar koordinatlarında kümülatif dağılım fonksiyonunu kullandık. Halka şeklindeki mikro desenli hücrelerde, yapıştırıcı ve yapışkan olmayan alanlar arasındaki sınırda kümelenme meydana geldi. Analizlerimiz, çeşitli biyolojik süreçlerin mekansal dağılımlarını araştırmak için istatistiksel araçların nasıl kullanılabildiğini göstermektedir.
Introduction
Eksozisoz, vezikülün plazma zarı ile kaynaşıp içeriğini serbest bıraktırdığı evrensel bir hücresel süreçtir. Vezikül ya plazma membran (tam füzyon) ile tamamen sigorta veya sınırlı bir süre boyunca açık kalır bir füzyon gözenek oluşturmak (kiss-and-run)1. Örneğin, yeni sentezlenen proteinler Golgi kompleksinden gelen veziküllerden hücre dışı ortama salınır. Bu biyosentetik, anterograd yolu ilkel, özellikle çok hücreli organizmalarda, sinyal peptidler salgılamak için (örneğin, hormonlar, nörotransmitterler) ve ekstrasellüler matriks bileşenleri (örneğin, kollajen), yanı sıra plazma membran trafik transmembran proteinleri. Ayrıca, salgıları farklı endozomlarda oluşabilir: 1) transmembran proteinleri yeniden kullanmak için geri dönüşüm endozoslar; 2) çok vezizküler cisimler (MVBs) ekzozomlar serbest bırakmak için; ve 3) proteolitik enzimlerin salınımı için lizozomlar. Endozomal salgının neurite büyüme, psödopodi oluşumu, plazma membran onarımı ve ATP'ye bağlı sinyalizasyon2için önemli olduğu gösterilmiştir.
Tek hücre düzeyinde eksofisoz çalışması için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Patch-clamp canlı hücrelerin geniş bir yelpazede yüksek zamansal çözünürlük ile tek eksozis olaylarının tespiti için izin verir3. Ancak, bu yöntem eksozis olaylarının yerelleştirilmesi veya hangi bölmeden oluştuğu hakkında bilgi sağlamaz. Elektron mikroskobu, ekszositik olayların yüksek uzamsal çözünürlükte doğrudan görüntülenmesine olanak sağlar ve immünetiketleme ile birlikte ilgili bölmelerin ve moleküllerin özgüllüğü hakkında bilgi sağlar. Bu yaklaşımın bir dezavantajı sürecin dinamikleri hakkında bilgi eksikliği yanı sıra yüksek iş itimat ları gerçekleştirmek için yetersizlik olduğunu. Coverslip (100 nm) civarındaki floroforları aydınlatmak için evanescent alanını kullanan total internal yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) gibi ışık mikroskobu yaklaşımları, eksositoz olaylarını incelemek için iyi zamansal ve mekansal çözünürlük sağlar. Ancak, bu yöntem sadece yapışık hücrelerle uyumludur ve sadece hücrelerin ventral/alt kısmına uygulanabilir.
Dikkat dikkat, plazma membran sadece kısıtlı alanlarda mevcut yapışkan kompleksleri dayalı önemli heterojenite ortaya koymaktadır. Bu heterojenlik, örneğin, farklı ligandsalımınıkısıtlar 4 . Benzer şekilde, son zamanlarda Golgi kompleksinden salgı plazma membran"sıcaknoktalar" 5 yoğunlaşmıştır bildirilmiştir. Ayrıca bazı kargoların fokal-yapışma ile ilişkili eksozitoz6ile salgılandırılan bilinmektedir. Bu nedenle eksositoz olaylarının uzayda rastgele dağılıp dağıtılmadığı veya plazma zarının belirli bölgelerinde yoğunlanıp yoğunlaşmadığı sorusuna özel bir dikkat edilmelidir. Ripley's K fonksiyonudayalı çeşitli istatistiksel araçlar bu soruları keşfetmek için önerilmiştir7,8,9. Yaklaşımımız hücre şekli ve plazma membran heterojenliğini kontrol etmek için mikro desenleme ile bu araçları birleştirir. Yapışkan ve yapışkan olmayan alanları ayırt etmek için bir araç sağlamanın yanı sıra, bu teknik aynı zamanda farklı hücreler ve koşullar arasında karşılaştırma sağlar ve istatistiksel analizlerin gücünü artırır.
Burada, RING şekilli mikro desenli hTert-RPE1 hücrelerinde VAMP7-pHluorin'in TIRFM canlı hücre görüntülemesi ile izlenen lysosomal kompartmandan ekzositoz olaylarının mekansal dağılımını incelemek için çeşitli istatistiksel araçlar uyguluyoruz. Bu izozomlardan salgı rastgele bir süreç8,,9 değildir ve ekzositoz olayları kümelenme sergi doğrulandı. Eksozis olaylarının da adhesif olmayan bölgelerde kümelenmiş olduğunu ve adezyon moleküllerinin plazma zarında salgı layıcı sıcak noktalara neden olabilecek tek yapı olmadığını gördük. Yine de, hücre yapışması kümeleme geliştirmek yaptı. Analizlerimiz sürekli olarak yapışkan ve yapışkan olmayan bölgeler arasındaki sınırda bulunan zenginleştirilmiş eksofis alanları tespit etti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Mikro desenli hücrelerin hazırlanması
- Hücrelerin transfeksiyonu
- Transfeksiyondan bir gün önce, tohum 2.5 x 106 hTERT-RPE1 hücrelerini 1 mL orta 12 kuyuplakadan (2 x 2 cm) bir kuyuya yerleştirin.
- Transfeksiyon gününde, transfeksiyon karışımını VAMP7-pHluorin plazmid (100 μL tampon, 0.8 g DNA, 3 μL transfection karışımı) ile hazırlayın. 10 dakika kuluçka.
