Summary
微小パターン化細胞上のリソソームエキサイトーシスのライブイメージングは、このプロセスの空間的定量化を可能にする。マイクロパターンを用いたモルフォロジーの正規化は、細胞プロセスの空間分布に関する一般的なルールを明らかにする優れたツールです。
Abstract
pHluorinタグ付き可溶性N-エチルマレイミド感受性因子付着タンパク質REceptor(v-SNARE)ベシクル関連膜タンパク質7(VAMP7)の生画像化は、全内部反射蛍光顕微鏡(TIRFM)によるリソマルコンパートメントからの分泌を探索する簡単な方法である。微小パターン化された表面での細胞培養を利用して細胞形状を正常化し、分泌パターンの空間解析を行う様々な統計ツールを用いた。RipleyのK関数と近傍距離(NND)に基づく統計的検定を用いて、リソソームからの分泌はランダムなプロセスではなく、有意なクラスタリングを示していることを確認した。なお、我々の分析は、エキソサイトーシス事象が非接着領域にも集まっていることを明らかにし、接着分子が形質膜で分泌ホットスポットを誘導できる唯一の構造ではないことを示した。それでも、細胞接着はクラスタリングを強化することがわかりました。これらのマイクロパターンの円形ジオメトリは、接着領域と非接着領域を正確に定義したほか、極座標を使用して解析を簡素化します。我々は、Exocitosisイベントの極座標に対するカーネル密度推定(KDE)および累積分布関数を用いて、興奮性細胞化の豊かな領域を同定した。リング状のマイクロパターンセルでは、接着領域と非接着領域の境界でクラスタリングが行われた。我々の分析は、統計的ツールを使用して多様な生物学的プロセスの空間分布を調査する方法を示しています。
Introduction
エキソサイトーシスは、小胞が血漿膜と融合し、その内容を放出する普遍的な細胞プロセスである。小胞は、完全に血漿膜(完全な融合)と融合するか、限られた時間(キスアンドラン)1の間に開いたままの融合細孔を作成することができます。例えば、新たに合成されたタンパク質は、ゴルジ複合体から来る小胞から細胞外媒体に放出される。この生合成、前向きの経路は、原始であり、特に多細胞生物において、シグナル伝達ペプチド(例えば、ホルモン、神経伝達物質)および細胞外マトリックス成分(例えば、コラーゲン)を分泌すること、ならびに膜貫通タンパク質を細胞膜に通行させる。さらに、分泌物は異なるエンドーソームから起こり得る:1)膜貫通タンパク質を再利用するために、エンドーソームをリサイクルする。2)エキソソームを放出する多面体(MVB)。3)タンパク質分解酵素の放出のためのリソソーム。内膜分泌は、神経突起の成長、疑似ポディア形成、血漿膜修復、およびATP依存性シグナル伝達2にとって重要であることが示されている。
単細胞レベルでの興奮性の研究のために、いくつかの技術が採用されている。パッチクランプは、多種多様な生細胞3で高い時間分解能を持つ単一の興奮性イベントの検出を可能にする。ただし、このメソッドは、exocytosis イベントのローカライズに関する情報も、どのコンパートメントから発生するのかを提供しません。電子顕微鏡法は、高い空間分解能を持つexocyticイベントを直接可視化することを可能にし、免疫標識と組み合わせて、関係するコンパートメントおよび分子の特異性に関する情報を提供する。このアプローチの欠点は、プロセスのダイナミクスに関する情報の欠如と、ハイスループットの調査を実行できないことです。全内部反射蛍光顕微鏡(TIRFM)のような光顕微鏡法は、エバネッセントフィールドを利用してカバースリップ付近(100nm)の蛍光体を照射し、エキソサイトーシス事象を研究するための良好な時間的および空間的分解能を提供する。しかし、この方法は接着細胞とのみ互換性があり、細胞の腹側/劣った部分にのみ適用できます。
注目に、原形質膜は、制限された領域にのみ存在する接着複合体に基づいて有意な不均一性を明らかにする。この異質性は、例えば、異なるリガンド4の取り込みを制限する。同様に、最近、ゴルジ複合体からの分泌が、形質膜5の「ホットスポット」に集中することが報告されている。さらに、特定の貨物が焦点接着関連のエキソサイトーシス6によって分泌されるということが知られている。したがって、エキソサイトーシスイベントが空間内にランダムに分布しているのか、あるいはそれらが形質膜の特定の領域に集中しているのかという問題に特に注意する必要があります。リプリーのK関数に基づくいくつかの統計ツールは、これらの質問77、8、98,9を探求するために提案されています。当社のアプローチは、これらのツールをマイクロパターニングと組み合わせて、細胞形状および形質膜の不均一性を制御します。接着領域と非接着領域を区別する手段を提供することに加えて、この技術は異なる細胞および条件間の比較を可能にし、統計的分析の力を高める。
