Summary
미세 패턴 세포에 리소소피 외세포증의 라이브 이미징이 이 과정의 공간 적정화를 허용한다. 마이크로 패턴을 이용한 형태 학 정상화는 세포 프로세스의 공간 분포에 대한 일반적인 규칙을 발견하는 뛰어난 도구입니다.
Abstract
pHluorin 태그 용불성 N-ethylmalimide-민감한 인자 부착 단백질 REceptor (v-SNARE) 총 내부 반사 형광 현미경 검사법 (TIRFM)에 의해 소포 관련 멤브레인 단백질 7 (VAMP7)의 라이브 이미징은 리소말 구획에서 분비를 탐구하는 간단한 방법입니다. 마이크로패턴 표면에서 세포 배양을 활용하여 세포 형상을 정상화하기 위해 다양한 통계 도구를 사용하여 분비 패턴의 공간 분석을 수행했습니다. 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리(NND)를 기반으로 한 통계 테스트를 사용하여 리소좀의 분비가 무작위 과정이 아니라 상당한 클러스터링을 나타낸다는 것을 확인했습니다. 참고로, 우리의 분석은 외세포증 사건이 또한 미적혈 부위에 클러스터된다는 것을 밝혔습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력이 클러스터링을 향상시키는 것으로 나타났습니다. 정확하게 정의된 접착제 및 미적 영역 외에도 이러한 미세 패턴의 원형 형상을 사용하면 극좌표를 사용하여 해석을 단순화할 수 있습니다. 엑소세포증 의 극성 좌표에 커널 밀도 추정(KDE)과 누적 분포 기능을 사용하여 외세포증의 농축 영역을 식별했습니다. 링 모양의 마이크로패턴 세포에서 접착제와 무나정 영역 사이의 경계에서 클러스터링이 발생했습니다. 우리의 분석은 다양한 생물학적 과정의 공간 분포를 조사하기 위해 통계 도구를 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.
Introduction
외세포증은 소포가 플라즈마 멤브레인과 융합되어 그 함량을 방출하는 보편적 인 세포 과정입니다. 소포는 플라즈마 멤브레인 (전체 융합)과 완전히 융합하거나 제한된 시간 동안 열려있는 융합 모공을 만들 수 있습니다 (키스 앤 런)1. 예를 들면, 새로 합성된 단백질은 골지 복합체에서 온 소포에서 세포외 배지로 풀어 놓입니다. 이 생합성, 전방 급료 경로는 원시, 특히 다세포 유기체에서 신호 펩티드 (예를 들어, 호르몬, 신경 전달 물질) 및 세포 외 매트릭스 구성 요소 (예를 들어, 콜라겐)를 분비뿐만 아니라 플라즈마 막에 대막 단백질을 트래픽. 추가적으로, 분비물은 다른 내분모에서 생길 수 있습니다: 1) 막 단백질을 재사용하기 위하여 내모를 재활용; 2) 다중 혈관 몸 (MVBs) 엑소좀을 방출; 및 3) 프로테오리틱 효소의 방출을 위한 리소좀. 내뇌 분비는 중성염 아웃성장, 의사포디아 형성, 혈장 막 수리 및 ATP 의존신호2에중요한 것으로 나타났다.
단일 세포 수준에서 외세포증을 연구하기 위해 여러 가지 기술이 사용되었습니다. 패치 클램프는 다양한 살아있는 세포3에서높은 시간적 해상도로 단일 외세포증 이벤트를 검출할 수 있게 한다. 그러나 이 방법은 외세포증 이벤트의 국소화에 대한 정보도, 어떤 구획이 발생하는지에 대한 정보를 제공하지 않는다. 전자 현미경 검사는 높은 공간 해상도를 가진 외세포 사건의 직접 시각화를 허용하고, 면역 라벨링과 함께 관련된 구획 및 분자의 특이성에 대한 정보를 제공합니다. 이 방법의 단점은 프로세스의 역학에 대한 정보의 부족뿐만 아니라 높은 처리량 연구를 수행 할 수 없다는 것입니다. 커버슬립(100nm) 부근에서 형광을 비추기 위해 에반에센드 필드를 이도하는 총 내부 반사 형광 현미경 검사법(TIRFM)과 같은 경현미경접근법은 외세포증 사건을 연구하기 위한 좋은 시간적 및 공간 적 해상도를 제공한다. 그러나 이 방법은 부착 된 세포와만 호환되며 세포의 복부 / 열등한 부분에만 적용 할 수 있습니다.
참고로, 플라즈마 멤브레인은 제한된 영역에만 존재하는 접착제 복합체를 기반으로 상당한 이질성을 드러냅니다. 이 이질성은 예를 들어, 다른 리간드4의섭취를 제한합니다. 유사하게, 최근에는 골기 복합체로부터의 분비가 혈장 막5의"핫스팟"에 집중되어 있는 것으로 보고되고 있다. 더욱이, 특정 화물은 초점 접착 관련 엑소시토시스6을통해 분비되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 외세포증 이벤트가 공간에 무작위로 분포되는지, 아니면 혈장 막의 특정 부위에 집중되는지 여부에 대한 질문에 특별한 주의를 기울여야 한다. Ripley의 K 함수를 기반으로 한 여러 통계 도구는 이러한 질문을 탐구하기 위해 제안되었습니다7,,8,,9. 우리의 접근은 세포 모양 및 플라즈마 막 이질성을 통제하기 위하여 마이크로패터닝과 이 공구를 결합합니다. 접착제와 미적 영역을 구별하는 수단을 제공하는 것 외에도 이 기술은 다른 세포및 조건에 걸쳐 비교할 수 있으며 통계 분석의 힘을 증가시킵니다.
