Parallel forhør af β-Arrestin2 Rekruttering til Ligand Screening på en GPCR-wide Scale ved hjælp af PRESTO-Tango Assay
Summary
Da GPCR’er er attraktive mål for lægemidler, er GPCR ligandscreening således nødvendig for identifikation af blyforbindelser og for undersøgelser af forældreløs eller sjældne børn. Mod disse bestræbelser, beskriver vi PRESTO-Tango, en open source ressource platform, der anvendes til samtidig profilering af forbigående β-arrestin2 rekruttering på ca 300 GPCRs ved hjælp af en TEV-baseret reporter assay.
Abstract
Som den største og mest alsidige gen superfamilie og mæglere af en skala af cellulære signalering veje, G-protein-koblede receptorer (GPCRs) repræsenterer en af de mest lovende mål for den farmaceutiske industri. Ergo, design, implementering og optimering af GPCR ligand screening assays er afgørende, da de repræsenterer fjernbetjening værktøjer til opdagelse af lægemidler og for at manipulere GPCR farmakologi og resultater. Tidligere karakteriserede G-proteinafhængige analyser dette forskningsområde, detekterede ligandinducerede hændelser og kvantificerede genereringen af sekundære budbringere. Men siden fremkomsten af funktionel selektivitet, samt en øget bevidsthed om flere andre G protein-uafhængige veje og de begrænsninger, der er forbundet med G-protein afhængige analyser, der er et større skub i retning af oprettelsen af alternative GPCR ligand screening assays. Mod denne bestræbelse, beskriver vi anvendelsen af en sådan ressource, PRESTO-Tango platform, en luciferase reporter-baseret system, der muliggør parallel og samtidig forhør af den menneskelige GPCR-ome, en bedrift, som tidligere blev overvejet teknisk og økonomisk umuligt. Baseret på en G-protein uafhængig β-arrestin2 rekruttering assay, universalitet β-arrestin2-medieret menneskehandel og signalering på GPCRs gør PRESTO-TANGO en apt værktøj til at studere ca 300 ikke-olfaktoriske menneskelige GPCRs, herunder ca 100 forældreløse receptorer. PRESTO-Tango’s følsomhed og robusthed gør det velegnet til primære høj-throughput skærme ved hjælp af sammensatte biblioteker, ansat til at afdække nye GPCR mål for kendte lægemidler eller til at opdage nye ligander til forældreløse receptorer.
Introduction
G-protein-koblede receptorer (GPCR’ er) udgør den største og mest forskelligartede familie af transmembranproteiner, der fungerer som kommunikationsgrænseflader mellem en celle og dens miljø1. Alsidigheden af GPCRs er fremhævet af deres evne til at opdage en bred vifte af ligander-fra neurotransmittere til nukleotider, peptider til fotoner, og mange flere-samt deres evne til at regulere mange downstream signalering kaskader involveret i cellulære vækst, migration, differentiering, apoptose, cellefyring, etc.2,3. I betragtning af deres allestedsnærværende og engagement i et væld af fysiologiske processer, denne receptor familie er af allerstørste terapeutiske betydning, fremvist af det faktum, at mere end en tredjedel af de aktuelt tilgængelige ordineret medicin mål GPCRs4. Disse eksisterende behandlingsformer er imidlertid kun rettet mod en lille delmængde af superfamilien (anslået 10 %), og farmakologien for mange GPCR’er er fortsat ubelyst. Desuden findes der mere end 100 GPCR’er som forældreløse receptorer, da de ikke er blevet matchet med en endogen ligand5. Således GPCR ligand screening er kritisk i deorphanization og udvikling af lægemidler, da det baner vejen mod bly opdagelse og optimering, og muligvis til det kliniske forsøg fase.