ここでは、リング状の微小パターン正規化hTert-RPE1細胞におけるVAMP7-pHluorinのTIRFMライブ細胞イメージングによって監視されるリソソームコンパートメントからのエキソサイトーシスイベントの空間分布を研究するために、さまざまな統計学的ツールを用います。リソソームからの分泌はランダムなプロセス88,9ではなく、9エキソサイトーシスイベントがクラスタリングを示すことを確認した。なお、エキソサイトーシスの事象は非接着領域にも集まっており、接着分子が、形質膜で分泌ホットスポットを誘導できる唯一の構造ではないことを示している。それにもかかわらず、細胞接着はクラスタリングを増強した。一貫して、我々の分析は、接着剤と非接着領域の境界に位置する興奮性の豊かな領域を同定した。
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Protocol
1. 微小パターン化細胞の調製
- 細胞のトランスフェクション
- トランスフェクションの1日前に、種子2.5 x 106 hTERT-RPE1細胞を12ウェルプレート(2 x 2 cm)の1ウェルに培地1mLで入れる。
- トランスフェクションの日に、トランスフェクション混合物をVAMP7-pHluorinプラスミド(100 μLバッファー、0.8 μgのDNA、トランスフェクション混合物3 μL)で調製します。10分間インキュベートします。
注:VAMP7はリソソームv-SNAREで、ルミナルpHluorinタグと融合しています。pHluorinプローブは低pHによってクエンチされるが、エキソシトーシスの間に陽子が放出され、pHluorinはシグナル10、11,11を放出し始める。 - トランスフェクションミックスを培地の細胞に加えます。
- トランスフェクションミックスを細胞に加えた後、培地4時間を変更します。
- 次の24-48時間の間に実験のために細胞を使用してください。
- マイクロパターン調製法(フォトリソグラフィ法)
- カバーリップ(直径25mm)をエタノールで洗い、5分間乾燥させます。
- 深いUVの下で5分間の照明によってカバースリップをアクティブにします。
- パラフィンフィルムを入れたペーパータオルを徹底的に加湿して、湿気の多いチャンバーを作ります。ポリL-リジングラフトポリエチレングリコール(PLL-g-PEG)溶液(0.1 mg/mL、10 mM HEPES、pH = 7.4)の滴(22mmカバースリップ用30μL)を加え、活性表面を持つカバーリップを配置します。上部で湿気の多いチャンバーを閉じ、カバースリップを1時間インキュベートします。
- PBSでカバーリップ2倍、蒸留水で1倍を洗浄し、乾燥させます。
- 水晶質を蒸留水で洗い、エタノールまたはプロパノールで洗います。フォトマスクをフィルター処理された空気流で乾燥させます。
注:石英フォトマスクは、マイクロパターンの形の穴を含む反射防止クロムで片側にコーティングされています。このプロトコルでは、リング状のマイクロパターンが37μmのフォトマスクが使用されています。フォトマスク上で深いUVが光を当てたとき、光はこれらの穴12を通過することしかできない。 - フォトマスク(クロムコーティングされた側面)を深いUVに5分間露出して表面をきれいにします。
- フォトマスクのクロムコーティングされた側に小さな水滴(20mmカバースリップの場合は10 μL)を加えます。PLL-g-PEG処理側をドロップに置き、余分な水を乾燥させます。マスクとカバーリップの間に気泡が形成されないようにします。
注:水の毛細血管力はカバーリップを固定します。 - フォトマスクを、クロムを塗り付けない側を上にして5分間深いUVに露出します(カバーリップは下面に取り付けられています)。
注: ライトは穴を通過し、フォトマスクの下にあるカバーリップのPLL-g-PEG処理面を修正することしかできません。 - 余分な水を加えてフォトマスクからカバーリップを取り除きます。
注:カバーリップはすぐに浮かぶはずです。 - 汚染を避けるために、層流フードの下で1時間(ステップ1.2.3のように)湿気の多いチャンバーのパラフィン膜に、細胞外マトリックスタンパク質(フィブロネクチン50μg/mL、水中で希釈された蛍光フィブリノーゲン5μg/mL)の溶液中でカバースリップをインキュベートします。
注: この時点で、PBS に 4 °C のカバーリップを保存することで、実験を一時停止できます。
- マイクロパターン化された表面での細胞のシード
- マイクロパターンのカバーリップのサイズに合った磁気カバースリップホルダーを使用して、カバーリップを取り付けます。取得日には、カバースリップホルダーを37°Cに加熱し、その後のステップでセルの熱衝撃を避けます。
- 20 mM HEPES とペニシリン/ストレプトマイシンの 2% で DMEM/F12 培地を補ってパターン培地を準備します。.