NOT: VAMP7 bir lysosomal v-SNARE, luminal pHluorin etiketi ile erimiş. PHluorin probu düşük pH ile söndürülür, ancak eksoz proton lar serbest bırakılır ve pHluorin bir sinyal yaymaya başlar10,11. - Transfeksiyon karışımını kendi ortamlarındaki hücrelere ekleyin.
- Hücrelere transfeksiyon karışımı ekledikten sonra orta 4 saat değiştirin.
- Sonraki 24-48 saat boyunca deneyler için hücreleri kullanın.
- Mikrodesen hazırlama (fotolitografi yöntemi)
- Kapakları (25 mm çapında) etanolde yıkayın ve 5 dakika kurutun.
- 5 dakika boyunca derin UV altında aydınlatma tarafından coverlips etkinleştirin.
- Bir parafin filminin yerleştirildiği kağıt havluyu iyice nemlendirerek nemli bir oda oluşturun. Poli-Lizin-greft-Polietilen Glikol (PLL-g-PEG) çözeltisi (0.1 mg/mL, 10 mM HEPES, pH = 7.4) damla (22 mm coverslip için 30 μL) ekleyin ve üzerlerinde aktif yüzey bulunan kapakları yerleştirin. 1 saat boyunca bir üst ve kuluçka kapakları ile nemli oda kapatın.
- Kapakları PBS'de 2 x, distile suda 1 kat layın ve kurutun.
- Kuvars fotokopisini distile suyla ve ardından etanol veya propanol ile yıkayın. Fotomaskeyi filtrelenmiş hava akışı yla kurulayın.
NOT: Kuvars fotomaske mikro desenler şeklinde delikler içeren antiyansıtıcı krom ile bir tarafta kaplanır. Bu protokolde 37 μm'lik halka şeklinde mikro desenler içeren bir fotomaske kullanılır. Derin UV fotomaske üzerinde parlatıcı olduğunda, ışık sadece bu deliklerden geçebilir12. - Yüzeyi temizlemek için fotomaskeyi (krom kaplı tarafı) 5 dakika boyunca derin UV'ye maruz bırakın.
- Fotoğraf maskesinin krom kaplı tarafına küçük su damlaları (20 mm coverslip için 10 l) ekleyin. Kapak kapağını PLL-g-PEG ile işlenmiş yanlarıyla birlikte damlaya yerleştirin ve ekstra suyu kurulayın. Maske ve kapaklar arasında hava kabarcıkları oluşmadığından emin olun.
NOT: Suyun kılcal kuvveti kapakları hareketsiz hale getirecektir. - Fotomaskeyi krom kaplı olmayan kenarı yukarı (kapaklar alt yüzeye takılı) ile 5 dakika boyunca derin UV'ye maruz bırakın.
NOT: Işık sadece deliklerden geçebilir ve fotomaskenin altındaki kapak kapaklarının PLL-g-PEG ile işlenmiş yüzeyini değiştirebilir. - Fazla su ekleyerek kapakdudaklarını fotoğraf maskesinden çıkarın.
NOT: Kapaklar hızlı bir şekilde süzülmelidir. - Kapakçıkları, kontaminasyonu önlemek için 1 saat boyunca nemli bir odada (1.2.3 adımda olduğu gibi) parafin filminde hücre dışı matriks proteinlerinin (fibronektin 50 g/mL'si, suda seyreltilmiş 5 g/mL floresan fibrinojen) çözeltisinde kuluçkaya yatırın.
NOT: Deney, kapak kapakları nın PBS'de 4 °C'de saklanması yla bu noktada duraklatılabilir.
- Mikro desenli yüzeylerde hücre tohumlama
- Kapakları takmak için mikro desenli kapak dudaklarının boyutuna uyan manyetik bir kapak tutucu kullanın. Satın alma gününde, sonraki adımlarsırasında hücreler için termal şoku önlemek için kapak tutucuyu 37 °C'ye ısıtın.
- DMEM/F12 ortamını 20 mM HEPES ve penisilin/streptomisinin %2'sini tamamlayarak desen ortamını hazırlayın.
- Kapakları mikro desenli tarafı yukarı ile tutucuya yerleştirin ve kapak tabanına girer girmez desen ortamı ekleyin. Mührü ekleyin ve manyetik cihaz ile hareketsiz hale getirin. Kapak tutucuyu desen ortasıyla doldurun ve cam kapakla kapatın.
NOT: Kapak kaymasının kurumasını sağlamak için hızlı olun. Kapak tutucuyu deneyler arasında etanolle yıkamayın, çünkü mühür PLL-g-PEG ile reaksiyona girebilen ve hücre stresine neden olabilecek bazı etanolleri koruyabilir. Kapak tutucuyu sadece sabunlu suyla yıkayın. Ayrıca, eklem kalıntı ürünü seyreltmek için 37 °C'de 1 saat boyunca desen lisenin içinde kuluçkaya yayılabilir. - Transekse hTERT-RPE1 hücrelerini tripsinizasyon (bir 12 kuyu plakası için 0,5 mL) toplayın ve 1 mL %10 FBS DMEM/F12 ortamı ekleyin.
- Kapak tutucuya 0,5 x 106 transfected hTERT-RPE1 hücreleri ekleyin ve yeniden kapatın. Kuluçka makinesinde 10 dakika kuluçka.
- Bir pipet le desen orta ekleyerek ve bir yıkama akışı oluşturmak için başka bir pipet ile orta aspire ederek, bağlı olmayan hücreleri ve artık FBS kaldırmak için desen orta ile coverslip tutucu 5x yıkayın. Mikro desenli kapaktaki hücrelerin kurumasını önlemek için kapak tutucuda her zaman küçük bir hacimli desen liyakatı saklayın, bu da hücre ölümüne yol açacaktır.
- Tam hücre yayılmasını sağlamak için 3 saat için kuluçka.
2. Eksoz verilerinin elde edilmesi
- Eksoz olaylarının görüntülenmesi
- Bir TIRM altında kapak tutucu yerleştirin. Sinyal, mevcut en iyi görüntüleme formatına sahip hassas bir kamera tarafından algılanmalıdır.