여기서는 TIRFM 라이브 셀 이미징이 모니터링하는 리소냐구획으로부터의 외세포증 이벤트의 공간 분포를 링 모양의 마이크로패턴-정규화 hTert-RPE1 세포에서 연구하기 위해 다양한 통계 도구를 사용합니다. 리소좀으로부터의 분비액은 무작위 과정이아님을확인하였고,,외세포증 이벤트는 클러스터링을 나타낸다. 참고로, 우리는 외세포증 사건이 또한 미각 부위에 클러스터되어 있다는 것을 것을을 발견했습니다, 접착 분자가 플라즈마 막에 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조물이 아니라는 것을 표시하. 그럼에도 불구하고 세포 접착력은 클러스터링을 향상시켰습니다. 일관되게, 우리의 분석은 접착제와 nonadhesive 지역 사이 국경에 있는 외세포증의 풍부한 지역을 확인했습니다.
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Protocol
1. 마이크로 패턴 세포의 준비
- 세포의 전환
- 1일 전, 종자 2.5 x 106 hTERT-RPE1 세포를 12웰 플레이트(2 x 2cm)의 1mL배지로 1개의 우물로 넣습니다.
- 경질 당일, VAMP7-pHluorin 플라스미드(완충제 100μL, DNA 0.8 μg, 3 μL 의 트랜스페션 혼합물)로 트랜스페션 혼합물을 준비한다. 10 분 동안 인큐베이션하십시오.
참고: VAMP7은 리소좀 v-SNARE로, 발광 플루오린 태그와 융합되어 있습니다. pHluorin 프로브는 낮은 pH에 의해 담금질되지만, 엑소시토시스 양성자가 방출되고 pHluorin신호10,,11을방출하기 시작한다. - 배지의 세포에 회입 믹스를 추가합니다.
- 세포에 형질 전환 믹스를 추가한 후 중간 체질의 4h를 변경합니다.
- 다음 24-48 시간 동안 실험을 위해 세포를 사용합니다.
- 마이크로 패턴 제제(포토리소그래피 방법)
- 에탄올로 커버립립(직경 25mm)을 씻고 5분 동안 건조시키세요.
- 딥 UV 에서 5 분 동안 조명으로 커버립을 활성화합니다.
- 파라핀 필름이 배치되는 종이 타월을 철저히 가습하여 습한 챔버를 만듭니다. 폴리 L-리신-이식편-폴리에틸렌 글리콜(PLL-g-PEG) 용액(0.1 mg/mL, 10mMM HEPES, pH = 7.4)의 방울(22mm 커버슬립용 30μL)을 추가하고, 그 위에 활성화된 표면이 있는 커버립을 배치한다. 위쪽으로 습한 챔버를 닫고 커버립을 1시간 동안 배양합니다.
- 세척은 PBS에서 2배, 증류수1배는 건조하게 합니다.
- 석영 포토마스크를 증류수로 씻은 다음 에탄올 또는 프로파놀로 씻으시다. 여과된 공기 흐름으로 포토마스크를 말리십시오.
참고 : 석영 포토 마스크는 마이크로 패턴의 형태로 구멍을 포함하는 반사 방지 크롬과 함께 한쪽에 코팅됩니다. 이 프로토콜에는 37 μm의 고리 모양의 미세 패턴을 포함하는 포토마스크가 사용됩니다. 포토마스크에 딥 UV가 비추면 빛은12번홀을 통과할 수 있습니다. - 포토마스크(크롬 코팅 면)를 딥 UV에 5분 간 노출하여 표면을 청소합니다.
- 포토마스크의 크롬 코팅 측에 작은 물 방울(20mm 커버슬립용 10μL)을 추가합니다. 커버슬립을 PLL-g-PEG 처리 측으로 드롭에 놓고 여분의 물을 건조시다. 마스크와 커버립 사이에 기포가 형성되지 않았는지 확인합니다.
참고: 물의 모세관 힘이 커버립을 고정합니다. - 크롬 코팅이 아닌 면을 최대 5분 동안 딥 UV에 포토마스크를 노출합니다(커버립은 아래표면에 부착됨).
참고: 빛은 구멍을 통과하고 포토마스크 아래에 있는 커버립의 PLL-g-PEG 처리 표면을 수정할 수 있습니다. - 여분의 물을 추가하여 포토마스크에서 커버립을 제거합니다.
참고: 커버립은 빠르게 떠서야 합니다. - 오염을 피하기 위해 하습 챔버 (1.2.3 단계에서와 같이) 습한 챔버 (1.2.3 단계에서와 같이) 파라핀 필름에 세포 외 매트릭스 단백질 (섬유 네틴의 50 μg /mL, 물에 희석 형광 피브리노겐의 5 μg /mL)의 용액에서 커버립을 배양한다.
참고: 실험은 4°C에서 PBS에 커버립을 저장하여 이 시점에서 일시 중지할 수 있습니다.
- 마이크로패턴 표면의 세포 시드
- 마이크로패턴 커버립의 크기에 맞는 마그네틱 커버슬립 홀더를 사용하여 커버립을 장착합니다. 획득 당일, 후속 단계 동안 셀에 대한 열 충격을 피하기 위해 커버슬립 홀더를 37°C로 가열합니다.
- 20mM HEPES와 페니실린/연쇄 절제술의 2%로 DMEM/F12 배지를 보충하여 패턴 매체를 준비합니다.
- 커버슬립이 홀더 베이스에 있는 즉시 마이크로패턴 면을 홀더에 놓고 패턴 매체를 추가합니다. 씰을 추가하고 자기 장치로 고정합니다. 커버슬립 홀더를 패턴 매체로 채우고 유리 뚜껑으로 닫습니다.
