Summary
Da GPCR'er er attraktive mål for lægemidler, er GPCR ligandscreening således nødvendig for identifikation af blyforbindelser og for undersøgelser af forældreløs eller sjældne børn. Mod disse bestræbelser, beskriver vi PRESTO-Tango, en open source ressource platform, der anvendes til samtidig profilering af forbigående β-arrestin2 rekruttering på ca 300 GPCRs ved hjælp af en TEV-baseret reporter assay.
Abstract
Som den største og mest alsidige gen superfamilie og mæglere af en skala af cellulære signalering veje, G-protein-koblede receptorer (GPCRs) repræsenterer en af de mest lovende mål for den farmaceutiske industri. Ergo, design, implementering og optimering af GPCR ligand screening assays er afgørende, da de repræsenterer fjernbetjening værktøjer til opdagelse af lægemidler og for at manipulere GPCR farmakologi og resultater. Tidligere karakteriserede G-proteinafhængige analyser dette forskningsområde, detekterede ligandinducerede hændelser og kvantificerede genereringen af sekundære budbringere. Men siden fremkomsten af funktionel selektivitet, samt en øget bevidsthed om flere andre G protein-uafhængige veje og de begrænsninger, der er forbundet med G-protein afhængige analyser, der er et større skub i retning af oprettelsen af alternative GPCR ligand screening assays. Mod denne bestræbelse, beskriver vi anvendelsen af en sådan ressource, PRESTO-Tango platform, en luciferase reporter-baseret system, der muliggør parallel og samtidig forhør af den menneskelige GPCR-ome, en bedrift, som tidligere blev overvejet teknisk og økonomisk umuligt. Baseret på en G-protein uafhængig β-arrestin2 rekruttering assay, universalitet β-arrestin2-medieret menneskehandel og signalering på GPCRs gør PRESTO-TANGO en apt værktøj til at studere ca 300 ikke-olfaktoriske menneskelige GPCRs, herunder ca 100 forældreløse receptorer. PRESTO-Tango's følsomhed og robusthed gør det velegnet til primære høj-throughput skærme ved hjælp af sammensatte biblioteker, ansat til at afdække nye GPCR mål for kendte lægemidler eller til at opdage nye ligander til forældreløse receptorer.
Introduction
G-protein-koblede receptorer (GPCR' er) udgør den største og mest forskelligartede familie af transmembranproteiner, der fungerer som kommunikationsgrænseflader mellem en celle og dens miljø1. Alsidigheden af GPCRs er fremhævet af deres evne til at opdage en bred vifte af ligander-fra neurotransmittere til nukleotider, peptider til fotoner, og mange flere-samt deres evne til at regulere mange downstream signalering kaskader involveret i cellulære vækst, migration, differentiering, apoptose, cellefyring, etc.2,3. I betragtning af deres allestedsnærværende og engagement i et væld af fysiologiske processer, denne receptor familie er af allerstørste terapeutiske betydning, fremvist af det faktum, at mere end en tredjedel af de aktuelt tilgængelige ordineret medicin mål GPCRs4. Disse eksisterende behandlingsformer er imidlertid kun rettet mod en lille delmængde af superfamilien (anslået 10 %), og farmakologien for mange GPCR'er er fortsat ubelyst. Desuden findes der mere end 100 GPCR'er som forældreløse receptorer, da de ikke er blevet matchet med en endogen ligand5. Således GPCR ligand screening er kritisk i deorphanization og udvikling af lægemidler, da det baner vejen mod bly opdagelse og optimering, og muligvis til det kliniske forsøg fase.
Metoderne til GPCR-ligandscreening er traditionelt faldet i en af to kategorier, G-proteinafhængige eller G-proteinuafhængige funktionelle analyser6. GPCR-signalering reguleres af heterotrimriske G-proteiner (Gαβγ), som aktiveres ved udveksling af GTP for BNP, der er bundet på Gα-underenheden7. Signaler fra den aktiverede receptor transinduceres af G-proteiner via sekundære budbringere, såsom cAMP, Calcium, DAG og IP3, for at mægle nedstrømssignalering ved downstream-effektorer8. Arten af de funktionelle konsekvenser af G-protein signalering er blevet udnyttet til at skabe celle-baserede analyser, der afspejler receptor aktivering. Disse metoder, der måler proksimale (direkte) eller distale (indirekte) hændelser ved G-proteinsignalering, anvendes oftest til GPCR ligandscreening og har hovedsagelig været anvendt i deorphanization-studier6. Eksempler på analyser, der direkte måler GPCR-medieret G-protein aktivering omfatter [35S]GTPγS bindende analyse, som måler bindingen af en radiomærket og ikke-hydrolyseret GTP-analog med Gα-underenheden, og Förster/bioluminescensresonansenergioverførsel (FRET/BRET) til overvågning af GPCR-Gα- og Gα/Gγ-interaktioner, som har vundet mere trækkraft i årene9,10. Analyser, der overvåger distale hændelser er de mest almindeligt anvendte værktøjer til GPCR profilering; f.eks. måler cAMP- og IP1/3-analyser intracellulær akkumulering af G-proteinafhængige sekundære budbringere, mens[Ca. 2+] flux- og reporteranalyser, der involverer specifikke responselementer, der er impliceret i G-proteinaktivering (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE), undersøger hændelser længere nede i signalkaskade11. Mens de fleste af ovennævnte analyser kan udføres ved et højt gennemløbsniveau, er temmelig følsomme, og prale af visse analyse-specifikke fordele (f.eks forskelsbehandling mellem fuld / delvis agonists, neutrale antagonister og inverse agonister i tilfælde af GTPγS bindende, eller assay funktionalitet på levende celler som [Ca2 +] og IP1 / 3)6, er der desværre ingen eksisterende G-protein afhængige metoder sømmer sig forhør af hele druggable GPCR-ome. Dette skyldes i høj grad den oprindelige kobling af flere G-protein underfamilier til GPCRs, hvilket resulterer i signalering på flere kaskader og den ukendte G-protein kobling på forældreløse GPCRs. For at afbøde dette problem, assays er blevet udviklet til at tvinge promiskuøs G-protein kobling gennem en enkelt fælles signalering read-out, såsom cAMP, og Ca2 +, selv om de fleste af dem er lav-throughput12.