NOT: Bu deneyde, 160 nm piksel boyutuna yol açan 512 x 512 piksel algılama bölgesine sahip 100x lens hedefi ve Bir EMCCD kamera kullanılmıştır. - Tam olarak yayılmış VAMP7-pHluorin ifade eden bir hücre arayın (Şekil 1A).
NOT: VAMP7'yi ifade eden hücreler açıkça tanımlanabilir, çünkü yeşil bir sinyal sergilerler. - VAMP7-pHluorin eksoz olaylarının görüntülenmesine olanak tanıyan TIRF açısına ulaşın. Mikroskop yazılımını kullanarak eksoz oranı ve zaman ölçeği (genellikle 3 Hz, Şekil 1D)ile uyumlu bir frekansta 5 dk'lık bir kazanım gerçekleştirin.
NOT: hTERT-RPE1 hücrelerinin mikro desenlerde yaklaşık 0.3 Hz lik bir lisozomal salgı hızı vardır. Ksozomal ekzositozun tipik bir süresi 1 s. Bu bir üstel çürüme takip bir tepe yoğunluğu ile karakterizedir. Probun difüzyonu şu anda belirgin olmalıdır(Şekil 1B, C). - Her hücre için, mikroskop yazılımı(Şekil 1A)kullanarak mikrodesen bir edinimi gerçekleştirmek.
- Bir TIRM altında kapak tutucu yerleştirin. Sinyal, mevcut en iyi görüntüleme formatına sahip hassas bir kamera tarafından algılanmalıdır.
- Eksozis koordinatlarının alınması
- Satın alınan filmi ImageJ/FIJI ile açın. Dosyayı Kullan | İthalat | Görüntü Sırası. Eksozis olaylarını göz ile bulun. Eksozis olayı, dışa doğru yayılan parlak bir sinyalin görünümü ile karakterizedir (Şekil 1).
- Ekskositik olayın merkezini işaretlemek için nokta aracını kullanın. Analiz Kullan | X ve Y koordinatlarını ve zamansal koordinatı (dilim sayısını) ölçmek için ölçün. Filmin tüm eksozis olayları için bu ölçümleri gerçekleştirin.
- Sonuçları kaydet (Sonuçlar | Dosya | Olarak Kaydet). Bu sırada ki tüm eksozis olayları için dilim, X koordinatları ve Y koordinatlarını içeren "Sonuçlar(cell_name).txt" adlı her çözümlenmiş hücre için bir metin dosyası hazırlayın.
Metin dosyasının aşağıdaki gibi görünmesi gerekir:
ID X Y Feret'in çapı Yarıçapı
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
NOT: Tüm virgülleri puanlarla değiştirmeye dikkat edin. - "Oval Alet" kullanarak her hücrenin merkezini ve çapını ölçün. Mükemmel bir daire sığdırın (oval kullanmayın) ve X ve Y koordinatlarını ve Feret'in çapını elde etmek için "Ölçü" kullanın. Her hücrenin kimliğini (kimliği), X ve Y koordinatlarını, Feret'in çapını ve yarıçapını (çap/2) "Küresel parametre.txt" adlı bir metin dosyasına kaydedin.
Metin dosyasının aşağıdaki gibi görünmesi gerekir:
ID X Y Feret'in çapı Yarıçapı
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
NOT: Tüm virgülleri puanlarla değiştirmeye dikkat edin. - Mikro desen halkasının (yapışma uzunluğu) kalınlığını düz bir araçla ölçün ve hücre kimliğini, hücre yarıçapını (dosyadan: "Küresel parametre.txt") ve "Desen parametresi.txt" adlı bir metin dosyasında yapışma uzunluğunu kaydedin. Yapışma uzunluğunu hücre yarıçapına bölerek normalleştirilmiş yapışma uzunluğunu hesaplayın.
NOT: Tüm virgülleri puanla değiştirmeye dikkat edin.
Dosya aşağıdaki gibi görünmelidir:
ID Hücre yarıçapı adezyon uzunluğu Normalleştirilmiş yapışma uzunluğu
RPE1_WT_Cell1 115 34 0,295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0,304347826
3. Tek hücreli uzamsal analiz
- R paketi ve montajı
NOT: Bu analiz için R paketi, iki boyutlu (2D) yoğunluğu nu ve Ripley'in K işlevini hesaplamak için Spatstat paketi13'ten yararlanır. Kod açık kaynak kodludur ve daha önce açıklanan metin dosyalarını kullanır.- https://www.r-project.org/'dan R'yi indirin ve yükleyin (sürüm 3.5.2 bu analizde kullanılmıştır).
- Paketi (ve demo veri kümesini) şu gönderenlerden indirin: https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper
- Paketi R Studio'da "Tools" kullanarak "Install Packages" kullanarak yükleyin. "Paket Arşiv Dosyası (.zip; .tar.gz)" kategorisi için "Install from:" seçeneğini belirleyin ve paket dosyasını seçin. Basın "Install".
- Paketi R stüdyosuna bu komutu yazarak ve "Enter" tuşuna basarak "library("ExocytosisSpatialAnalysis")" işleviile yükleyin.
- Paketi "ESA()" işlevi ile r stüdyosuna bu komutu yazarak ve "Enter" tuşuna basarak çalıştırın.
NOT: Bir kullanıcı arabirimi açılır. - Veri kümesi (.txt dosyaları) dizini ve çıktı çizimleri için bir dizini seçin.