참고: 빨리, 커버 슬립건조를 허용하지 않도록. 씰이 PLL-g-PEG와 반응하여 세포 스트레스를 초래할 수 있는 에탄올을 유지할 수 있기 때문에 실험 사이에 에탄올로 커버슬립 홀더를 세척하지 마십시오. 커버슬립 홀더를 비눗물로만 씻으시면 됩니다. 더욱이, 조인트는 잔류 제품을 희석하기 위해 1h에 대해 37°C의 패턴 배지에서 배양될 수 있다. - 트립시화(12웰 플레이트의 경우 0.5mL)에 의해 감염된 hTERT-RPE1 세포를 수집하고 10% FBS DMEM/F12 배지의 1mL을 추가합니다.
- 커버슬립 홀더에 0.5 x 106 의 전염성 hTERT-RPE1 셀을 추가하고 다시 닫습니다. 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다.
- 커버슬립 홀더5x를 패턴 매체로 세척하여 부착되지 않은 세포와 잔류 FBS를 제거하여 패턴 매체를 하나의 파이펫으로 추가하고 다른 파이펫으로 매체를 흡입하여 세척 흐름을 만듭니다. 항상 커버슬립 홀더에 소량의 패턴 매체를 보관하여 세포 사멸로 이어질 미세 패턴 커버슬립에 있는 세포의 건조를 피하십시오.
- 전체 세포 확산을 허용하기 위해 3 시간 동안 인큐베이터에서 인큐베이터에 인큐베이션하십시오.
2. 외세포증 데이터 수집
- 외세포증 사건의 이미징
- TIRM 아래에 커버슬립 홀더를 놓습니다. 최고의 이미징 형식으로 설정된 민감한 카메라로 신호를 감지해야 합니다.
참고: 이 실험에서는 100x 렌즈 목표와 512 x 512 픽셀 감지 영역이 있는 EMCCD 카메라가 사용되어 픽셀 크기가 160nm에 상승했습니다. - 완전히 퍼지는 VAMP7-pHluorin을 발현하는 셀을 검색합니다(그림1A).
참고: VAMP7을 발현하는 세포는 녹색 신호를 나타내기 때문에 명확하게 식별할 수 있습니다. - VAMP7-pHluorin 외세포증 이벤트의 시각화가 가능할 때까지 레이저의 각도를 변경합니다. 현미경 소프트웨어를 사용하여 외세포 속도 및 시간 척도(일반적으로 3Hz, 도 1D)와호환되는 주파수에서 5분 획득을 수행합니다.
참고: hTERT-RPE1 세포는 마이크로패턴에 약 0.3Hz의 리소피 분비율을 갖는다. 리소말 외세포증은 1s의 전형적인 지속 기간을 가지는. 그것은 기하급수적 인 부패 뒤에 피크 강도가 특징입니다. 프로브의 확산은 이 때 명백해야한다(도 1B, C). - 각 세포에 대해, 또한 현미경소프트웨어(도 1A)를사용하여 마이크로패턴의 취득을 수행한다.
- TIRM 아래에 커버슬립 홀더를 놓습니다. 최고의 이미징 형식으로 설정된 민감한 카메라로 신호를 감지해야 합니다.
- 외세포좌 의 취득
- ImageJ/FIJI로 획득한 영화를 엽니다. 파일 사용 | 가져오기 | 이미지 시퀀스. 눈으로 외세포증 이벤트를 찾을 수 있습니다. 외세포증 이벤트는 바깥쪽으로 퍼지는 밝은 신호의 출현을 특징으로한다(도 1).
- 포인트 도구를 사용하여 외식 이벤트의 중심을 표시합니다. 분석 사용 | X 및 Y 좌표와 측두구 좌표(슬라이스 번호)를 측정합니다. 영화의 모든 외세포증 이벤트에 대해 이러한 측정을 수행합니다.
- 결과 저장(결과 | 파일 | Save As저장합니다.). 모든 외세포 이벤트에 대해 슬라이스, X 좌표 및 Y 좌표를 포함하는 "결과(cell_name).txt"라는 각 분석된 셀에 대해 텍스트 파일을 준비합니다.
텍스트 파일은 다음과 같이 표시됩니다.
ID X Y 페렛의 직경 반경
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
참고: 모든 쉼표를 포인트로 교체하십시오. - "타원형 도구"를 사용하여 각 셀의 중심과 직경을측정합니다. 완벽한 원을 맞고 (타원형을 사용하지 않음) X 및 Y 좌표와 Feret의 직경을 얻기 위해"측정"을사용합니다. 각 셀의 ID(ID), X 및 Y 좌표, Feret의 지름 및 반지름(직경/2)을 "구형 매개 변수.txt"라는 텍스트 파일에 저장합니다.
텍스트 파일은 다음과 같이 표시됩니다.
ID X Y 페렛의 직경 반경
RPE1_WT_Cell1 167 136 230 115
RPE1_WT_Cell2 164 160 230 115
참고: 모든 쉼표를 포인트로 교체하십시오. - 직선 공구로 마이크로패턴 링(접착 길이)의 두께를 측정하고 셀 ID, 셀 반경(파일에서 "구형 매개 변수.txt") 및 "패턴 매개 변수.txt"라는 텍스트 파일의 접착 길이를 저장합니다. 접착 길이를 셀 반경으로 나누어 정규화된 접착 길이를 계산합니다.
참고: 모든 쉼표를 포인트별로 교체하십시오.
파일은 다음과 같아야 합니다.