Et vigtigt aspekt af GPCR livscyklus er ophør af G-protein-afhængige signalering, som forekommer i vid udstrækning gennem rekruttering af β-arrestins, som inducerer dissociation af G-protein, og i sidste ende desensibiliserende receptoren, som er målrettet mod clathrin-belagt internalisering13. De mest allestedsnærværende udtrykt isoformer af β-arrestin er de ikke-visuelle β-arrestin1 og β-arrestin2, også betegnet som arrestin-2 og arrestin-3, henholdsvis14. Indtast G-protein uafhængige celle-baserede analyser, som tilføjer en ny dimension til GPCR ligand screening; receptorhandel, etiketfri hele celle og β-arrestin rekrutteringsanalyser er alle bemærkelsesværdige eksempler. GPCR-menneskesmuglingsanalyser anvender fluorophore-mærkede ligander eller saminternaliserede antistoffer rettet mod receptoren15, mens etiketfrie hele celleanalyser anvender biosensorer, der oversætter cellulære ændringer forårsaget af ligandbinding til kvantificerbare output, såsom elektriske eller optiske signaler16. Især kvintessens GPCR- β-arrestin interaktioner mode β-arrestin rekruttering assay som et attraktivt redskab i repertoiret af funktionelle analyser17. Tango systemet, først udviklet af Barnea et al. kun et årti siden, indebærer indførelse af tre eksogene genetiske elementer: en proteinfusion bestående af β-arrestin2 med et tobaksetchvirusprotease (TEVp), en tetracyklintransaktivator (tTA), der er bundet til en GPCR via et tobakset protease kavalergangssted (TEVcs) og indledes med en sekvens fra C-endeinen af V2-vasopressinreceptoren (V2-hale) for at fremme arrestationi rekruttering, og et reporter luciferase-gen, hvis transskription udløses af tTA transskriptionsfaktortranslokation til kernen, som frigøres fra membranforankringen efter β-arrestin2 rekruttering (figur 1)18. Kvantitative aflæsninger af GPCR aktivering og β-arrestin2 rekruttering kan efterfølgende bestemmes ved læsning for luminescens. En bemærkelsesværdig forskel er, at mens receptor handel og label-fri hele celle metoder er relativt lav-throughput, Tango har flere fordele, herunder selektiv udlæsning, der er specifik for målet receptor og følsomhed på grund af signal integration, hvilket gør det til en egnet kandidat til ligand screening på en større skala18.
I lyset af disse strategiske træk, Kroeze et al. udviklet PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression og Screening via Transskriptionelle Output-Tango), en høj-throughput open source-platform, der bruger Tango tilgang til at profilere den druggable GPCR-ome på en parallel og samtidig måde19. Ved at udnytte den "promiskuøse" rekruttering af β-arrestin2 til næsten alle GPCR'er er PRESTO-Tango den første af sin art med hensyn til cellebaserede funktionelle analyser, der muliggør hurtig "første runde" screening af små molekyleforbindelser ved næsten alle ikke-olfaktoriske GPCR'er, herunder forældreløse, uafhængige af G-protein-underfamiliekoblingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Primær screening: cellekultur og pladesåning
- Til fremstilling af pll-plader (poly-L-lysin) skal der dispenseres 20 μL/brønd af en 25 μg/ml stamopløsning af PLL i hvide eller sorte 384-brønds optiske bundplader ved hjælp af en elektronisk multikanalpipette eller en reagensdispenser. Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 0,5-2 timer.
BEMÆRK: Hvis du bruger de sorte 384-brøndsplader, skal baggrundssignalet være lavere sammenlignet med de hvide plader. Sorte plader anbefales for at reducere udblødning af luminescens mellem tilstødende brønde. - For at bevare de belagte plader og vaske den overskydende PLL af skal du fjerne pll'en ved at svippe den over vasken, trykke tørt over en køkkenrulle og tilsætte 40 μL/brønd en fortyndet 1x opløsning af antimykotisk antimykotisk med en elektronisk multikanalpipette eller en reagensdispenser. Pladerne, der er belagt med PLL, opbevares ved 4 °C, indtil de er klar til frø.
- Vedligehold HTLA-celler (venligt leveret af Dr. Richard Axel)-en human embryonale nyrecellelinje (HEK293T) stabilt udtrykke β-arrestin2-TEV og tTA-drevet luciferase-i fuldstændig Dulbecco's modificerede Eagle's medium (DMEM) suppleret med 5% af Fetal Bovine Serum, 5 % af kvægkalveserum, 2,5 μg/ml puromycin, 50 μg/ml hygromycin, 100 U/ml penicillin og 100 μg/ml streptomycin ved 37 °C i en befugtet rugemaskine indeholdende 5% CO2.