- カバースリップをマイクロパターン化されたサイドを上にしてホルダーに入れ、カバースリップがホルダーベースに付くとすぐにパターンメディアを追加します。シールを追加し、磁気デバイスで固定化します。カバースリップホルダーにパターン媒体を充填し、ガラス蓋で閉じます。
注:カバースリップが乾燥しないように、迅速にしてください。シールは、PLL-g-PEGと反応し、細胞ストレスをもたらす可能性のあるエタノールを保持する可能性があるため、実験の間に、実験の間にエタノールでカバースリップホルダーを洗浄しないでください。カバースリップホルダーは石鹸水のみで洗います。また、残存物を希釈するために、37°Cでパターン媒体中で1時間インキュベートすることができる。 - トランスフェクション hTERT-RPE1 細胞をトリプシナイズ(1 つの 12 ウェル プレートに 0.5 mL)で収集し、10% FBS DMEM/F12 培地の 1 mL を追加します。
- 0.5 x 106 トランス フェクション hTERT-RPE1 細胞をカバースリップ ホルダーに追加し、再び閉じます。インキュベーターで10分間インキュベートします。
- パターン・メディアでカバースリップホルダー5倍を洗浄し、パターン・メディアに1つのピペットを加え、別のピペットで吸い込んで洗浄フローを作り出すことで、非結合セルと残留FBSを除去します。マイクロパターン化されたカバースリップ上の細胞の乾燥を避けるために、常にカバースリップホルダーに少量のパターン培地を保管し、細胞死につながる。
- インキュベーター中で3時間インキュベートし、完全な細胞の広がることを可能にする。
2. エキソサイトーシスデータの取得
- エキソサイトーシスイベントのイメージング
- TIRM の下にカバースリップ ホルダーを置きます。信号は、利用可能な最高のイメージング形式で設定された敏感なカメラによって検出される必要があります。
注: この実験では、100xレンズの対向部と 512 x 512 ピクセル検出領域を備えた EMCCD カメラを使用し、160 nm のピクセル サイズを生み出しました。 - 完全に広がっているVAMP7-pHluorinを発現するセルを検索します(図1A)。
注: VAMP7 を表すセルは、緑色の信号を示すため、明確に識別できます。 - VAMP7-pHluorin エキソサイトーシスイベントの可視化を可能にするTIRF角度に達するまで、レーザーの角度を変更します。顕微鏡ソフトウェアを使用して、exocytosis 速度とタイムスケール(通常は 3 Hz、図 1D)と互換性のある周波数で 5 分の取得を実行します。
注: hTERT-RPE1 細胞は、マイクロパターン上で約 0.3 Hz のリソソーム分泌速度を有します。リソソームエキサイトーシスは、典型的な持続時間が1sである。ピーク強度の後に指数関数的な減衰が続く特徴です。この時点でプローブの拡散は明らかであるべきです(図1B、C)。 C - 各細胞について、顕微鏡ソフトを用いてマイクロパターンの取得も行う(図1A)。
- TIRM の下にカバースリップ ホルダーを置きます。信号は、利用可能な最高のイメージング形式で設定された敏感なカメラによって検出される必要があります。
- エキソサイトーシス座標の取得
- 取得したムービーを ImageJ/FIJI で開きます。ファイルを使用する|インポート|イメージ シーケンス。目でエキサイトーシスイベントを見つけます。エキサイトーシスイベントは、外側に広がる明るい信号の出現によって特徴付けられる(図1)。
- ポイント ツールを使用して、エキソキティック イベントの中心をマークします。分析を使用 する | X 座標と Y 座標、および時間座標 (スライス番号) を測定します。ムービーのすべての興奮性イベントに対してこれらの測定を行います。
- 結果を保存する (結果 | ファイル | 名前を付けて保存)。スライス、X 座標、Y 座標を含む"Results(cell_name).txt" という名前の分析されたセルごとに、その順序ですべての exocytosis イベントのテキスト ファイルを準備します。
テキスト ファイルは次のようになります。
ID X Y フェレットの直径半径
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
注: すべてのカンマをポイントに置き換えるのは注意してください。 - 「楕円形ツール」を使用して、各セルの中心と直径を測定します。完全な円(楕円形を使用しない)をフィットさせ、「測定」を使用してXとYの座標とフェレットの直径を取得します。各セルの ID(ID)、X 座標と Y 座標、フェレットの直径、半径 (直径/2) を"球面パラメータ.txt"という名前のテキスト ファイルに保存します。
テキスト ファイルは次のようになります。
ID X Y フェレットの直径半径
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