ID 셀 반지름 접착 길이 정규화 접착 길이
RPE1_WT_Cell1 115 34 0.295652174
RPE1_WT_Cell2 115 35 0.304347826
3. 단일 셀 공간 분석
- R 패키지 및 설치
참고: 이 분석을 위한 R 패키지는 Spatstat패키지(13)를 활용하여 2차원(2D) 밀도및 리플리의 K 기능을 계산합니다. 코드는 오픈 소스이며 이전에 설명한 텍스트 파일을 사용합니다.- https://www.r-project.org/ 다운로드 및 설치 R (버전 3.5.2이 분석에 사용되었습니다).
- 패키지(및 데모 데이터 집합)를 다운로드 https://github.com/GoudTeam/JoVE-paper합니다.
- "패키지설치"를 사용하여 R 스튜디오에패키지를 설치합니다. "패키지아카이브 파일(.zip; .tar.gz)" 카테고리"설치:"를 선택하고 패키지 파일을 선택합니다. "설치"를누릅니다.
- ""엑소시토시스공간분석")"R 스튜디오에서 이 명령을 작성하고 "Enter"를 눌러 패키지를로드합니다.
- 함수"ESA()"R 스튜디오에서 이 명령을 작성하고 "Enter"를 눌러 패키지를실행합니다.
참고: 사용자 인터페이스가 열립니다. - 데이터 집합(.txt 파일)의 디렉터리와 출력 플롯의 디렉토리를 선택합니다.
참고: 분석의 매개 변수(아래 텍스트 참조)는 사용자 인터페이스를 통해 변경할 수 있습니다. - 이 스크립트는 자동으로 시작되어 분석을 수행합니다. 그것은 숫자 결과를 포함하는 해당 플롯 및 .txt 파일의 .pdf 파일을 제공합니다.
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Representative Results
외세포증 이벤트의 현면 특성은 hTert-RPE1 세포에서 VAMP7-pHluorin10,,11에 의해 시각화된 리소좀으로부터 분석되었다. hTert-RPE1 세포는 마이크로패터닝에 잘 채택되고 이전 마이크로패턴 기반 연구에서 광범위하게 사용된 비변형세포4,,14이다. VAMP7은 리소솜 v-SNARE15로, N-terminus에서 슈퍼 이클립틱 pHluorin과 태그되어 리소좀의 루멘에 위치하고 있습니다. 세포 내부, pHluorin 프로브는 리소좀의 낮은 pHH에 의해 담금질되었다, 그러나 외세포 피루오린 동안 양성자 방출에 의한 pHH가 증가하기 때문에 신호를 방출하기 시작했다. VAMP7-pHluorin은 TIRFM 라이브 세포 이미징에 의해 고리 모양의 마이크로패턴(도1A–B)에의해 모니터링되었다. pHluorin 신호는 엽소 성구 양성자의 빠른 방출을 나타내는 외세포증 동안 피크를 나타내고, 플라즈마 멤브레인(도 1C)에서프로브의 2D 확산을 나타내는 지수 붕괴에 선행하였다. hTERT-RPE1 세포는 0.28Hz(도1D)의평균 외세포증 율을 가진 중요한 리소소말 분비 활성을 제시했다. 그러나, 높은 이질성은 세포간 외세포율(0.15Hz의 표준 편차)에서 관찰되었으며, 이는 리소좀으로부터 분비에 세포 간 가변성이 강하다는 것을 나타낸다.
단일 세포 공간 분석은 리소좀의 외세포증이 무작위인지 여부를 조사하기 위한 것입니다.
KDE에 의한 외세포증의 2D 분포를 시각화할 수 있었으며, 이는 기존에14실시된 자궁내막구획(14)에 대해 수행되어 지역 밀도(그림2B)의차이를 나타낼 수 있었다. 이러한 접근법은 세포의 집단의 평균 분포의 시각화에 해당하지만, 검출된 제한된 수의 이벤트(인구 기반 분석에 의해 수득된 수천 개 대)와 높은 세포 대 세포 가변성으로 인해 단일 세포에서 덜 유익하다. 예를 들어, 이러한 접근법은 외세포증 이벤트의 분포가 완전한 공간 임의성(CSR) 동작(즉, 단일 셀에 대한 관찰된 영역에서 균일한 점 분포에 대응하는)을 따랐는지 여부를 평가하는 것을 허용하지 않았다. 점 패턴은 다음 두 가설이 사실일 때 CSR 동작을 따릅니다: 1) 각 점의 위치는 다른 점의 위치와 독립적입니다. 및 2) 하위 영역에서 점을 찾을 확률은 이 하위 영역의 영역과 전체 영역 사이의 비율에만 의존한다. CSR에서 세 가지 가능한 편차가 있습니다: 1) 클러스터링 (즉, 집계); 2) 분산 (즉, 일정한 거리로 주문); 또는 3) 클러스터링 및 분산의혼합물(도 2C). Ripley의 K 함수는,이전 분석7,8,89 (그림 2D)와같이이 질문에 대답하는 데 사용되었습니다. 리플리의 K 기능은 CSR의 경우 πr²(이벤트로부터의 정규화 거리)에 가깝지만 클러스터링(호흡 분산)의 경우 πr²에 우수(호흡 열등)에 가깝습니다. 리플리의 K 함수에서 πr²를 빼면 이론적인 CSR 곡선이 0이어야 합니다. CSR 케이스의 시뮬레이션은 CSR 케이스(이론적 곡선 주위의 회색 봉투)에 대한 적합성을 평가하기 위해 관찰된 외세포증 이벤트와 동일한 수의 점을 사용하여 수행하였다. 실험 데이터에 적용된 변형된 Ripley의 K 기능은 봉투 외부에 양수 값을 나타내며 클러스터링(그림2D)을나타낸다.