NOT: Analiz parametreleri (aşağıdaki metne bakın) bir kullanıcı arabirimi üzerinden değiştirilebilir. - Bu komut dosyası otomatik olarak başlatılacak ve çözümleme gerçekleştirecek. Sayısal sonuçlar içeren ilgili çizimlerin ve .txt dosyalarının .pdf dosyalarını sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekzositoz olaylarının spatiotemporal özellikleri VAMP7-pHluorin10,11 hTert-RPE1 hücrelerinde görüntülenen lizozomlardan analiz edildi. hTert-RPE1 hücreleri mikro desenleme iyi benimsemek ve yaygın önceki mikrodesen tabanlı çalışmalarda kullanılmıştır dönüştürülmemiş hücrelerdir4,14. VAMP7, N-terminus'unda süper ekliptik pHluorin ile etiketlenmiş ve lizoomun lümeninde bulunan bir lysosomal v-SNARE15'tir. Hücre içinde, pHluorin probu lizomun düşük pH'ı tarafından söndürüldü, ancak ekzositoz sırasında pHluorin proton salınımı nedeniyle pH arttığı için sinyal vermeye başladı. VAMP7-pHluorin, halka şekilli mikro desenlerde TIRFM canlı hücre görüntülemesi ile izlendi (Şekil 1A–B). PHluorin sinyali, lözomal protonların hızlı salınımını ve ardından üstel bozunmayı temsil eden ekzositoz sırasında bir tepe gösterdi ve sondanın plazma zarında 2D difüzyonunu temsil etti (Şekil 1C). hTERT-RPE1 hücreleri ortalama 0.28 Hz(Şekil 1D)ekzositoz oranı ile önemli bir izosomal sekresyon aktivitesi sundular. Ancak hücreler arasında ekzositoz oranında yüksek heterojenlik gözlendi (standart sapma 0.15 Hz), lizozomlardan sekresyonda hücreden hücreye değişkenlik olduğunu gösteriyordu.
Lizozomların ekzositozunun rastgele olup olmadığını araştırmak için tek hücreli mekansal analiz
Daha önce endajen bölmeler için yapılan14, yerel yoğunluklarda farklılıklar ortaya çıkarabilir (Şekil 2B)eksozis in 2D dağılımını KDE ile görselleştirmek mümkün oldu . Bu yaklaşım, bir hücre popülasyonunun ortalama dağılımının görselleştirilmesi için önemlidir, ancak algılanan sınırlı sayıdaki olaylar (nüfus tabanlı analizle elde edilen birkaç bine karşı onlara karşı) ve hücreden hücreye değişkenlik oranının yüksek olması nedeniyle tek hücrelerde daha az bilgilendiricidir. Örneğin, bu yaklaşım, eksozis olaylarının dağılımının tam bir mekansal rastgelelik (KSS) davranışı (yani, tek bir hücre için gözlenen bir bölgede tek tip nokta dağılımına karşılık gelen) izlenip izlemediğini değerlendirmemize izin vermedi. Aşağıdaki iki hipotez doğru olduğunda bir puan deseni CSR davranışını izler: 1) her noktanın konumu diğer noktalardan bağımsızdır; ve 2) bir alt bölgede bir nokta bulma olasılığı yalnızca bu alt bölgenin alanı ile toplam alan arasındaki orana bağlıdır. CSR'den üç olası sapma vardır: 1) kümeleme (yani, toplama); 2) dağılım (yani, sabit mesafe ile sipariş); veya 3) kümeleme ve dağılım karışımı (Şekil 2C). Ripley'in K fonksiyonu önceki analizlerde olduğu gibi bu soruyu cevaplamak için kullanılmıştır7,8,9 (Şekil 2D). Ripley'in K fonksiyonu CSR durumunda πr²'ye (d bir olaydan normalleştirilmiş uzaklık) yakındır, ancak kümelenme (solunum dağılım) durumunda πr²'ye üstündür (solunum kalitesi) vardır. Ripley'in K fonksiyonundan πr² çıkarılarak teorik CSR eğrisi 0 olmalıdır. CSR olgularının simülasyonları, CSR vakası (teorik eğri etrafında ki gri zarf) için uygun olan iyiliği değerlendirmek için gözlenen eksozis olayları ile aynı sayıda nokta kullanılarak gerçekleştirildi. Deneysel verilere uygulanan dönüştürülmüş Ripley'in K işlevi zarfın dışında pozitif değerler sergileyerek kümelenmeyi gösterir (Şekil 2D).
Eksozis olaylarının kümelemesi daha önce bildirilen6hücre adezyonundan kaynaklanıp bağlı olmadığını araştırmak için, merkezdeki yalnızca yapışkan olmayan hücre bölgesinden(Şekil 2A, gri, beyaz yapışkan hücre merkezi alanında yapışkan alan) elde edilen veriler üzerinde benzer bir analiz gerçekleştirdik. Dikkat edin, adhesif olmayan bölgede eksositoz olaylarının da kümelenmiş olduğunu bulduk(Şekil 2E),plazma zarlarında salgı sıcak noktaları na neden olan tek yapıların yapışma molekülleri olmadığını göstermektedir.