- Kultur HTLA celler i 150 mm retter og passere celler to gange om ugen med en fortynding faktor på 1:10, med optimal celle passage nummer 5-25. Sørg for, at et tilstrækkeligt antal 150 mm retter er sammenflydende dagen for 384-brøndpladesåning, afhængigt af skalaen af den primære skærm.
BEMÆRK: Brug af MTV-celler, der er større end passage 25, kan resultere i nedsat levedygtighed, hvilket giver suboptimale resultater. - For at sætte HTLA-celler frø til den primære skærm skylles den flydende 150 mm skål(r) forsigtigt med 1x fosfat-buffered saltvand (PBS), pH 7.4. Afmonter celler med ca. 6 ml 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA, og overfør til et centrifugerør, der indeholder mindst lige stor mængde komplet Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) for at neutralisere trypsinen.
- Spin ned HTLA celler ved 500 x g i 3 min og resuspendercellet ved en massefylde på 0,22 x 106 celler / ml i komplet DMEM, udelade tilsætning af 2,5 μg/ml puromycin og 50 μg/ml hygromycin, da de kan reducere transfektioneffekt.
- Inkuber de nødvendige PLL-belagte plader 384 brønd ved 37 °C for at opvarme dem før såning af celler. Fjern opbevaringsopløsningen af 1x antimykotisk antimykotisk antimykotisk fra den 384-brønd PLL-belagte plade(r) ved at svippe pladen over vasken og tape den over en køkkenrulle til tørre.
- Frøceller i de 384-brønd PLL-belagte plader ved en endelig massefylde på 10.000 celler/brønd ved at dispensere 45 μL af 0,22 x 106 celler/mL HTLA suspension ved hjælp af en elektronisk multikanalpipet. Inkuberpladerne ved 37 °C natten over. Hvis en samme dag transfection foretrækkes, frøceller ved en massefylde på 16.000 celler / godt og udføre transfection 4 h senere.
BEMÆRK: Ved høj transfektionseffektivitet er 50-70% cellesammenløb optimal.
2. Primær screening: FREMSTILLING AF DNA-plader og transfections
- For at forberede 384-brønd DNA kildeplade til transfection som vist i figur 2, distribuere plasmid cDNAs kodning af GPCR-Tango konstruktioner af interesse i en 96-brønd plade, med en anden GPCR / godt. Plasmid-DNA'et skal suspenderes i 0,1 x Tris-EDTA(TE) buffer ved en koncentration på 50 ng/μL.
BEMÆRK: De 96-brønds DNA-plader kan forsegles og opbevares ved -20 °C og genbruges til flere screeningsforsøg. Alle cDNA-kodning GPCR-Tango konstruktioner er tilgængelige kommercielt (se materialetabellen)og er klonet i pcDNA3.1 neomycin plasmid. PRESTO-Tango GPCR Kit består af fire 96-brøndplader, som omfatter 80 GPCRs hver, et par brønde med en tom vektor som negative kontroller, og positive kontrolbrønde, der holder dopaminreceptoren D2 (DRD2), og brønde, der bærer en plasmid kodning af et fluorescerende protein (YFP) for at spore transfekteffektivitet. - Ved hjælp af en multikanalpipette overføres dna-opløsningen manuelt fra 96-brønden til en 384-brønds DNA-kildeplade, der tilføjer 10 μL pr. 384 brønd. For at sikre, at hver betingelse af forsøget er assayed i firdoble, halvdelen af 96-brønd DNA plade (rækker A-D eller E-H) vil dække en fuld 384-godt plade ved at distribuere hver GPCR i to kvadranter (første kvadrant = - sammensatte, anden kvadrant = + sammensatte), således at den samme GPCR vil blive transfunderet i 8 brønde af 384-brønden plade (se figur 2 som en guide).
- Følgende transfektreagenser, der er nødvendige for calciumphosphatudfældningsmetoden, samles som beskrevet af Jordan et al.20: 0,1 x TE-buffer (1 mM Tris-HCl og 0,1 mM EDTA) 2,5 M CaCl2 opløsning; 2x Hepes buffer, pH 7,05 (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4). Desteriliseralle opløsninger ved filtrering og opbevares ved 4 °C. Dagen for transfection, lad reagenserne at nå stuetemperatur før brug.
- 2,5 M CaCl 2-stamopløsningen fortyndes i 0,1 x TE (1:8 fortynding) til en endelig koncentration på 0,313 M CaCl2 og vortex. 40 μL på 0,313 M CaCl2 overføres til dna-kildepladen med 384 brønd, og der blandes ved pipettering op og ned med en håndholdt flerkanalspipette eller en automatiseret bordplade 384-kanals pipettor.
- Der tilsættes 50 μL 2x Hepes-buffer til 384-brønds DNA-kildepladen, blandes igen ved pipettering op og ned og lad stå i 1 min; hver 384-brønd vil have en tilstrækkelig mængde DNA/transfection blanding til transfection af ni 384-brøndplader, afhængigt af antallet af forbindelser, der skal testes. 10 μL af DNA/transfektionsblandingen overføres fra dna-kildepladen med 384 brønd til de såede HTLA-celler, og pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.
3. Primær screening: Cellestimulering
- Fireogtyve timer senere, dekantere transfected celle medier ved forsigtigt at svippe 384-godt plade over vasken og tape det over en køkkenrulle, eller med en aspirator hoved. Tilsæt langsomt 40 μL sultende medier (DMEM suppleret med 1% dialyseret føtal kvægserum (dFBS) og 1x antimykotisk), og man skal passe på at undgå at røre cellerne direkte.