엑소세포증 의 클러스터링이 이전에 보고된 바와 같이 세포 유착에 의한 것인지 를 조사하기위해,우리는 중앙에 있는 전지영역(도 2A,회색의 접착 영역, 백색의 미적세포 센터 영역에서의 데이터에 대해 유사한 분석을 수행하였다). 참고로, 우리는 미적혈 영역에서의 외세포증 사건도 클러스터링된 것으로나타났습니다(도 2E),접착 분자가 플라즈마 멤브레인에서 분비 핫스팟을 유도한 유일한 구조가 아니라는 것을 나타낸다.
Ripley의 K 함수는 P 값을 제공하지 않는 설명 통계이므로 셀룰러 외세포 증시와 CSR 시뮬레이션을 비교하는 통계 테스트가 설정되었습니다. 가장 가까운 이웃 거리 NND(i) 방법이 사용되었습니다. NDD는 포인트 i와 다른 모든 점 사이의 최소 유클리디안 거리로 정의됩니다. 한 셀의 모든 외세포 이벤트에서 평균 NND(i)를 계산하고 몬테카를로시뮬레이션(그림 2F)의수가 많은 CSR과 비교하였다. 도 2F에서 분석된 단일 셀의 평균 NND가 CSR 케이스의 시뮬레이션 분포 평균보다 낮았으며, 이는 평균적으로 가까운 이웃을 나타내고 따라서 클러스터링하는 것으로 나타났습니다. 분산의 경우 평균 NND에 대한 높은 값이 예상되었다(그림2C). 이 비교를 통해 각 셀에 대한 P 값을 계산할 수 있었습니다. P 값은 보다 극단적인 NND(양면 방식으로)를 나타내는 시뮬레이션의 백분율을 나타냅니다. 정확하게 하기 위해, 편견없는 P 값은 (k+1)/(N+1)로 계산되었고 N은 몬테카를로 시뮬레이션의 총 수(10,000)이고, 관찰된측정값(16)보다더 극단적인 이러한 시뮬레이션의 수를 k+1로 계산하였다. 모든 P값의 히스토그램은 전체 세포영역(도 2G)과미적 세포 영역(도2I)에대해 플롯하였다. H00: "엑소시토시스는 CSR 프로세스"가 사실이라면 P 값의 균일한 분포가 예상되었습니다. H0이 false인 경우 낮은 P 값의 피크가 예상되었습니다. P값 히스토그램상 콜모고로프-스미르노프 시험을 수행하여, P값열량은 0.001로 열등하여 두 경우 모두 CSR으로부터 의외로 편차를나타냈다(그림 2G 및 2I). 더욱이, 전체 세포 면적에 대해 0.955의 클러스터링 계수는 1.000개의 미적혈세포 영역에 대해 리소소말 외세포증이 세포 접착에 무관하게 클러스터된 공정임을 나타냈다. 클러스터링 계수는 분산보다 클러스터링 동작에 가까운 셀의 백분율을 나타냅니다. 이 결과는 리플리의 K 기능과 일치했습니다.
군집에서 세포 접착의 역할을 평가하기 위해, 우리는 각 개별 셀에 대한 전체 영역에서 그와 미적 영역에서 평균 NND를 비교(도 2H). 평균 NND는 표면 밀도에 반비례했기 때문에 동종구를 사용하여 미적영역의 평균 NND를 정상화했습니다. 미적 혈증 영역에서 외세포증 이벤트의 상당히 큰 평균 NND는 덜 클러스터링을 나타냈다(도 2H). 따라서, 비나게스 영역에서 리소좀 클러스터로부터분비가 있지만, 세포 접착은 군집을 강화하는 것처럼 보였다.
극좌표를 이용한 외세포증 이벤트의 공간 분석
링 모양의 마이크로패턴의 원형 형상은 이전에 발견된17과같이 해석을 단순화한 공통 극좌표를 사용할 수 있게 해 주어. 따라서 각 외세포증 이벤트는 계수(원점에서의 거리, 여기서 셀의 하부 평면의 중심)와 각도(고정 된 임의 축에 따라)에 의해 설명될 수 있다. 또한, 계수는 셀의 반지름으로 나누어 정규화될 수 있다. 외세포증 의 히스토그램은 대표적인셀(도 3A)에대한 계체에 따라 플롯되었다. 이것은 접착제 / 미적 지역 사이의 국경 주위에 피크를 밝혔다. 세포 간의 큰 가변성도 관찰되었다. 따라서, 우리는 n = 22 세포를 풀어 외세포증 이벤트의 평균 분포를 얻었다. 그러나 각 셀에 동일한 통계 적 가중치를 부여하기 위해 각 셀에서 동일한 수의 이벤트가 무작위로 선택되었습니다. 이 임의 선택은 전체 패턴을 변경하지 않았습니다. 단일 셀의 개별 분포의 연속 평균 분포를 얻기 위해KDE(도 3B)를사용하였다. 그러나 정규화된 계수는 0에서 1 사이이기 때문에 에지 조건을 고려해야 했습니다. 가장자리 옆의 모양을 변경하는 베타 커널이18을사용했습니다. 부트스트랩 전략으로 오류 밴드가 계산되었습니다. 관찰된 평균 분포는 더 높은 계수로 증가했기 때문에 더 높은 계수에서 더 많은 이벤트를 보여 준 가상의 CSR 분포와 비교되었다. 확률 밀도의 일체형은 하나이어야 하기 때문에 CSR 분포는 2r(단위 없이 정규화된 반지름)이었습니다. 많은 수의 CSR Monte Carlo 시뮬레이션(각 5,000개)을 사용하여 이론 곡선 을 중심으로 신뢰도 밴드가 계산되었습니다. 이러한 시뮬레이션에서 계수 분포의 1st 및 99번째 백분위수 플롯되었다. 우리는 세포의 접착제 영역의 시작에 해당하는 0.7r최대에서가상 하나에서 벗어난 외세포 증이벤트의 평균 분포를 발견했다.