注: すべてのカンマをポイントに置き換えるのは注意してください。 - 直線ツールでマイクロパターンリングの厚さ(接着長)を測定し、セルID、セル半径(ファイルから:"球面parameter.txt")、および「Pattern parameter.txt」という名前のテキストファイルの接着長を保存します。接着長をセル半径で割って正規化接着長を計算します。
注: すべてのコンマをポイントで置き換える必要があります。
ファイルは次のようになります。
IDセル半径接着長正規化接着長
RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826
3. 単一セル空間解析
- R パッケージとインストール
注: この解析用の R パッケージは、Spatstat パッケージ13 を利用して、2 次元 (2D) 密度とリプリーの K 関数を計算します。コードはオープン ソースであり、前述のテキスト ファイルを使用します。- https://www.r-project.org/から R をダウンロードしてインストールします (この分析ではバージョン 3.5.2 が使用されました)。
- パッケージ (およびデモ データセット) を次のhttps://github.com/GoudTeam/JoVE-paperからダウンロードします。
- " パッケージのインストール " を使用して"ツール" を使用して R Studio にパッケージをインストールします。"インストール元:" カテゴリに対して [パッケージ アーカイブ ファイル (.zip; .tar.gz)]を選択し、パッケージ ファイルを選択します。を押す "インストール".
- Rスタジオでこのコマンドを書き、Enter"を押して、関数 "ライブラリ(「ExocitosisSpatialAnalysis」)を使用してパッケージを読み込みます。
- R studio でこのコマンドを書き、Enterキーを押して、関数"ESA()"を使用してパッケージを実行します。
注: ユーザー インターフェイスが開きます。 - データセット (.txt ファイル) のディレクトリと出力プロットのディレクトリを選択します。
注: 解析のパラメータ(下記のテキストを参照)は、ユーザインタフェースを介して変更できます。 - このスクリプトは自動的に開始され、分析が実行されます。これは、対応するプロットの.pdfファイルと数値結果を含む.txtファイルを提供します。
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Representative Results
エキソサイトーシスイベントの時空間的特徴を、hTert-RPE1細胞のVAMP7-pHluorin1010,1111で可視化したリソソームから分析した。hTert-RPE1細胞は、マイクロパターニングによく採用された非形質細胞であり、以前のマイクロパターンベースの研究44,1414で広く使用されてきた。VAMP7は、そのN末端でスーパーエクリプティックpHluorinでタグ付けされたリソソームv-SNARE15であり、リソソームの内腔に位置しています。細胞の内部では、pHluorinプローブはリソソームの低pHによってクエンチされたが、エキソサイトーシス中pHluorinはプロトン放出によりpHが増加したためシグナルを発し始めた。VAMP7-pHluorinは、リング状のマイクロパターン上のTIRFMライブセルイメージングによって監視された(図1A–B)。pHluorinシグナルは、リソソーム陽子の急速な放出を表すエキソサイトーシス中にピークを示し、続いて指数関数的な崩壊を示し、原形質膜におけるプローブの2D拡散を表す(図1C)。hTERT-RPE1細胞は、平均エキソサイトーシス率0.28Hzの重要なリソソーム分泌活性を示した(図1D)。しかし、細胞間のエキソサイトーシス率(標準偏差0.15Hz)では高い不均一性が認められ、リソソームからの分泌に強い細胞間変動があったことを示す。
リソソームのエキソサイトーシスがランダムかどうかを調べる単一細胞空間解析
以前にエンドムブラナスコンパートメント14に対して行われたように、KDEによるexocytosisの2D分布を視覚化することができたが、これは局所密度の違いを明らかにすることができた(図2B)。このアプローチは、細胞の集団の平均分布の視覚化には適していますが、検出される事象の数が限られているため(母集団ベースの分析によって得られた数十個対数)および高い細胞間変動性が原因で、単一細胞ではあまり有益ではありません。例えば、このアプローチでは、exocitosis イベントの分布が完全な空間乱数 (CSR) 行動に従っているかどうかを評価できませんでした (つまり、単一のセルの観測領域における一様なポイント分布に対応しています)。次の 2 つの仮説が真である場合、ポイント パターンは CSR 動作に従います。2) サブ領域内のポイントを見つける確率は、このサブ領域の面積と総面積の比率にのみ依存します。