- Pipet 20 μL af interessestoffet ved en 3x-koncentration (den endelige koncentration af lægemidlet i cellepladen vil være 1x) i de skiftende rækker med (+) stimulering og 20 μL køretøjsbuffer for de skiftende rækker uden (-) forbindelse. Cellepladen omstilved 37 °C i 5% CO2 og inkuberes i mindst 16 timer.
4. Primær screening: Luminescenslæsning
- Forbered Glo reagens, modificeret fra Baker og Boyce21: 108 mM Tris-HCl; 42 mM Tris-Base, 75 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM Dithiothrei-tol (DTT), 0,2 mM Coenzym A, 0,14 mg/ml D-Luciferin, 1,1 mM ATP, 0,25% v/v Triton X-100, 2 mM Natriumhydrosulsulfit.
BEMÆRK: Reagensernes stamopløsninger kan laves på forhånd, bortset fra D-Luciferin, som altid er frisk tilsat Glo-reagensen i pulverform. Hvis der anvendes sorte plader, kan mængden af D-Luciferin øges op til 0,25 mg/ml. - Ved 16-24 h efter stimulation, dekantere transfected celle medier ved forsigtigt at svippe 384-godt plade over vasken og tape det over en køkkenrulle. Der tilsættes 20 μL/brønd af Glo-reagens, og pladen inkuberes ved stuetemperatur i 5-20 min. Pladerne aflæses ved hjælp af en mikropladeluminescenstæller med en integrationstid på 1 s/well.
5. Primær screening: Dataanalyse
- Eksporter de gemte filer fra luminescenstælleren som et regneark. resultaterne vil blive registreret i relative luminescensenheder (RLU). Baseret på layoutet af 384-brøndspladen beregnes aktiveringen (foldeændringen) for hver receptor ved hjælp af følgende formel:
BEMÆRK: Her henviser Prøve RLU til værdien af hver af de fire replikate brønde i den stimulerede (+ sammensatte) kvadrant, Mean background RLU er middelværdien af de negative kontroller på pladen, og Mean basal RLU henviser til middelværdien af den ubehandlede kvadrant af samme receptor (- forbindelse). Desuden beregnes standardafvigelsen for de 4 datapunkter for at kontrollere kvaliteten af resultaterne. Det anbefales at udføre en log2 transformation på middelværdien af folden ændringer for at rette op på eventuelle heteroskedasticity; log2-basen er et praktisk valg til at hjælpe med at identificere positive hits. Empirisk fastsætte de positive hit tærskler; det skal bemærkes, at nogle receptorer kan have så lav som 2-gange stigning og op til 40-fold stigning for andre med fuld agonist. - Ud fra resultaterne skal du vælge de GPCR'er, der er potentielle positive hits til sekundær screening.
6. Sekundær screening: Cellesåning og transfections
- Subkultur HTLA-celler i 100 mm skåle ved en samlet celletæthed på 5 x 106 celler i 11 ml komplet medie (4,55 x 105/ml) og inkubere ved 37 °C i 24 timer. Hvis en samme dag transfektion foretrækkes, frøceller ved en massefylde på 7,5 x 106 celler og udføre transfection 4 h senere.
- Forvarm de reagenser, der er nødvendige for calciumphosphatudfældning ved stuetemperatur. Kombiner 450 μL 0,1 x TE buffer med 50 μL på 2,5 M CaCl2 og hurtigt vortex; disse mængder er specifikke for en skål på 100 mm baseret på den mængde vækstmedium, den besidder.
- I et rør tilsættes 500 μL af TE/CaCl 2-opløsningen til 10 μg GPCR cDNA og vortex. Der tilsættes 500 μL 2x Hepes bufferopløsning i røret, ryst kraftigt (ikke vortex) og inkuberes i 1 min.
BEMÆRK: 1 μg plasmid, der koder et fluorescerende protein (f.eks. Fluorescerende protein bruges til at spore transfektionseffektivitet, og denne minimale mængde vil ikke forstyrre analysen. - Umiddelbart efter den korte inkubation dispenseres 1 ml opløsningen dråbevis på cellerne. Hæld forsigtigt pladen frem og tilbage for at fordele bundfaldet jævnt, idet den passepå, at pladen ikke hvirvles, og der indsuges ved 37 °C i 24 timer.
- Den følgende dag, observere transfection effektivitet ved at se på udtrykket af fluorescerende protein under en fluorescerende celle imager; transfections større end 50% dækning er ideelle.
- Inkubere den nødvendige 384-brønd PLL-belagte plade (r) i rugemaskinen ved 37 °C for at varme den før såning celler. Fjern opbevaringsopløsningen af 1x antimykotisk antimykotisk antimykotisk fra den 384-brønd PLL-belagte plade(r) ved at svippe pladen over vasken og tape den over en køkkenrulle til tørre.
- Skyl forsigtigt de transfected celler med Versene opløsning (1X PBS, pH 7,4; 0,53 mM EDTA), og løsrive stil ning ved at tilføje 3 ml 0,05% trypsin/0,53 mM EDTA til skålen. Indholdet overføres til et centrifugerør, der indeholder mindst en tilsvarende mængde komplet DMEM for at neutralisere trypsinen.