우리는 계달의 관찰 된 분포가 이론적 분포와 다른지 여부를 테스트하려고 노력했습니다. 이 경우와 같이 평균 분포는 펙소트 등에서 제안한 대체 방법(예를 들어, 콜모고로프-스미르노프)에 의해 정확하게 테스트될 수 없기 때문이다. 이 방법은 인구 간 변화와 인구 내의 변동 사이의 차이를 측정하여 각 좌표(즉, 변조기 및 각도)에 대한 독립적인 테스트를허용한다(17). 이 시험은 우리의 데이터를 CSR 외세포증 이벤트(관찰된 데이터와 동일한 수의 세포 및 외세포증 이벤트)를 나타내는 시뮬레이션된 데이터와 비교하기 위해 사용되었으며, 변형(p&0.001)에서 통계적으로 유의한 차이를 발견했으며, 이는 윌콕슨-만-휘트니 시험, n=22세포로, 관찰된 평균 외세포 분포가 아니라고 나타낸다. 그러나 두 개의 CSR 시뮬레이션(각각 5,000개의 시뮬레이션)을 비교했을 때 P 값 히스토그램이 균일한 분포를 보이지 는 않았지만 1에 가까운 피크를 보였으며, 이는 이 테스트에 감도가 부족했을 수 있음을 나타냅니다.
KDE 추정은 커널 대역폭의 사소한 선택에 의존하고 에지 효과에 민감하기 때문에 누적 분포 함수도 계산되어 KDE추정(그림 3D)에내재된 문제를 극복합니다. 이 함수는 0과 1 사이에서 정의되며 임의매개 변수 또는 바이어스(예: 에지 바이어스)를 포함하지 않습니다. 오류 및 신뢰도 대역은 계수 분포와 동일한 방식으로 계산되었습니다. 누적 분포 기능은 엑소사이토시스 이벤트가 CSR 분포를 따르지 않았지만 0.7r max 주위의 계수에 과도하게 집중되어 있음을확인했습니다. 따라서 이 분석을 통해 클러스터링이 발생한 셀룰러 영역을 식별할 수 있었습니다. 이 결과가 제기하는 흥미로운 질문은 0.7r최대에서 과농도가 고리 모양의 마이크로 패턴의 접착제 / 미적근 영역의 존재 또는 세포의 주변 / 중앙 분비 영역의 효과 때문인지 여부입니다.
외세포증 의 평균 분포가 CSR 케이스와 접착제 부위에서 벗어나면서 외세포 농도가 어디에서 가장 높은지 궁금했습니다. 접착 영역및 미디하션 영역에서 외세포증의 표면 밀도를 계산하고 비교했습니다. 우리는 쌍분석(도3C)에의해 노나베션 면적보다 접착 영역에서 표면 밀도가 낮았다는 것을 발견했다. 이는 세포 주변에서 외세포증의 강한 감소에 의해 설명될 수 있다(0.85 – 1r최대, 도 3B).
그림 1. hTert-RPE1 세포에서 리소좀으로부터의 외세포증: (A)링 형 마이크로 패턴 (빨간색) 및 접착제 hTert-RPE1 세포는 TIRFM에 의해 이미지 된 VAMP7-pHluorin (녹색)로 전염된다. 화살표는 외세포증 이벤트를 표시합니다. 스케일 바 = 10 μm.(B)외세포증 이벤트의 키모그래프. 화살표는 외세포증 이벤트를 보여줍니다. 스케일 바 = 2 μm, 스케일 바 시간 = 5 s.(C)22 세포로부터 리소소말 외세포증의 정규화된 강도 프로파일. 각 지점은 적어도 1,530 개의 외세포증 이벤트입니다. 데이터는 22세포의 ±SEM.(D)외세포증 속도를 제시한다. 평균 +/- 표준 편차는 빨간색으로 플롯됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 리소소말 외세포증 이벤트의 공간 분석. (A)5분 동안 외세포증 이벤트의 분산 플롯. 각 점은 하나의 엑소시토시스 이벤트를 나타냅니다. 접착제 영역은 회색으로 표시됩니다. (B) A의분산 플롯의 2D 커널 밀도 추정(KDE) 색상은 외세포증 이벤트의 로컬 밀도를 나타냅니다. (C)가능한 포인트 패턴의 회로도 표현. 4개의 경우, 완전한 공간 무작위성(CSR), 클러스터링, 분산 및 혼합이 표시되고, NND(대시 라인)가 플롯되어 평균 NND가 클러스터링에서 감소하고 분산으로 증가하는 방법을 보여줍니다. (D)리플리의 K 기능을 사용하여 하나의 대표 셀의 분석. 빨간색 파선은 CSR 이벤트에 대해 "Ripley의 K 함수 - πr²"와 같으며, 회색 봉투는 엑소시토시스 이벤트(N이벤트 = 81)와 동일한 수의 포인트로 몬테 카를로 시뮬레이션의 예상 적합성을 나타냅니다. 검은 색 단선은 관찰된 외세포증 이벤트(N이벤트 = 81)에 대해 "리플리의 K 함수 – πr²"와 같습니다. 회색 봉투에서 나온 빨간색 곡선에서의 긍정적인 편차는 외세포증 이벤트의 클러스터링을 나타냅니다. 리플리의 K 함수는 최대 값을 1로 정규화했습니다. (E) D와같이 리플리의 K 기능을 사용하여 동일한 세포의 미각 영역분석. 