CSR からの逸脱が考えられるのは、1) クラスタリング (つまり、集約) です。2)分散(すなわち、一定の距離での順序)または3)クラスタリングと分散の混合物(図2C)。リプリーの,K関数は、以前の分析7、8、98と同様7に、この質問に答えるために使用されました (図2D)。9リプリーのK関数は、CSRの場合はπr²(イベントからの正規化された距離)に近いが、クラスタリング(呼吸分散)の場合にはπr²に優れた(呼吸劣り)である。リプリーのK関数からπr²を差し引くことにより、理論上のCSR曲線は0になります。CSR症例のシミュレーションは、観察された興奮性イベントと同じ数のポイントを使用して、CSRケース(理論曲線の周りの灰色のエンベロープ)の適合度を評価するために行った。実験データに適用される変換されたリプリーのK関数は、エンベロープの外側に正の値を示し、クラスタリングを示す(図2D)。
エキソサイトーシスイベントのクラスタリングが、前に報告された6と同様に細胞接着によるものであったかを調べるため、中心にある非接着セル領域からのデータに対して同様の分析を行った(図2A、接着領域は灰色、非粘着性細胞中心領域は白色)。なお、非接着領域におけるエキソサイトーシス事象もクラスター化されている(図2E)、接着分子が、形質膜における分泌ホットスポットを誘導する唯一の構造ではないことを示した。
RipleyのK関数はP値を提供しない記述統計量であるため、細胞性興奮性イベントとCSRシミュレーションを比較する統計検定を設定した。最も近い近傍距離 NND(i) メソッドが使用されました。NDD は、点 i と他のすべてのポイント間の最小ユークリッド距離として定義されます。1つの細胞のすべてのエキソキシティック事象からの平均NND(i)を計算し、多数のモンテカルロシミュレーションで得られたCSRと比較した(図2F)。図2Fで分析した単一細胞の平均NNDは、CSRケースのシミュレートされた分布の平均よりも低く、平均して近い隣人を示し、クラスタリングしていることがわかった。分散の場合、平均NNDに対して高い値が期待された(図2C)。この比較により、各セルの P 値の計算が可能になります。P 値は、より極端な NND を示したシミュレーションの割合を表します (両側の方法)。正確には、偏りのないP値は(k+1)/(N+1)として計算され、Nはモンテカルロシミュレーションの総数(10,000)であり、観測された測定値16よりも極端であったこれらのシミュレーションの数はkである。全てのP値のヒストグラムは、全セル領域(図2G)と非接着セル領域についてプロットした(図2I)。H0: 「エキソシトーシスはCSRプロセス」が真の場合、P値の均一な分布が期待された。H0が偽の場合、P値が低いピークが予想された。P値ヒストグラムに対してコルモゴロフスミルノフ検定を行い、0.001より劣るP値が得られ、両方の場合においてCSRからの有意な偏差を示した(図2G及び2I)。また、全細胞面積に対して0.955、非接着セル面積に対して1.000のクラスター化係数を示した結果、リソソームエキサイトーシスは細胞接着とは無関係のクラスター化プロセスであった。クラスター化係数は、分散よりもクラスター化の動作に近いセルの割合を表します。この結果は、リプリーのK関数と一致していました。
クラスタリングにおける細胞接着の役割を評価するために、非接着領域における平均NNDを個々の細胞の全体領域の平均NNDと比較した(図2H)。平均NNDは表面密度に反比例するため、均質を用いて非接着領域の平均NNDを正規化した。非接着領域におけるエキソサイトーシスイベントの有意に大きな平均NNDは、クラスタリングが少ないことを示した(図2H)。このように、非接着領域におけるリソソームクラスターからの分泌は、細胞接着がクラスタリングを増強するように見えた。
極座標を用いたエキソサイトーシスイベントの空間解析
リング状のマイクロパターンの円形ジオメトリにより、共通極座標を使用でき、以前に見つかった17のように、解析を簡素化しました。したがって、各exocytosisイベントは、モジュラス(原点からの距離、ここではセルの下面の中心)と角度(固定された任意の軸に従って)によって記述することができます。さらに、係数は、セルの半径で割ることによって正規化することができます。exocitosis イベントのヒストグラムは、代表セルの係数に従ってプロットした (図 3A)。これにより、接着剤/非接着領域の境界の周りのピークが明らかになった。細胞間の変動も大きい。そこで、n=22個の細胞をプールして、exocitosisイベントの平均分布を得た。しかし、各セルに同じ統計的重みを与えるために、各セルから同じ数のイベントをランダムに選択した。このランダムな選択は、見られる全体的なパターンを変更しませんでした。単一細胞の個々の分布の連続的な平均分布を得るために、KDEが使用された(図3B)。しかし、正規化された係数は 0 から 1 の間にあるため、エッジ条件を考慮する必要がありました。