- Spin ned cellerne på 500 x g i 3 min og resuspender cellerne ved en massefylde på 0,4 x 106 celler / ml i sultende medier. Frøceller i den eller de 384-brønds PLL-belagte plader ved en sluttæthed på 25.000 celler/brønd ved at dispensere 45 μL af cellesuspensionen ved hjælp af et elektronisk multikanalrør. Pladerne sættes tilbage til 37 °C i mindst 4 timer, så cellerne kan fastgøres korrekt til brøndene, før de fortsætter til stimuleringen.
7. Sekundær screening: Fremstilling af lægemiddelplade til 16-punkts (halvlog) dosiskurve
- I en 96-brøndplade tilsættes 270 μL 1X HBSS lægemiddelbuffer (1x Hanks Balanced Salt Solution [HBSS], 20 mM HEPES pH 7.4, 1x antimycotic, bortset fra den sidste række (række H) af pladen, som vist i figur 4.
BEMÆRK: For peptider, kolloidmolekyler og dårligt vandopløselige forbindelser foreslås tilsætning af 0,1-1% BSA. For at forhindre lægemiddeloxidation kan der også tilsættes op til 0,01 % ascorbinsyre. - Fra lægemiddelbestanden, forberede et lægemiddel løsning (benævnt "Høj" koncentration) ved at beregne en endelig 3x koncentration (endelig koncentration af lægemidlet i cellepladen vil være 1x). For en dosis-respons-kurve med 10 μM som højeste koncentration fremstilles den "høje" koncentration ved 30 μM. Pipet 300 μL af "Høj" koncentration i brønde i række H.
- I et andet rør fremstilles koncentrationen "Lav", som repræsenterer koncentrationen "Høj" divideret med 3,16 (halvlog). Baseret på det foregående eksempel vil "Lav" koncentrationvære 9,49 μM. Pipet 300 μL af "Lav" koncentration i brønde i række H, der støder op til de "høje" brønde.
BEMÆRK: Det samlede antal 96 brønde, der er nødvendige i række H, vil afhænge af antallet af celler og stimuleringsbetingelser. Fire brønde (to "Høj" og to "Lav") vil have rigelig stof løsning til at stimulere en hel 384 godt plade. - Udfør en seriel fortynding ved at pipettere 30 μL lægemiddelopløsning fra "Høje" og "Lave" brønde i række H til den foregående række (række G) og blandes ved manuelt at pipettere op og ned eller som anbefalet ved hjælp af en elektronisk multikanalpipette med funktionen "Pipette and Mix". Gentag dette trin indtil den første og mest fortyndede række (række A), mens der kasseres spidser mellem fortyndinger.
BEMÆRK: Hvis det ønskes, kan de serielle fortyndinger stoppes før række A, der repræsenterer en intern kontrol uden stof, med andre ord et "sandt nul". - Brug figur 4 som reference til at stimulere transfected celler ved pipettering af 20 μL af kolonnen "Lav" fra 96-brøndpladen til række A-O i den tidligere såede 384-brøndplade samt 20 μL af de "høje" kolonnefortyndinger til brøndene B-P. Inkuberpladen ved 37 °C i mindst 16 timer.
8. Sekundær screening: Luminescenslæsning og dataanalyse
- Ved 16-24 h efter stimulation, dekantere transfected celle medier ved forsigtigt at svippe 384-godt plade over vasken og tape det over en køkkenrulle. Der tilsættes 20 μL/brønd af Glo-reagens, og pladen inkuberes ved stuetemperatur i 5-20 min. Pladerne aflæses ved hjælp af en mikropladeluminescenstæller med en integrationstid på 1 s/well.
- Eksporter de gemte filer fra luminescenstælleren som et regneark. resultaterne vil blive registreret i relative luminescensenheder (RLU). Overfør dataene for 384-brøndspladen til en statistiksoftware for at analysere resultaterne ved hjælp af den indbyggede XY-analyse for ikke-lineær regressionskurvepasform. Vælg den indbyggede 3-parameter dosis-respons stimulation funktion "Log (agonist) vs respons (tre parametre)",
BEMÆRK: Her top og bund er plateauer i enhederne i Y-aksen, henholdsvis den maksimale respons og basal niveau, EC50 er koncentrationen af agonist, der genererer 50% respons mellem top og bund, og X refererer til log koncentration af agonist. Denne model forudsætter, at dosis-respons kurven har en standard Hill hældning på 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af PRESTO-Tango protokollen præsenteret heri, en kronofin granulat (CG) ekstrakt blev screenet mod 168 ikke-olfaktoriske GPCR mål, med de fleste er forældreløse receptorer. Profilering af nævnte ekstrakt blev udført ved at undersøge β-arrestin2 mobilisering på de valgte receptorer, baseret på princippet designet af Barnea et al.18 (Figur 1). Plasmid cDNA af GPCRs af interesse blev taget fra PRESTO-Tango GPCR Kit og samlet i to 96 godt plader i det ønskede layout. I alt blev fire 384-brøndsplader, der var seedet med HTLA-celler, transfected, da hver halvdel af de 96-brønds DNA-plader blev lavet til en fuld 384-brøndplade, hvilket resulterede i, at hver receptor blev transfected i to kvadranter (otte 384 brønde i alt). En af de to kvadranter blev stimuleret med CG ekstrakt; sagt anderledes, skiftevis rækker C-D, G-H, K-L og O-P repræsenterede (+) stimulering (Figur 2). Ud af de 168 GPCRs, der blev afhørt i den primære screening, var kun to receptorer kandidater som potentielle aktive mål, specielt dopaminreceptoren D3 (DRD3) og opsin 5 (OPN5). DRD3 medførte en betydelig log2foldændring på 4,70, mens OPN5 gav et lidt lavere respons på 2,39, som begge opfyldte tærsklen for afskæring af log2-foldændring >2. Til sammenligning blev den positive kontrol for den primære skærm DRD2 stimuleret med quinpirole, en selektiv agonist af denne receptor, og produceret en log2 fold ændring på 4,58 (Figur 3). For at gengive disse signalvinduer og eliminere muligheden for falsk-positive hits, en sekundær skærm blev udført med de førnævnte receptorer. Ud over at teste CG ekstrakt, da DRD3 er en ikke-forældreløs receptor, en anden betingelse blev udarbejdet som en positiv kontrol, specielt stimulation med quinpirole, en af dens selektive agonister. På den anden side, OPN5 er en forældreløs