Ripley'in K işlevi P değeri sağlamayan açıklayıcı bir istatistik olduğundan, hücresel eksositoz olaylarını CSR simülasyonları ile karşılaştıran istatistiksel bir test hazırlandı. En yakın komşu mesafesi NND(i) yöntemi kullanılmıştır. NDD, i noktası ile diğer tüm noktalar arasındaki minimum Öksiklin mesafesi olarak tanımlanır. Bir hücrenin tüm eksositik olaylarından ortalama NND(i) hesaplandı ve çok sayıda Monte Carlo simülasyonu ile elde edilen CSR ile karşılaştırıldı(Şekil 2F). Şekil 2F'de analiz edilen tek hücrenin ortalama NND'sinin CSR örneğinin simüle edilmiş dağılımının ortalamasından daha düşük olduğunu ve bu nedenle ortalama olarak yakın komşuları ve dolayısıyla kümelenmeyi gösterdiğini bulduk. Dağılım durumunda, ortalama NND için daha yüksek bir değer bekleniyordu (Şekil 2C). Bu karşılaştırma, her hücre için bir P değerinin hesaplanmasına izin verdi. P değeri, daha aşırı bir NND (iki taraflı bir şekilde) sergileyen simülasyonların yüzdesini temsil eder. Kesin olarak, tarafsız P değeri (k+1)/(N+1) olarak hesaplandı ve N monte-carlo simülasyonlarının toplam sayısı (10.000) ve k bu simülasyonların sayısı gözlemlenen ölçüt16'dandaha aşırıydı. Tüm P değerlerinin histogramı toplam hücre alanı(Şekil 2G)ve nonadhesif hücre alanı(Şekil 2I)için çizilmiştir. H0: "Eksozisoz bir CSR işlemidir" doğruysa, P değerlerinin tek tip dağılımı beklenirdi. H0 yanlışsa, düşük P değerinde bir tepe noktası bekleniyordu. P değeri histogramları üzerinde Kolmogorov-Smirnov testi yapmakta, 0.001'e kadar bir P değeri elde edilmiştir ve her iki durumda da CSR'den anlamlı bir sapma gösterilmiştir(Şekil 2G ve 2I). Ayrıca toplam hücre alanı için 0.955, yapışmaz hücre alanı için 1.000 kümeleme katsayısı, hücre adezyonundan bağımsız olarak hücre ekzositozisinin kümelenmiş bir süreç olduğunu göstermiştir. Kümeleme katsayısı, kümeleme davranışına dağılımdan daha yakın olan hücrelerin yüzdesini temsil eder. Bu sonuç Ripley'in K fonksiyonu ile uyumluydu.
Kümelemede hücre yapışmasının rolünü değerlendirmek için, yapışkan olmayan alandaki ortalama NND'yi her bir hücreiçin genel alandakiyle karşılaştırdık(Şekil 2H). Ortalama NND yüzey yoğunluğu ile ters orantılı olduğundan, homotenty kullanarak nonadhesive alanın ortalama NND normalleştirdi. Nonadhesif alandaki eksozis olaylarının önemli ölçüde daha büyük ortalama NND'si daha az kümeleme göstermiştir(Şekil 2H). Böylece, nonadhesif alanlarda lizomkümeslerinden salgılanması, hücre adezyonu kümeleme geliştirmek gibiydi.
Polar koordinatlar kullanılarak eksozis olaylarının mekansal analizi
Halka şeklindeki mikrodesi dairesel geometrisi, daha önce17'debulunduğu gibi analizleri basitleştiren ortak kutupsal koordinatların kullanılmasına izin verebildi. Böylece her eksozis olayı bir modül (orijinden uzaklık, burada hücrenin alt düzleminin merkezi) ve bir açı (sabit bir rasgele eksene göre) ile tanımlanabilir. Ayrıca, modül hücrenin yarıçapına bölünerek normale döndürülebilir. Eksozis olaylarının histogramı temsili bir hücre için modüle göre çizilmiştir(Şekil 3A). Bu yapışkan / nonadhesive alanlar arasındaki sınır etrafında bir zirve ortaya koymuştur. Hücreler arasında büyük bir değişkenlik de gözlendi. Bu nedenle, eksoz olaylarının ortalama dağılımını elde etmek için n = 22 hücreyi birleştirdik. Ancak, her hücreye aynı istatistiksel ağırlığı vermek için, her hücreden aynı sayıda olay rasgele seçilmiştir. Bu rasgele seçim görülen genel desenleri değiştirmedi. Tek hücrelerin bireysel dağılımlarının sürekli ortalama dağılımını elde etmek için bir KDE kullanılmıştır (Şekil 3B). Ancak normalleştirilmiş modül 0 ile 1 arasında olduğu için kenar koşullarının göz önünde bulundurulması gerekiyordu. Kenarların yanında şekil değiştiren bir beta çekirdeği kullanıldı18. Bir hata bandı bir bootstrap stratejisi ile hesaplandı. Gözlenen ortalama dağılım, daha yüksek bir modülde daha fazla olay gösteren varsayımsal bir KSS dağılımıile karşılaştırıldı, çünkü alan daha yüksek bir modülle artmıştır. Olasılık yoğunluğunun integrali bir olması gerektiğinden, CSR dağılımı 2r idi (normalleştirilmiş yarıçap, birimsiz). Çok sayıda CSR Monte Carlo simülasyonu (her biri 5.000) kullanılarak teorik eğri etrafında bir güven bandı hesaplandı. Bu simülasyonlardan modül dağılımının 1ve 99yüzdelik dilimleri çizilmiştir. Eksozis olaylarının ortalama dağılımının 0.7rmax'tekivarsayımsal olandan saptı ve bu da hücrenin yapışkan alanının başlangıcına tekabül ediyor.
Modülün gözlenen dağılımının teorik dağılımdan farklı olup olmadığını test etmeye çalıştık. Ortalama dağılımlar, bu durumda olduğu gibi, uygun bir iyilik testi (örneğin, Kolmogorov-Smirnov) tarafından önerilen alternatif bir yöntem tarafından doğru bir şekilde test edilemediği için, Pecot ve ark. tarafından önerilen alternatif bir yöntem kullanılmıştır. Bu yöntem, bir popülasyon arasındaki değişim ile bir popülasyon içindeki varyasyon arasındaki farkı ölçer ve böylece her koordinat için bağımsız test yapılmasına izin verir (yani, modül ve açı)17. Bu test, verilerimizi CSR eksoz olaylarını (gözlenen verilerle aynı sayıda hücre ve eksozoz olayı) temsil eden simüle edilmiş verilerle karşılaştırmak için kullanıldı ve gözlenen ortalama eksozis dağılımının CSR olmadığını gösteren varyasyonlarda (p < 0.001 Wilcoxon-Mann-Whitney testi, n = 22 hücre) istatistiksel olarak anlamlı bir fark buldu. Ancak, iki CSR simülasyonu (her biri 5.000 simülasyonla) karşılaştırıldığında, P değeri histogramında tek tip bir dağılım göstermediğini, ancak 1'e yakın bir zirve sergilediğini ve bu testin muhtemelen hassasiyetten yoksun olduğunu gösterdik.