エッジの横の形状を変更するベータカーネルが18.エラーバンドはブートストラップ戦略で計算されました。観測された平均分布は、より高い係数で多くの事象を示す仮定的なCSR分布と比較された。確率密度の積分は 1 でなければならないため、CSR 分布は 2r (正規化された半径、単位なし) でした。多数のCSRモンテカルロシミュレーション(それぞれ5,000)を使用して、理論曲線を中心に信頼バンドを計算しました。これらのシミュレーションから、弾性率分布の第1 および99番目 のパーセンタイルをプロットした。我々は、エキサイトーシス事象の平均分布が、細胞の接着領域の始まりに相当する0.7rmaxの仮説的な事象から逸脱していることを発見した。
観測された弾性率の分布が理論と異なるかどうかを調べる。平均分布は、この場合のように、適合度検定(例えば、コルモゴロフ・スミルノフ)によって正確に試験することができないため、Pecotらが提案する代替方法が採用された。この方法は、母集団全体の変動と母集団内の変動の差を測定し、したがって各座標(すなわち、係数と角度)17に対して独立したテストを可能にする。このテストは、CSRエキサイトーシスイベント(観察されたデータと同じ数の細胞および興奮細胞化イベント)を表すシミュレートされたデータと比較するために使用され、観察された平均exocytos分布がCSR分布ではないことを示す変動(p<0.001とウィルコクソン・マン・ホイットニー試験、n=22細胞)の統計的に有意な差を発見した。しかし、2つのCSRシミュレーション(それぞれ5,000回のシミュレーション)を比較したところ、P値ヒストグラムは均一な分布を示さなかったが、1付近のピークを示し、この試験に感度が欠けている可能性があることを示した。
KDE 推定は、カーネル帯域幅の非自明な選択に依存しており、エッジ効果に敏感であるため、累積分布関数も計算され、KDE推定に固有の問題を克服しました (図 3D)。この関数は 0 から 1 の間で定義され、任意のパラメータやバイアス(エッジバイアスなど)は含まれません。誤差と信頼バンドは、係数分布と同じ方法で計算されました。累積分布関数は、exocytosis イベントが CSR 分布に従わなかったが、最大 0.7r のモジュライmaxで過剰に濃縮されたことを確認しました。この分析により、クラスタリングが発生したセルラー領域を特定することができました。この結果が生じる興味深い問題は、0.7rmaxでの過剰濃度が、リング状のマイクロパターンの接着/非接着領域の存在、または細胞の末梢/中央分泌領域の効果によるものかどうかである。
また、非接着性や接着領域において、CSRケースから逸脱したexocytosisイベントの平均分布として、エキソサイトーシス密度が最も高い場所も疑問に思いました。接着領域と非接着領域におけるエキソサイトーシスの表面密度を計算し、比較した。我々は、表面密度が対比分析による非接着領域よりも接着面積において低いことがわかった(図3C)。これは、細胞周辺におけるエキソサイトーシスの強い減少(0.85 – 1rmax、 図3B)によって説明することができます。
図 1.hTert-RPE1細胞におけるリソソームからのエキソサイトーシス: (A)リング状のマイクロパターン(赤)およびTIRFMによって画像化されたVAMP7-pHluorin(緑色)でトランスフェクトされたhTert-RPE1細胞に接着する。矢印は、エキサイトーシスイベントを示しています。スケールバー= 10 μm(B) エキソシトーシスイベントのキモグラフ。矢印は、エキサイトーシスイベントを示しています。スケールバー=2μm、スケールバー時間=5 s.(C)22細胞からのリソソーム興奮性の正規化強度プロファイル。C各ポイントは、少なくとも1,530件のエキソサイトーシスイベントの平均です。データは、22細胞の±SEM(D)のエキソサイトーシス率を提示する。平均 +/- 標準偏差は赤でプロットされます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2.リソソームエキサイトーシスイベントの空間解析(A) 5分の取得中のエキソサイトーシス事象の散布図。各ドットは、1 つのエキソサイトーシス イベントを表します。接着領域は灰色で示されています。(B) Aの散布図の 2D カーネル密度推定 (KDE)色は、エキソサイトーシスイベントの局所密度を表します。(C)可能なポイント パターンの概略表現。完全空間ランダム性 (CSR)、クラスタリング、分散、混合の 4 つのケースが表示され、いくつかの最も近い隣接距離 (NND) がプロットされて、平均 NND がクラスタリングでどのように減少し、分散が増加したかを示します。(D) リプリーのK関数を用いた1つの代表セルの解析赤い破線はCSRイベントの「RipleyのK関数 - πr²」に等しく、灰色のエンベロープは、エキソサイトーシスイベントと同じポイント数のモンテカルロシミュレーションからの推定適合度を表します(Nイベント= 81)。