Metoderne til GPCR-ligandscreening er traditionelt faldet i en af to kategorier, G-proteinafhængige eller G-proteinuafhængige funktionelle analyser6. GPCR-signalering reguleres af heterotrimriske G-proteiner (Gαβγ), som aktiveres ved udveksling af GTP for BNP, der er bundet på Gα-underenheden7. Signaler fra den aktiverede receptor transinduceres af G-proteiner via sekundære budbringere, såsom cAMP, Calcium, DAG og IP3, for at mægle nedstrømssignalering ved downstream-effektorer8. Arten af de funktionelle konsekvenser af G-protein signalering er blevet udnyttet til at skabe celle-baserede analyser, der afspejler receptor aktivering. Disse metoder, der måler proksimale (direkte) eller distale (indirekte) hændelser ved G-proteinsignalering, anvendes oftest til GPCR ligandscreening og har hovedsagelig været anvendt i deorphanization-studier6. Eksempler på analyser, der direkte måler GPCR-medieret G-protein aktivering omfatter [35S]GTPγS bindende analyse, som måler bindingen af en radiomærket og ikke-hydrolyseret GTP-analog med Gα-underenheden, og Förster/bioluminescensresonansenergioverførsel (FRET/BRET) til overvågning af GPCR-Gα- og Gα/Gγ-interaktioner, som har vundet mere trækkraft i årene9,10. Analyser, der overvåger distale hændelser er de mest almindeligt anvendte værktøjer til GPCR profilering; f.eks. måler cAMP- og IP1/3-analyser intracellulær akkumulering af G-proteinafhængige sekundære budbringere, mens[Ca. 2+] flux- og reporteranalyser, der involverer specifikke responselementer, der er impliceret i G-proteinaktivering (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE), undersøger hændelser længere nede i signalkaskade11. Mens de fleste af ovennævnte analyser kan udføres ved et højt gennemløbsniveau, er temmelig følsomme, og prale af visse analyse-specifikke fordele (f.eks forskelsbehandling mellem fuld / delvis agonists, neutrale antagonister og inverse agonister i tilfælde af GTPγS bindende, eller assay funktionalitet på levende celler som [Ca2 +] og IP1 / 3)6, er der desværre ingen eksisterende G-protein afhængige metoder sømmer sig forhør af hele druggable GPCR-ome. Dette skyldes i høj grad den oprindelige kobling af flere G-protein underfamilier til GPCRs, hvilket resulterer i signalering på flere kaskader og den ukendte G-protein kobling på forældreløse GPCRs. For at afbøde dette problem, assays er blevet udviklet til at tvinge promiskuøs G-protein kobling gennem en enkelt fælles signalering read-out, såsom cAMP, og Ca2 +, selv om de fleste af dem er lav-throughput12.
Et vigtigt aspekt af GPCR livscyklus er ophør af G-protein-afhængige signalering, som forekommer i vid udstrækning gennem rekruttering af β-arrestins, som inducerer dissociation af G-protein, og i sidste ende desensibiliserende receptoren, som er målrettet mod clathrin-belagt internalisering13. De mest allestedsnærværende udtrykt isoformer af β-arrestin er de ikke-visuelle β-arrestin1 og β-arrestin2, også betegnet som arrestin-2 og arrestin-3, henholdsvis14. Indtast G-protein uafhængige celle-baserede analyser, som tilføjer en ny dimension til GPCR ligand screening; receptorhandel, etiketfri hele celle og β-arrestin rekrutteringsanalyser er alle bemærkelsesværdige eksempler. GPCR-menneskesmuglingsanalyser anvender fluorophore-mærkede ligander eller saminternaliserede antistoffer rettet mod receptoren15, mens etiketfrie hele celleanalyser anvender biosensorer, der oversætter cellulære ændringer forårsaget af ligandbinding til kvantificerbare output, såsom elektriske eller optiske signaler16. Især kvintessens GPCR- β-arrestin interaktioner mode β-arrestin rekruttering assay som et attraktivt redskab i repertoiret af funktionelle analyser17. Tango systemet, først udviklet af Barnea et al. kun et årti siden, indebærer indførelse af tre eksogene genetiske elementer: en proteinfusion bestående af β-arrestin2 med et tobaksetchvirusprotease (TEVp), en tetracyklintransaktivator (tTA), der er bundet til en GPCR via et tobakset protease kavalergangssted (TEVcs) og indledes med en sekvens fra C-endeinen af V2-vasopressinreceptoren (V2-hale) for at fremme arrestationi rekruttering, og et reporter luciferase-gen, hvis transskription udløses af tTA transskriptionsfaktortranslokation til kernen, som frigøres fra membranforankringen efter β-arrestin2 rekruttering (figur 1)18. Kvantitative aflæsninger af GPCR aktivering og β-arrestin2 rekruttering kan efterfølgende bestemmes ved læsning for luminescens. En bemærkelsesværdig forskel er, at mens receptor handel og label-fri hele celle metoder er relativt lav-throughput, Tango har flere fordele, herunder selektiv udlæsning, der er specifik for målet receptor og følsomhed på grund af signal integration, hvilket gør det til en egnet kandidat til ligand screening på en større skala18.
I lyset af disse strategiske træk, Kroeze et al. udviklet PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression og Screening via Transskriptionelle Output-Tango), en høj-throughput open source-platform, der bruger Tango tilgang til at profilere den druggable GPCR-ome på en parallel og samtidig måde19. Ved at udnytte den “promiskuøse” rekruttering af β-arrestin2 til næsten alle GPCR’er er PRESTO-Tango den første af sin art med hensyn til cellebaserede funktionelle analyser, der muliggør hurtig “første runde” screening af små molekyleforbindelser ved næsten alle ikke-olfaktoriske GPCR’er, herunder forældreløse, uafhængige af G-protein-underfamiliekoblingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De konformationsdynamiske GPCR’er er kraftcentre for signaltransduktion. De fysiokemiske egenskaber af de bindende lommer af disse heptahelical receptorer, samt deres fysiologiske relevans understreger behovet for GPCR ligand screening værktøjer. Som præsenteret ovenfor, presto-Tango assay er hurtig, følsom og brugervenlig, udlån sig til udvikling af narkotika. Ikke alene denne analyse foranstaltning agonist-induceret aktivering, men det kan også bruges til at kvantificere aktiviteten af antagonister og allosteric …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af canadian Institutes of Health Research (CIHR grant #MOP142219).