KDE tahmini çekirdek bant genişliği önemsiz olmayan bir seçim dayanır ve kenar etkilerine duyarlı olduğundan, kümülatif dağıtım fonksiyonu da kde tahmini(Şekil 3D)doğasında karşılaşılan sorunların üstesinden hesaplandı. Bu işlev 0 ile 1 arasında tanımlanır ve herhangi bir rasgele parametreler veya önyargılar (örn. kenar önyargıları) içermez. Hata ve güven bantları modül dağılımı nda olduğu gibi hesaplandı. Kümülatif dağılım fonksiyonu eksozis olaylarının CSR dağılımını takip etmediğini, ancak 0.7rmaxcivarında modüllü olarak aşırı yoğunlaştığını doğruladı. Böylece bu analiz, kümelenmenin meydana geldiği hücresel alanları belirlememizi sağladı. Bu sonucun ortaya çıkardığı ilginç bir soru, 0.7rmaksimumdaki aşırı konsantrasyonun halka şeklindeki mikrodesenin yapışkan/nonadif alanlarının varlığından mı yoksa hücrelerin periferik/merkezi salgı alanlarının etkisinden mi kaynaklandığıdır.
Adhesive olmayan alanlarda ve yapışkan alanlarda KSS durumundan sapmış eksositoz olaylarının ortalama dağılımı olarak, eksozis yoğunluğunun en yüksek olduğu yeri de merak ettik. Yapışma ve yapışmaz bölgelerde eksositozun yüzey yoğunlukları hesaplandı ve karşılaştırıldı. Eşli bir analizle yapışma alanının yüzey yoğunluğunun yapışma zaçısından daha düşük olduğunu bulduk(Şekil 3C). Bu hücre periferik (0.85 – 1rmax, Şekil 3B)de eksofisoz güçlü azalma ile açıklanabilir.
Şekil 1. HTert-RPE1 hücrelerindeki lizozomlardan ekzositoz: (A) Halka şeklindeki mikrodesen (kırmızı) ve yapışkan hTert-RPE1 hücresi TIRFM tarafından görüntülenerek VAMP7-pHluorin (yeşil) ile transfeced. Ok bir eksozis olayı gösterir. Ölçek çubukları = 10 μm. (B) Eksoz olaylarının kymografı. Oklar eksozis olaylarını gösterir. Ölçek çubuğu = 2 μm, zaman içinde ölçek çubuğu = 5 s. (C) 22 hücreden lisozomal ekzositozun normalleştirilmiş yoğunluk profili. Her nokta en az 1.530 eksoz olayının ortalamasıdır. Veriler ± SEM. (D) 22 hücrenin eksositoz oranı sunulmaktadır. Ortalama +/- standart sapma kırmızı ile çizilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Siyazomal ekzositoz olaylarının mekansal analizi. (A) 5 dk edinim sırasında eksozis olayları dağılım arsa. Her nokta bir eksozis olayını temsil eder. Yapışkan alan gri olarak gösterilir. (B) A'nındağılım çiziminin 2B çekirdek yoğunluğu tahmini (KDE) Renk eksozis olaylarının yerel yoğunluğunu temsil eder. (C) Olası nokta desenlerinin şematik gösterimi. Dört olgu, Tam Uzamsal Rastgelelik (CSR), Kümeleme, Dağılım ve Karışık gösterilir ve ortalama NND kümeleme de nasıl azaldığını ve dağılım ile arttığını göstermek için birkaç yakın komşu mesafeleri (NND) çizilir (kesik çizgiler). (D) Ripley'in K işlevini kullanarak bir temsili hücrenin analizi. Kırmızı kesikli çizgi CSR olayları için "Ripley's K fonksiyonu - πr²" eşittir, gri zarf eksoz olayları (Nolay = 81) ile aynı sayıda puan ile Monte Carlo simülasyonları tahmini iyilik temsil eder. Siyah düz çizgi gözlenen eksozis olayları için "Ripley's K fonksiyonu – πr²" eşittir (Nolay = 81). Gri zarftan kırmızı eğriden pozitif sapma, eksozis olaylarının kümelenmesini gösterir. Ripley'in K işlevi maksimum değeri 1 olacak şekilde normalleştirildi. (E) Aynı hücrenin nonadhesif alanının Analizi, Ripley'in K işlevini kullanarak D'dekigibi . Gri zarfın dışındaki kırmızı eğriden gelen pozitif sapma, adhesif olmayan alanda eksositoz olaylarının kümelenmesini gösterir. (F) Monte Carlo simülasyonlarından (mavi eğri) elde edilen KSR'nin KDE'si ile bir temsili hücreden (kırmızı çizgi) ortalama NND dağılımının karşılaştırılması. P değeri, gözlemlenen değerden daha aşırı olan simüle edilmiş değerlerin yüzdesi olarak hesaplanmıştır. (G) NND testinden elde edilen histogram değeri n = 26 hücreleri için F'de olduğu gibi. Düşük P değerlerinde zirve, "ekzositoz csr izler" hipotezinin Kolmogorov-Smirnov testi ile reddedildiği anlamına gelir ve bu da lisozomal ekzositozun KSS olmadığını gösterir. (H) Nonadhesive alanlarda (beyaz) ve toplam hücre alanlarında (gri) eksositoz olaylarından ortalama NND kutu-çizim. Aynı hücreden gelen iki veri noktası bir satırla birleştirilir. Ortalama NND nonadhesive alanda daha büyüktü, p < 0.001 eşleştirilmiş wilcoxon testi ile (n = 25 hücreleri), nonadhesive alanda önemli ölçüde daha az kümelenme gösteren. (I) n = 26 hücreleri için nonadhesive alan için G ile aynıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3. Havuzlu lisozomal ekzositoz olaylarının mekansal analizi: (A) Normalleştirilmiş modülün bir fonksiyonu olarak 5 dk'lık bir kazanım sırasında bir temsili hücrenin ekzositoz olaylarının histogramı = 161 ekzositoz olayları; 0 hücre merkezini, 1 hücre çevresini temsil eder. Hücrenin yapışkan alanı gri renkte gösterilir ve gösterilen hücreler için 0,65-1 arasındaki modüllüye karşılık gelir. 