黒実線は、観察されたエキソシトーシスイベントの「リプリーのK関数 - πr²」に等しい(Nイベント= 81)。灰色のエンベロープから赤い曲線からの正の偏差は、exocytosis イベントのクラスタリングを示します。リプリーのK関数は、最大値が1に正規化されました。(E) DのようにリプリーのK関数を用いて同じセルの非接着領域の解析。灰色のエンベロープの外側にある赤い曲線からの正の偏差は、非接着領域におけるexocitosisイベントのクラスタリングを示します。(F) モンテカルロシミュレーションから得られたCSRのKDEとの1つの代表セル(赤線)からの平均NND分布の比較(青曲線)。P値は、観測値よりも極端なシミュレーション値の割合として計算されました。(G)NND試験から得られたP値ヒストグラムは、n=26細胞のFのように。GP値が低いピークは、ルレンス仮説「興奮性はCSRに続く」がコルモゴロフ・スミルノフ試験で拒絶されたことを意味し、リソソームエキサイトーシスがCSRではないことを示す。(H) 非接着領域(白)および全細胞領域におけるエキソサイトーシスイベントからの平均NNDのボックスプロット(灰色)。同じセルの 2 つのデータ ポイントは、1 つの線で結合されます。平均NNDは非接着領域においてより大きかった、p<0.001とペアのウィルコクソン試験(n=25細胞)は、非接着領域におけるクラスタリングが有意に少ないことを示す。(I) n = 26個のセルの非接着領域のGと同じ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3.プールリソソームエキソサイトーシスイベントの空間解析: (A) n = 161 エキソサイトーシスイベントを正規化された係数の関数として5分獲得中の1つの代表細胞のエキソサイトーシス事象のヒストグラム;0はセルの中心を表し、1は細胞周辺を表す。細胞の接着領域は灰色で示され、示された細胞の0.65から1までのモジュライに対応しています。0.6と0.7の間のモジュライの周りの接着領域の始まりにピークがあります。(B) 各セルに 56 個のイベントを持つ n = 22 個のセルに対する正規化された剰余の関数としてのエキソサイトーシスイベントの KDE。0はセルの中心を表し、1は細胞周辺を表す。平均接着面積はグレーで表示され、平均で0.61~1のモジュライに相当します。破線の青い曲線は、CSRの場合に予想される理論曲線です。この理論曲線には、モンテカルロシミュレーションを用いて得られたCSRの第1〜99パーセンタイルを表すエンベロープが伴います。観測データからのKDE曲線は赤色で、ブートストラップによって生成された誤差帯域を伴います。接着領域はグレー+/-SEM(C)接着領域と非接着領域における表面密度の組み合わせ解析である。exocytosis の表面密度は、正規化された領域ごとのイベント数と 1 秒あたりのイベント数として計算されました。ここでは、ペアの学生t検定(n = 22セル)から*p<0.05。正常性は以前シャピロ・ウィルク試験によってテストされた。(D) B (赤線) およびモンテカルロCSRシミュレーションからのデータの累積分布関数 (青い点線)。エンベロープは Bのように生成されました。赤い線は理論上のCSRから0.7rの最大値の周りに逸脱していることに注意してください。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
リング状の微小パターン正規化細胞におけるVAMP7-pHluorinのTIRFM生細胞イメージングによるリソソームコンパートメントからのエキソサイトーシスイベントをモニタリングし、エキソサイトーシスイベントの空間パラメータの厳密な統計解析を行った。変換されたリプリーのK関数と最も近い近傍距離に基づく統計的検定を採用し、リソソームからの分泌はランダムなプロセス88,99ではないことを確認した。どちらの統計分析も、exocytosis イベントがクラスタリングを示すことを納得のいく結果示した(図2Dおよび2G)。非接着セル領域に同様のツールを適用すると、exocytosis イベントも非接着領域にクラスター化されていることがわかりました (図 2Eおよび2I)。したがって、クラスタリング6を可能にすることが以前に報告されている接着分子は、形質膜で分泌ホットスポットを誘導できる唯一の構造ではない。しかし、細胞接着強化クラスタリング:エキソサイトーシスイベント間の平均最も近い近傍距離は、非接着領域において有意に大きかった(図2H)。一貫して、カーネル密度推定と累積分布関数に基づく分析は、リング状のマイクロパターン細胞の接着領域と非接着領域の境界に位置する興奮性の豊かな領域を同定した。この領域への接着やリソソームの特異的な標的化など、クラスタリングの根底にある分子メカニズムを決定するには、より多くの作業が必要です。興味深いことに、hTERT-RPE1細胞全体のエキソサイトーシス率(平均エキソサイトーシス率0.28Hzの標準偏差0.15Hz、図1D)において、リソソームからの分泌が細胞間変動が高いことを示す。したがって、サブ人口分析は今後の作業で考慮する必要があります。この変動がリソソームコンパートメントの多様性、貨物の違い、またはexocitosis機械への依存を反映しているかどうかを調べるのは特に興味深いでしょう。