receptor og som sådan, ingen reference agonist kan testes sammen med CG ekstrakt som en positiv kontrol; kun buffer blev testet som en negativ kontrol. Yderligere farmakologisk karakterisering af disse to GPCRs blev udført ved at forberede 16-punkts dosiskurver fra 10-5 M til 10-12,5 M. Specifikt blev CG-ekstraktet og quinpirolssvareopløsningerne ved 10 mM fortyndet til 30 μM og 9,49 μM, de tilsvarende "Høje" og "lave" koncentrationer i nederste række (række H) af 96-brøndens lægemiddelplade; disse formuleringer bliver 10-5 M og 10-5,5 M, når 20 μL er dispenseret til de transmfeceller i 40 μL udsultet medium, i alt 60 μL inden for hver 384-brønd. Som tidligere beskrevet blev der udført serielle fortyndinger, således at de mest fortyndede lægemiddelformationer for 10-12 M og 10-12,5 M er i den øverste række (række A) (Figur 4). Dosis-respons kurver fra den sekundære screening blev oprettet ved hjælp af GraphPad Prism at evaluere ligand potens og effektivitet. I forhold til quinpirol producerede CG-ekstrakten lignende signalvinduer og EC50-værdier, hvilket bekræfter dets gyldighed som et aktivt hit på DRD3. Der blev imidlertid fremstillet en flad dosiskurve svarende til den negative kontrol for OPN5, som udelukkede den som et muligt mål for CG-ekstraktet (figur 5).
Figur 1: Modulopbygget design af TANGO konstruktioner (A) og generel ordning for β-arrestin (Tango) rekruttering assay (B). (A) GPCR Tango konstruktioner består af forskellige modulelementer i følgende rækkefølge: et HA-signal/FLAG-mærke, GPCR CDS, en Vasopressin receptor 2 C-terminal hale, TEV protease spaltningsite og en tTA transskriptionsfaktor. (B) Princippet om Tango assay indebærer forbigående transfecting GPCR Tango plasmider i HTLA celler, HEK293T celler stabilt udtrykke en β-arrestin2-TEV protease fusion protein og en luciferase reporter gen, hvis udtryk aktiveres af tTA. Aktivering af GPCR vil i sidste ende resultere i mobilisering af β-arrestin2-TEV til receptoren, hvilket bringer protease i nærheden af sin spaltning site. Som et resultat, er tTA kløvet fra GPCR hale, frigøre transskription faktor til at omflytte ind i kernen og aktivere luciferase udtryk. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Layout af 96-brønd cDNA plade og 384-brønd celleplade til transfektion og stimulation i PRESTO-TANGO primær screening. Afbilde udarbejdelsen af en 384-brønd cDNA kildeplade til transfection, GPCR Tango konstruktioner er først overført fra den ene halvdel af en 96-godt plade i en fuld 384-brønd plade, med hver receptor transfemected i octuplicate. I denne indstilling, stimulering af celler med (+) og uden (-) stoffet (r) af interesse vil forekomme i firdoble for hver enkelt receptor. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Grafiske gengivelser af hitidentifikation fra PRESTO-Tango primær screening. Som proof-of-concept blev den biologiske aktivitet af et kronofingranuleekstrakt (CG) på GPCRome analyseret. HTLA celler blev transfected i 384 godt plader med 168 GPCR Tango konstruktioner, og enten stimuleret med CG ekstrakt (+ sammensatte) eller med køretøjetbuffer (- sammensatte). pcDNA3.1 blev anvendt som negativ kontrol, og DRD2-receptorstimuleret med quinpirole blev anvendt som en positiv kontrol. Signalvinduerne (A) og log2 fold change (B) i receptoraktiveringen blev beregnet mellem brøndene i fravær eller tilstedeværelse af CG-ekstrakt. Alle fejllinjer repræsenterer SD (n = fire målinger). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Layout af 96-brønd narkotika plade forberedelse til stimulering i sekundær screening. Afbilde udarbejdelsen af en 96-brønd stof plade til celle stimulation, serielle fortyndinger for en 16-punkts dosis kurve interval starter ved 10-5 M (endelig koncentration) i række H, med halv-log intervaller mellem hvert punkt indtil 10-12,5 M i række A. "Høj" og "Lav" narkotika kolonner er vant til at stimulere vekslende rækker af den seedede 384-brønd plade. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Dosiskurveresponser for sammensat profilering og demonstration af β-arrestin2-rekruttering til GPCR'er i sekundær screening. HTLA-celler blev transientt transiently transfemeret med receptorer DRD3 (A) og OPN5 (B). Begge transfected betingelser blev stimuleret med en CG ekstrakt i halv-log intervaller, samt DRD3 specifikke agonist quinpirole som en positiv kontrol, og køretøjet buffer for OPN5 som en negativ kontrol. Alle fejllinjer repræsenterer SD (n = tre målinger). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De konformationsdynamiske GPCR'er er kraftcentre for signaltransduktion. De fysiokemiske egenskaber af de bindende lommer af disse heptahelical receptorer, samt deres fysiologiske relevans understreger behovet for GPCR ligand screening værktøjer. Som præsenteret ovenfor, presto-Tango assay er hurtig, følsom og brugervenlig, udlån sig til udvikling af narkotika. Ikke alene denne analyse foranstaltning agonist-induceret aktivering, men det kan også bruges til at kvantificere aktiviteten af antagonister og allosteric modulatorer19. I lyset af funktionel selektivitet, et begreb, der tyder på, at forskellige lægemiddelstrukturer kan fremkalde forskellige receptor signalering kaskader på en enkelt receptor, sammenligne aktivering af G-protein vej ved hjælp af G-protein afhængige analyser med β-arrestin rekruttering ved hjælp af PRESTO-Tango kunne give signaler til designe bly forbindelser med reducerede negative bivirkninger. Navnlig hjælper dens uafhængighed af at detektere G-proteinkobling med til at identificere koblingspartnere for forældreløse GPCR'er, som ikke tidligere ville være blevet opdaget af G-proteinafhængige analyser.