0.6 ve 0.7 arasında modüler alanın başında bir tepe vardır. (B) Her hücrede 56 olay olan n = 22 hücre için normalleştirilmiş modülün bir fonksiyonu olarak eksoz olaylarının KDE'si; 0 hücre merkezini, 1 hücre çevresini temsil eder. Ortalama yapışkan alan gri olarak gösterilir ve 0.61-1 arasında modüllü ortalama karşılık gelir. Kesikli mavi eğri, CSR durumunda beklenen teorik eğridir. Bu teorik eğriye Monte Carlo simülasyonu kullanılarak elde edilen CSR'nin 1.-99. Gözlenen verilerden KDE eğrisi kırmızı ve bootstrapping tarafından oluşturulan bir hata bandı eşlik ediyor. Yapışkan alan gri +/- SEM. (C) Yapışma ve yapışmaz alanlardayüzey yoğunluklarının eşleştirilmiş analizidir. Eksozis yüzey yoğunluğu normalleştirilmiş alan başına ve saniyede olay sayısı olarak hesaplandı. Burada, *p < 0.05 eşleştirilmiş bir öğrenci t-testinden (n = 22 hücre). Normallik daha önce Shapiro-Wilk testi ile test edildi. (D) B (kırmızı çizgi) ve Monte Carlo CSR simülasyonları (noktalı mavi çizgi) verilerinkümülatif dağılım fonksiyonu. Zarflar B'dekigibi oluşturuldu. Kırmızı çizginin teorik KSS'den yaklaşık 0,7rmaksimumolarak saptıklarına dikkat edin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ring şeklindeki mikrodesen-normalleşmiş hücrelerde VAMP7-pHluorin'in TIRFM canlı hücre görüntülemesi ile lisozomal kompartmandan ekzositoz olaylarını izledik ve ekzositoz olaylarının uzamsal parametrelerinin titiz bir istatistiksel analizini yaptık. Dönüştürülmüş Ripley's K fonksiyonu ve en yakın komşu mesafesine göre istatistiksel bir test istihdam, biz lizozomlardan salgı rastgele bir işlem8olmadığını doğruladı8 ,9. Her iki istatistiksel analiz de eksozis olaylarının kümeleme gösterdiğini gösterdi (Şekil 2D ve 2G). Nonadhesive hücre alanına benzer araçlar uygulayarak, eksozis olaylarının da adhesif olmayan alanlarda kümelenmiş olduğunu bulduk(Şekil 2E ve 2I). Bu nedenle, daha önce kümeleme6 izin bildirilmiştir yapışma molekülleri plazma membranda salgı sıcak noktalar neden olabilir sadece yapılar değildir. Ancak, hücre adezyonu gelişmiş kümeleme: eksozis olayları arasındaki ortalama en yakın komşu mesafesi nonadhesif alanlarda önemli ölçüde daha büyüktü(Şekil 2H). Sürekli olarak, çekirdek yoğunluğu tahmini ve kümülatif dağılım fonksiyonuna dayalı analizlerimiz, halka şekilli mikro desen hücrelerinde yapışkan ve yapışkan olmayan alanlar arasındaki sınırda bulunan zenginleştirilmiş eksoz alanları tespit etti. Kümelemenin altında yatan asezyon veya bu bölgeye özgü bir lizom hedeflemesi gibi moleküler mekanizmaları belirlemek için daha fazla çalışma gereklidir. İlginçtir ki, hTERT-RPE1 hücrelerinde ekzositoz oranında yüksek heterojenlik gözlendik (ortalama ekzositoz oranı 0.28 Hz için 0.15 Hz standart sapma, Şekil 1D),lizozomlardan sekresyonun yüksek hücre içi varyasyona sahip olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, gelecekteki çalışmalarda alt popülasyon analizleri göz önünde bulundurulmalıdır. Bu varyasyonun likozomal bölmelerin çeşitliliğini, kargo farklılıklarını veya ekzositoz makinelerine bağımlılığı nı yansıtıp yansıtmadığını araştırmak özellikle ilginç olacaktır.
Bu sonuçlar, çeşitli biyolojik süreçlerin mekansal parametrelerini araştırmak için istatistiksel araçların nasıl kullanılabildiğini göstermektedir. Ayrıca, mikro desenler farklı mikro desen geometrileri (örneğin, halka şeklinde karşı disk şeklinde) yardımıyla tarafsız bir şekilde hücre yapışmasının etkisinin incelenmesini kolaylaştırır. Özellikle yuvarlak şekillerin kullanılması analizleri kolaylaştırır, çünkü kutupsal koordinatlar kullanılabilir. İstatistiksel araçlar anlamlı olması için belirli miktarda veri gerektirdiğinden, analizlerimiz için 30'dan fazla olay içeren hücreler kullanılmıştır. Ancak, 30 veya daha az olay olan hücrelerin anlamlı olma olasılığı vardır. Böylece, 30 veya daha az olay içeren örnekleme hücreleri, analiz için yeterli olay elde etmek için bu durumda olup olmadığını belirlemek için yapılabilir. Benzer şekilde, özellikle güçlü hücreler arası varyasyon varsa, kaç hücreanaliz edilmelidir tahmin etmek zordur. Bunu atlatmanın bir yolu, her hücreyi bir araya getirerken aynı istatistiksel ağırlığı vermek için her hücreden aynı sayıda olayı rasgele seçmektir. Ancak, 15'ten az hücre üzerinde analizlerin önlem alınarak yapılmasını öneriyoruz. Havuza alınan hücrelerin ortalama dağılımları uygunluk açısından uygunluk testleri (örneğin, Kolmogorov-Smirnov) tarafından doğru bir şekilde test edilemediği için Pecot ve ark. tarafından önerilen ve popülasyonların varyasyonları arasındaki farkı ölçen bir test istatistiği17. Bu test, ortalama dağılımdaki varyasyonlarda istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulmamıza olanak saşede, p değeri histogramı düz olmadığı için bu testin düşük duyarlılığa sahip olduğundan şüpheleniyoruz (yani, tek tip dağılım gösterdi) p değerleri için farklı KSS simülasyonları karşılaştırırken 1'e yakın p değerleri için. Bu nedenle, bu istatistiksel yordamın geliştirilmesi gerekebilir.