회색 봉투 바깥쪽의 빨간색 곡선에서의 양수 편차는 미각 영역에서 외세포증 이벤트의 클러스터링을 나타냅니다. (F)몬테카를로 시뮬레이션(blue curve)으로부터 얻은 CSR의 KDE와 하나의 대표적인 셀(red line)으로부터의 평균 NND 분포비교. P 값은 관찰된 값보다 더 극단적인 시뮬레이션값의 백분율로 계산되었습니다. (G)N=26 세포에 대한 F에서와 같이 NND 시험에서 얻은 P값 히스토그램. 낮은 P 값의 피크는 null 가설 "엑소시토시스가 CSR을 따른다"는 콜모고로프-스미르노프 시험으로 거부되었음을 의미하며, 이는 리소소말 엑소시토시스가 CSR이 아님을 나타냅니다. (H)외세포증으로부터의 평균 NND의 박스플롯(흰색) 및 총 세포 영역(gray)에서 발생한다. 동일한 셀의 두 데이터 요소가 줄에 결합됩니다. 평균 NND는 미적 영역에서 더 컸다, p < 0.001 쌍 된 윌콕슨 테스트와 (n = 25 세포), 미적 영역에서 훨씬 적은 클러스터링을 나타내는. (I)n =26 세포에 대한 미각 영역에 대한 G와 동일합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 풀화된 리소소말 외세포증 이벤트의 공간 분석: (A)n=161 엑소세포증을 정규화된 계체의 함수로서 5분 동안 한 대표 셀의 외세포증 사건의 히스토그램; 0은 세포 중심과 1 세포 주변을 나타낸다. 셀의 접착제 영역은 회색으로 표시되고 표시된 셀에 대해 0.65-1의 계수에 해당한다. 0.6에서 0.7 사이의 계경 주변의 접착제 영역의 시작 부분에 피크가 있습니다. (B)각 셀에서 56개의 이벤트가 있는 n=22 세포에 대한 정규화된 계달루의 함수로서 외세포증 의 KDE; 0은 세포 중심과 1 세포 주변을 나타낸다. 평균 접착제 영역은 회색으로 표시되며 0.61-1에서 moduli에 평균에 해당합니다. 파선된 파란색 곡선은 CSR의 경우 예상되는 이론적 곡선입니다. 이 이론적 곡선에는 몬테카를로 시뮬레이션을 사용하여 얻은 CSR의 1-99번째 백분위수를 나타내는 봉투가 함께 제공됩니다. 관찰된 데이터에서 KDE 곡선은 빨간색으로 되어 있으며 부트스트랩에 의해 생성된 오류 대역이 함께 제공됩니다. 접착 영역은 회색 +/-SEM.(C)접착 및 미적제거 영역에서 표면 밀도의 쌍분석이다. 외세포 표면 밀도는 정규화된 면적당 및 초당 이벤트 수로 계산되었습니다. 여기서, 쌍학생 t-test(n = 22셀)에서 *p< 0.05. 정상은 이전에 샤피로-윌크 시험에 의해 테스트되었습니다. (D) B(레드 라인)와 몬테카를로 CSR 시뮬레이션(점선 파란색 선)의 데이터의 누적 분포 기능. 봉투는 B에서와같이 생성되었습니다. 빨간색 선은 이론적 CSR에서 약 0.7r최대로 나타내있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
우리는 반지 모양의 마이크로패턴 정규화 된 세포에서 VAMP7-pHluorin의 TIRFM 라이브 셀 이미징에 의해 리소소말 구획에서 외세포증 이벤트를 모니터링하고 외세포증 이벤트의 공간 매개 변수에 대한 엄격한 통계 분석을 수행했습니다. 변형된 리플리의 K 기능과 가장 가까운 이웃 거리에 따른 통계 시험을 통해 리소좀으로부터의 분비가 무작위 공정8,,9가아니라는 것을 확인했습니다. 두 통계 분석 모두 외세포증 이벤트가 클러스터링(그림2D 및 2G)을나타낸다는 것을 설득력 있게 보여주었다. 미동 세포 영역에 유사한 도구를 적용하면 외세포증 이벤트가 미동부위(그림 2E 및 2I)에도클러스터되어 있음을 발견했습니다. 따라서, 이전에 클러스터링6을 허용하도록 보고된 접착 분자는 플라즈마 멤브레인에서 분비 핫스팟을 유도할 수 있는 유일한 구조가 아니다. 그러나, 세포 접착강화 클러스터링: 외세포증 사이의 평균 가장 가까운 이웃 거리는 미근한부위(도 2H)에서상당히 컸다. 일관되게, 커널 밀도 추정 및 누적 분포 기능을 기반으로 한 우리의 분석은 고리 모양의 미세 패턴 세포의 접착제와 미적근 영역 사이의 경계에 위치한 외세포증의 농축 영역을 확인했습니다. 이 지역에 대한 유착 또는 리소종의 특정 표적과 같은 근본적인 클러스터링분자 메커니즘을 결정하기 위해 더 많은 작업이 필요합니다. 흥미롭게도, 우리는 hTERT-RPE1 세포에 걸쳐 외세포 속도에서 높은 이질성 관찰 (0.28 Hz의 평균 외세포 율에 대한 0.15 Hz의 표준 편차, 도 1D),리소솜에서 분비가 높은 세포 간 변이가 있음을 나타냅니다. 따라서 하위 인구 분석은 향후 작업에서 고려해야 합니다. 이러한 변화가 리소말 구획의 다양성, 화물의 차이 또는 외세포기계에 대한 의존도를 반영하는지 조사하는 것은 특히 흥미로할 것입니다.