For at sikre konsistens og robusthed af PRESTO-Tango skærme, skal der udvises forsigtighed i alle trin i protokollen, som forstyrrelser indført vil blive forstørret på grund af karakteren af denne platform. Der er naturligvis generelle foranstaltninger, der er fælles for alle HTS-skærme, som bør tages i betragtning, såsom anvendelse af reagenser af samme parti/formulering for at sikre identisk stabilitet og biologisk aktivitet overalt, samt at holde forholdene på HTS-systemet ensartede, såsom cellesåningstæthed og lægemiddelinkubationstid. Det miniaturiserede format PRESTO-Tango kræver opmærksomhed på et par kritiske punkter: variation i cellesåningtæthed og deres homogene fordeling (sammenklumpning versus enkeltcellesuspension) mellem brønde, lav transfektionseffektivitet og dårlig sammensatte stimulering og levering vil forhindre dag-til-dag og plade-til-plade reproducerbarhed. Med henblik herpå skal HTLA-cellesuspensionen omsat homogeniseres opløsningen før såning og sikre en 50-70% cellesammenløb før transfektion. Køretøjet til levering af forbindelserne bør verificeres, idet dimethylsulfoxid er den mest almindelige bærer. Typisk er den højeste koncentration af vores dosiskurver 10 μM, men dette kan ændre sig afhængigt af stoffets art og styrke; det er vigtigt at teste forskellige koncentrationer for at udlede cellulær tolerance og toksicitet.
Da nogle GPCR'er har en høj konstituerende aktivitet, er et problem, der kan opstå under screeningen, et reduceret dynamisk område og et baggrundssignal, der er højere end forventet. Dette kan mindskes noget ved at sikre, at serumsult udføres med DMEM medium suppleret med 1% dFBS. Det bør tages i betragtning, at hvis luminescensoutputtet er højt nok, kan der stadig være gennemblødning i tilstødende brønde, hvilket kan resultere i fejlagtigt beregnede foldændringer. Målbart eller lave signaler (forudsat at der forventes et svar) kan forklares på en række måder, nemlig dårligt udtryk for GPCR(er) i HTLA-celler, den biologiske aktivitet af forbindelsen er tabt gør det ineffektiv, eller receptor (r) pågældende ikke i sig selv rekruttere β-arrestin2. Henholdsvis vurdering af mængden og kvaliteten af transfected plasmid receptor DNA, test andre præparater / masser af den ineffektive pågældende forbindelse, og udførelse af orthologous protein-protein interaktion teknikker såsom BRET / FRET eller co-immunoudfældning er nogle foreslåede løsninger på dette problem. Desuden kan receptorekspression også forbedres ved at subcloere Tango receptor(er) af interesse i lentivirale vektorer og transducing HTLA celler, generere en HTLA-GPCR stabil cellelinje. Et skift i en agonists forventede styrke under sekundær screening kan indebære, at den lægemiddelstimuleringstid og/eller koncentration af forbindelse, der er nødvendig for at stimulere en respons, er utilstrækkelig, eller at lægemiddelpladeseriefortyndingerne var forkert forberedt. Brug af en elektronisk multikanal pipette eller en automatiseret pipettor system uden at ændre tips i mellem, når du opretter narkotika serielle fortyndinger kunne være et problem, når du arbejder med klæbrige forbindelser.