Analizlerimizin bir dezavantajı, analizhızını önemli ölçüde azaltan eksozis olaylarının manuel olarak algılanmasıdır. Otomatik algılamadaki sınırlamalar genellikle analiz edilen benzersiz ve basit parametredeki güçlü heterojeniteden kaynaklanır (örn. eksoz olaylarının yoğunluğu). Sinir ağları otomatik algılama için potansiyel olarak güçlü olabilir, çünkü birçok özelliği tanımak için eğitilebilirler.
Burada sunulan analiz, TIRFM tarafından gözlemlenen diğer dinamik süreçlere uygulanabilir, örneğin diğer bölmelerden salgılanması ve membran mikroetki alanı nın dağılımı veya antijen sunumu. Proteinlerin mekansal dağılımını incelemek için sabit hücrelere de benzer analizler uygulanabilir. Çalışmalarımızın hücre biyolojisinde mekansal dağılım analizine olan ilgiyi artıracağını umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Biz büyük ölçüde Thierry Galli (Psikiyatri ve Nörobilim merkezi, INSERM) VAMP7-pHluorin plazmid sağlamak için kabul. Tarn Duong'a istatistiksel analiz ler ve goud laboratuvarı üyeleri nezdinde ki tavsiyeleri için teşekkür ederiz. Yazarlar büyük ölçüde Hücre ve Doku Görüntüleme Tesisi (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg ve PICT-IBiSA @Pasteur) ve Nikon Görüntüleme Merkezi, Institut Curie (Paris), Fransız Ulusal Araştırma Altyapısı Fransa-BiyoGörüntüleme (ANR10-INBS-04) üyesi kabul. H.L. Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) tarafından desteklendi ve P.M. Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 666003 kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yenilik programından fon aldı. Bu çalışma, INFECT-ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) ve Idex Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) yanı sıra Centre National de la Recherche Scientique and Curie'nin bağışları ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
References
- Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
- Samie, M. A., Xu, H. Lysosomal exocytosis and lipid storage disorders. Journal of Lipid Research. 55, 995-1009 (2014).
- Neher, E., Marty, A. Discrete changes of cell membrane capacitance observed under conditions of enhanced secretion in bovine adrenal chromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79, 6712-6716 (1982).
- Grossier, J. P., Xouri, G., Goud, B., Schauer, K. Cell adhesion defines the topology of endocytosis and signalling. The EMBO Journal. 33, 35-45 (2014).
- Fourriere, L., et al. RAB6 and microtubules restrict protein secretion to focal adhesions. Journal of Cell Biology. 218, 2215-2231 (2019).
- Wang, Y., McNiven, M. A. Invasive matrix degradation at focal adhesions occurs via protease recruitment by a FAK-p130Cas complex. Journal of Cell Biology. 196, 375-385 (2012).
- Lagache, T., Lang, G., Sauvonnet, N., Olivo-Marin, J. C. Analysis of the spatial organization of molecules with robust statistics. PLoS One. 12, 80914 (2013).
- Yuan, T., Lu, J., Zhang, J., Zhang, Y., Chen, L. Spatiotemporal Detection and Analysis of Exocytosis Reveal Fusion "Hotspots" Organized by the Cytoskeleton in Endocrine Cells. Biophysical Journal. 108, 251-260 (2015).
- Urbina, F. L., Gomez, S. M., Gupton, S. L. Spatiotemporal organization of exocytosis emerges during neuronal shape change. Journal of Cell Biology. 217, 1113-1128 (2018).
- Martinez-Arca, S., Alberts, P., Zahraoui, A., Louvard, D., Galli, T. Role of Tetanus Neurotoxin Insensitive Vesicle-Associated Membrane Protein (Ti-Vamp) in Vesicular Transport Mediating Neurite Outgrowth. Journal of Cell Biology. 149, 889-900 (2000).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and Actin Control Polarized Expression of TI-VAMP Vesicles to Neuronal Growth Cones and Their Fusion with the Plasma Membrane. Molecular Biology of Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. Simple and rapid process for single cell micro-patterning. Lab on a Chip. 9, 1640-1642 (2009).
- Baddeley, A., Rubak, E., Turner, R. Spatial point Patterns: Methodology and Applications with R. , CRC Press. Indianapolis, IN. (2015).
- Schauer, K., et al. Probabilistic density maps to study global endomembrane organization. Nature Methods. 7, 560-566 (2010).
- Advani, R. J., et al. Seven Novel Mammalian SNARE Proteins Localize to Distinct Membrane Compartments. Journal of Biological Chemistry. 273, 10317-10324 (1998).
- North, B. V., Curtis, D., Sham, P. C. A Note on the Calculation of Empirical P Values from Monte Carlo Procedures. American Journal of Human Genetics. 71, 439-441 (2002).
- Pecot, T., Zengzhen, L., Boulanger, J., Salamero, J., Kervrann, C. A quantitative approach for analyzing the spatio-temporal distribution of 3D intracellular events in fluorescence microscopy. eLife. 7, 32311 (2018).
- Chen, S. X. Beta kernel estimators for density functions. Computational Statistics & Data Analysis. 31, 131-145 (1999).