これらの結果は、統計的ツールを使用して多様な生物学的プロセスの空間的パラメータを調査する方法を示しています。さらに、マイクロパターンは、異なるマイクロパターン形状(例えば、リング状と円盤状)の助けを借りて、公平な方法で細胞接着の効果の研究を容易にする。特に、極座標を採用できるため、円形形状を使用すると解析が容易になります。統計ツールでは、ある程度のデータを意味のあるものにする必要があるため、30 を超えるイベントを持つセルが分析に使用されました。ただし、イベントが 30 個以下のセルが意味を持つ可能性があります。したがって、30個以下のイベントを含むセルをサンプリングして、解析に十分なイベントを取得して、この場合に当てはまるかどうかを判断することができます。同様に、特に細胞間の変動が強い場合、分析すべき細胞の数を推定することは困難です。これを回避する 1 つの方法は、各セルから同じ数のイベントをランダムに選択して、各セルをプールするときに同じ統計的重みを与える方法です。ただし、15 個未満のセルの分析は、予防措置を講じ、実行することをお勧めします。プールされた細胞の平均分布は適合度検定(例えば、コルモゴロフ・スミルノフ)によって正確に検査することができないので、我々は、人口17の変動の差を測定するPecotらによって提案された試験統計を採用した。この検定では、平均分布の変動に統計的に有意な差を見つけることが可能でしたが、P値ヒストグラムが平坦でなかったため(すなわち、均一な分布を示した)p値の異なるCSRシミュレーションを1に近づけたとき、この検定は感度が低いと考えています。したがって、この統計的手順を改善する必要があるかもしれません。
解析の欠点の1つは、Exocytosis イベントの手動検出であり、解析の速度を大幅に低下させます。自動検出の制限は、分析されるユニークで単純なパラメータ(例えば、エキサイトーシスイベントの強度)における強い不均一性に起因することがよくあります。ニューラル ネットワークは、多くの機能を認識するようにトレーニングできるため、自動検出に対して強力な可能性があります。
ここで提示される分析は、他の区画からの分泌や膜マイクロドメインまたは抗原提示の分布など、TIRFMによって観察される他の動的プロセスに適用することができる。同様の解析を固定細胞にも適用して、タンパク質の空間分布を研究することができます。細胞生物学における空間分布解析への関心の高まりが期待されます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
我々は、VAMP7-pHluorinプラスミドを提供したティエリー・ガリ(精神医学・神経科学センター、INSERM)を大いに認める。統計分析に関するアドバイスとGOUD研究所のメンバーに対して、実りある議論を行なったTarn Duongに感謝します。著者らは、細胞・組織イメージング施設(PICT-IBiSA@Burg、PICT-EM@Burg、PICT-IBiSA@Pasteur)と、フランス国立研究インフラフランスバイオイメージング(ANR10-INBS-04)のメンバーであるニコンイメージングセンター、インスティトゥートキュリー(パリ)を大いに認めている。H.L.は、協会がラ・レシェルシュ・シュル・ル・ガン(ARC)を注ぎ、P.M.はマリー・スクウォトフスカ・キュリー交付金第666003年に基づく欧州連合(EU)のHorizon 2020研究・イノベーションプログラムから資金を受け取りました。この研究は、感染ERA(ANR-14-IFEC-0002-04)、ラベックス・セルティスフィバイオ(ANR-10-LBX-0038)、アイデックス・パリ・サイエンシズ・エ・レットレス(ANR-10-IDEX-0001-0001-02 PSL)、およびセンター・ナショナル・ド・ラ・レンチェルチェ・シビッテ・シヴィティー・シヴィティー・シヴィティー・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィチ・シヴィット・シヴィット・アンド・イチビティ・ナショナル・ナショナル・デ・ラ・リチェルチェ・シビフィー・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シビティー・アンド・イン・シビティー・ナショナル・ナショナル・ド・ラ・リチェルチェリ・シビッテ・シヴィッテ・シヴィッテ・シビティー
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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