이러한 결과는 다양한 생물학적 과정의 공간 매개 변수를 조사하기 위해 통계 도구를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더욱이, 마이크로패턴은 다른 마이크로패턴 형상(예를 들어, 고리 모양 대 디스크 모양)의 도움으로 편견없는 방식으로 세포 접착 효과의 연구를 용이하게 한다. 특히, 원형 셰이프의 사용은 극좌표를 사용할 수 있기 때문에 분석을 용이하게 한다. 통계 도구는 일정량의 데이터를 의미 있게 해야 하기 때문에 30개 이상의 이벤트가 있는 셀이 분석에 사용되었습니다. 그러나 30개 이하의 이벤트가 있는 세포가 의미가 있을 가능성이 있습니다. 따라서 30개 이하의 이벤트를 가진 샘플링 셀은 분석에 충분한 이벤트를 획득하여 이것이 사실인지 를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 유사하게, 특히 세포 간 변이가 강한 경우 얼마나 많은 세포를 분석해야 하는지 추정하기가 어렵습니다. 이를 우회하는 한 가지 방법은 각 셀에서 동일한 수의 이벤트를 임의로 선택하여 풀링할 때 각 셀에 동일한 통계 적 가중치를 부여하는 것입니다. 그러나 15개 미만의 세포에 대한 분석은 예방 조치로 수행하는 것이 좋습니다. 풀이 된 세포의 평균 분포는 적합성 검사(예를 들어, 콜모고로프-스미르노프)에 의해 정확하게 테스트할 수 없기 때문에, 우리는 페소 등에서 제안한 시험 통계를 채택하여 인구의 변동의 차이를측정하였다(17). 이 테스트를 통해 평균 분포의 변동에 통계적으로 유의한 차이를 찾을 수 있었지만, P 값 히스토그램이 평평하지 않았기 때문에 이 테스트의 감도가 낮다고 의심합니다(즉, 균일한 분포를 보였음)는 1에 가까운 p 값에 대한 다른 CSR 시뮬레이션을 비교할 때. 따라서 이러한 통계 적 절차를 개선해야 할 수도 있습니다.
분석의 한 가지 단점은 외세포증 이벤트를 수동으로 감지하여 분석 속도를 크게 줄이는 것입니다. 자동 검출의 한계는 종종 분석되는 독특하고 간단한 매개 변수 (예를 들어, 외세포증 이벤트의 강도)에서 강한 이질성 때문입니다. 신경망은 많은 기능을 인식하는 훈련을 받을 수 있기 때문에 자동 탐지에 잠재적으로 강력할 수 있습니다.
여기에 제시된 분석은 다른 구획으로부터의 분비 및 멤브레인 마이크로도메인 또는 항원 프리젠테이션의 분포와 같은 TIRFM에 의해 관찰된 다른 동적 과정에 적용될 수 있다. 유사한 분석은 또한 단백질의 공간 분포를 공부하기 위하여 고정된 세포에 적용될 수 있습니다. 우리는 우리의 일이 세포 생물학에 있는 공간 분배 분석에 증가하는 관심을 향상할 것이라는 점을 희망합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 크게 VAMP7-pHluorin 플라스미드를 제공하는 티에리 갈리 (정신과 및 신경 과학센터, INSERM)를 인정합니다. 통계 분석과 GOUD 연구소 회원에 대한 조언을 구하여 유익한 토론을 해주신 것에 감사드립니다. 저자는 크게 세포 및 조직 이미징 시설 인정 (PICT-IBiSA @Burg, PICT-EM @Burg 및 PICT-IBiSA @Pasteur) 및 니콘 이미징 센터, Institut Curie (파리), 프랑스 국립 연구 인프라 프랑스 -BioImaging의 회원 프랑스 -BioImaging (ANR10-INBS-04). H.L.은 협회부어 라 레체쉬 르 암 (ARC)에 의해 지원되었고 P.M.은 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 No 666003에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 지원받았습니다. 이 작품은 감염 ERA (ANR-14-IFEC-0002-04), 라벡스 셀티스피비오 (ANR-10-LBX-0038) 및 이덱스 파리 과학 에 레트레스 (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL)뿐만 아니라 센터 국립 디 라 리피티크에서 보조금에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chamlide Magnetic Chamber | Chamlide | ||
| DMEM/F12 | Gibco | 21041-025 | |
| Fibrinogen | Molecular Probes, Invitrogen | F35200 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-056 | |
| hTert RPE1 cell line | https://www.atcc.org | ||
| ImageJ | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
| JetPRIME Transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| Penicilin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Photomask | Delta Mask | ||
| PLL-g-PEG solution | Surface Solutions | PLL(20)-g[3.5]- PEG(2) | |
| R Software | https://www.r-project.org/ | n/a | |
| Trypsin (TrypLE Express 1X) | Gibco | 12605-010 | |
| UV ozone oven | Jelight Company Inc | 342-220 | |
| VAMP7-pHFluorin plasmid | n/a | n/a | Paper reference :http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Role+of+HRB+in+clathrin-dependent+endocytosis. J Biol Chem. 2008 Dec 5;283(49):34365-73. doi: 10.1074/jbc.M804587200. Role of HRB in clathrin-dependent endocytosis. Chaineau M, Danglot L, Proux-Gillardeaux V, Galli T. |
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