Bemærkelsesværdige forskelle mellem den oprindelige Tango assay udviklet af Barnea et al.18 og PRESTO-Tango platform omfatter udformningen af receptoren i et modulært format, der består af codon-optimerede sekvenser, som forbedrer receptor udtryk i pattedyr celler, epitop tags til at validere nævnte udtryk, og begrænsning steder, der flankerer GPCRs, V2 hale og TEVcs-tTA, gør det muligt for excision af dele og subcloning. Vigtigst er det, PRESTO-Tango overgår Tango assay med hensyn til screening magt og eksperimentelt design. Firdoble prøvetest af ca. 300 GPCR'er udføres kun i 8 384 brøndplader, mens der tages højde for negative baggrundskontroller og positive kontroller for at overvåge transfektionseffektiviteten. Mens PRESTO-Tango er egnet til screening af GPCR-ome med kun én forbindelse af interesse, forhør med flere ligander kan også udføres, om end med øgede omkostninger og brug af ressourcer, såsom med pooled eller arrayed små molekyle sammensatte biblioteker eller biologiske prøver, som består af blandinger af forskellige kemiske enheder. Indrømmet, dette spørgsmål kan afbødes ved at reducere antallet af forbindelser til at afhøre ved at udføre kemiske lighed og mangfoldighed analyser af de sammensatte biblioteker pågældende. Mens PRESTO-Tango platformen er mere anvendelig til primære screeningsformål, kan sekundær profilering udføres i mindre målestok, i mellem- eller lavgennemløbsformater, for at bekræfte de funktionelle konsekvenser af ligandstimulation. Men som med alle andre GPCR-analyser må det erkendes, at der ikke er nogen passende positiv kontrol for forældreløse receptorer under sekundær screening med Tango-analysen. Ikke desto mindre kan potentielle positive hits identificeres, hvis outputdataene kan monteres på en sigmoidal dosis-respons kurve, med et beregnet signalvindue og EC50-værdi. Det er også vigtigt at bemærke, at mekanismen for ligand aktivitet, det være sig for forældreløse eller ikke-forældreløse receptorer, kan ikke belyses uden at køre parallelle assays.
Med alle komponenter i PRESTO-Tango allerede optimeret, herunder HTLA cellelinje og GPCR Tango konstruktioner, er lidt plads til ændring kræves bortset fra valg af sammensatte formulering (r), der skal anvendes til lægemiddelstimulation. Hvis det ønskes, en HTLA celle linje stabilt udtrykke en receptor kan let genereres ved kloning sagde GPCR-Tango receptor inden for den anbefalede pIRESbleo3 vektor (Clonetech), og vælge kloner ved hjælp af zeocin. Med hensyn til swap fra pcDNA3.1 til pIRESbleo3, skal du blot fordøje GPCR Tango konstruktion med NotI og XbaI og indsætte i destinationen vektor på begrænsning steder NotI og NheI. Uanset, er der muligheder for at tilpasse og optimere denne teknologi. En af grundpillerne i denne teknologi er HTLA celler, en HEK293T celle linje stabilt udtrykke en β-arrestin2-TEV fusion gen og en tTA-afhængige luciferase reporter, nådigt leveret fra laboratoriet af Richard Axel. Mens en afgørende del af PRESTO-Tango, er der i øjeblikket ingen andre alternativer med hensyn til cellelinje oprindelse, eller de gener, de udtrykker. Desuden kan fremtidige manipuleret cellelinjer genereres til at udtrykke andre TEV fusion gener til at spore andre proteiner udover β-arrestin2, specielt dem, der tidligere har vist sig at interagere eller fundet i bopæl til GPCRs, såsom 14-3-322, SAP9723, og β-arrestin1, som er den mere udbredte isoform af ikke-visuelle anholdelser i hvirveldyr24. Dette kan opnås ved at bruge de forældrelige HTL-celler, der udelukkende indeholdt luciferase reporter kontrolleret af tetO7 promotor. En begrænsning til PRESTO-Tango er ikke-specifik aktivering af reporter promotor. Baseret på et tetracyklin-afhængigt reguleringssystem (tet system), tetracyclin-responsive element (TRE) styrer udtryk af downstream luciferase reporter. Tidligere undersøgelser har imidlertid vist et "utæt" udtryk for luciferase på grund af endogene transskriptionsfaktorer25,26. Som et resultat, nogle forbindelser kunne aktivere reporter uafhængigt af β-arrestin2 rekruttering eller GPCR aktivering, øge antallet af falske positiver. Et andet spørgsmål, der opstår, også fælles for andre HTS metoder, er "hyppige hitters", promiskuøs forbindelser, der stimulerer betydelige reaktioner i flere mål27. Ikke desto mindre, PRESTO-Tango's parallelle screening set-up letter identifikation af disse artefakter, som kan testes yderligere for at bekræfte deres virkning på luciferase aktivitet. Alt i alt har PRESTO-Tango givet et solidt grundlag for studiet af arrestin rekruttering til GPCRs, og i den større ordning af narkotika opdagelse, som en utile GPCR ligand screening og deorphanization værktøj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Authours erklærer ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af canadian Institutes of Health Research (CIHR grant #MOP142219).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2x3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
References
- Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J.
- Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. G-protein-coupled receptors at a glance. Journal of cell science. 116, Pt 24 4867-4869 (2003).
- Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Ngo, T., et al. Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches. British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
- Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets. Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).
- Wettschureck, N., Offermanns, S. Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions. Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).
- Denis, C., Saulière, A., Galandrin, S., Sénard, J. -M., Galés, C. Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands. Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).
- Yin, H., et al. Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay. The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).
- Cheng, Z., et al. Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways. Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).
- Roth, B. L., Kroeze, W. K. Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily. The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).
- Jean-Charles, P. -Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. G Protein-Coupled Receptor Signaling Through β-Arrestin-Dependent Mechanisms. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The β-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).
- Böhme, I., Beck-Sickinger, A. G.
- Fang, Y.
- Wang, T., et al. Measurement of β-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).
- Kroeze, W. K., et al. PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).
- Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).
- Walther, C., Ferguson, S. S. G. Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling. Molecular Endocrinology. 29 (6), Baltimore, Md. 814-830 (2015).
- Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation. Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).
- Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE. Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).
- Blau, H. M., Rossi, F. M. Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).
- Roche, O., et al. Development of a Virtual Screening Method for Identification of "Frequent Hitters" in Compound Libraries. Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).