Materials
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2×3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
References
- Liapakis, G., et al. The G-protein coupled receptor family: actors with many faces. Current pharmaceutical design. 18 (2), 175-185 (2012).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3 (9), 639-650 (2002).
- Kroeze, W. K., Sheffler, D. J., Roth, B. L. G-protein-coupled receptors at a glance. Journal of cell science. 116, 4867-4869 (2003).
- Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (8), 579-590 (2011).
- Ngo, T., et al. Identifying ligands at orphan GPCRs: current status using structure-based approaches. British journal of pharmacology. 173 (20), 2934-2951 (2016).
- Zhang, R., Xie, X. Tools for GPCR drug discovery. Acta pharmacologica Sinica. 33 (3), 372-384 (2012).
- Kimple, A. J., Bosch, D. E., Giguere, P. M., Siderovski, D. P. Regulators of G-Protein Signaling and Their G Substrates: Promises and Challenges in Their Use as Drug Discovery Targets. Pharmacological Reviews. 63 (3), 728-749 (2011).
- Wettschureck, N., Offermanns, S. Mammalian G Proteins and Their Cell Type Specific Functions. Physiological Reviews. 85 (4), 1159-1204 (2005).
- Denis, C., Saulière, A., Galandrin, S., Sénard, J. -. M., Galés, C. Probing heterotrimeric G protein activation: applications to biased ligands. Current Pharmaceutical Design. 18 (2), 128-144 (2012).
- Yin, H., et al. Lipid G protein-coupled receptor ligand identification using beta-arrestin PathHunter assay. The Journal of Biological Chemistry. 284 (18), 12328-12338 (2009).
- Cheng, Z., et al. Luciferase Reporter Assay System for Deciphering GPCR Pathways. Current Chemical Genomics. 4, 84-91 (2010).
- Roth, B. L., Kroeze, W. K. Integrated Approaches for Genome-wide Interrogation of the Druggable Non-olfactory G Protein-coupled Receptor Superfamily. The Journal of Biological Chemistry. 290 (32), 19471-19477 (2015).
- Jean-Charles, P. -. Y., Kaur, S., Shenoy, S. K. G Protein-Coupled Receptor Signaling Through β-Arrestin-Dependent Mechanisms. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 70 (3), 142-158 (2017).
- Smith, J. S., Rajagopal, S. The β-Arrestins: Multifunctional Regulators of G Protein-coupled Receptors. The Journal of Biological Chemistry. 291 (17), 8969-8977 (2016).
- Böhme, I., Beck-Sickinger, A. G. Illuminating the life of GPCRs. Cell Communication and Signaling. 7 (1), 16 (2009).
- Fang, Y. Label-Free Receptor Assays. Drug discovery today. Technologies. 7 (1), 5-11 (2011).
- Wang, T., et al. Measurement of β-Arrestin Recruitment for GPCR Targets. Assay Guidance Manual. Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. , (2004).
- Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (1), 64-69 (2008).
- Kroeze, W. K., et al. PRESTO-Tango as an open-source resource for interrogation of the druggable human GPCRome. Nature Structural & Molecular Biology. 22 (5), 362-369 (2015).
- Jordan, M., Schallhorn, A., Wurm, F. M. Transfecting Mammalian Cells: Optimization of Critical Parameters Affecting Calcium-Phosphate Precipitate Formation. Nucleic Acids Research. 24 (4), 596-601 (1996).
- Baker, J. M., Boyce, F. M. High-throughput functional screening using a homemade dual-glow luciferase assay. Journal of Visualized Experiments. (88), 50282 (2014).
- Li, H., Eishingdrelo, A., Kongsamut, S., Eishingdrelo, H. G-protein-coupled receptors mediate 14-3-3 signal transduction. Signal Transduction and Targeted Therapy. 1 (1), 16018 (2016).
- Walther, C., Ferguson, S. S. G. Minireview: Role of intracellular scaffolding proteins in the regulation of endocrine G protein-coupled receptor signaling. Molecular Endocrinology. 29 (6), 814-830 (2015).
- Gurevich, E. V., Benovic, J. L., Gurevich, V. V. Arrestin2 expression selectively increases during neural differentiation. Journal of Neurochemistry. 91 (6), 1404-1416 (2004).
- Shaikh, S., Nicholson, L. F. B. Optimization of the Tet-On system for inducible expression of RAGE. Journal of Biomolecular Techniques JBT. 17 (4), 283-292 (2006).
- Blau, H. M., Rossi, F. M. Tet B or not tet B: advances in tetracycline-inducible gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (3), 797-799 (1999).
- Roche, O., et al. Development of a Virtual Screening Method for Identification of “Frequent Hitters” in Compound Libraries. Journal of Medicinal Chemistry. 45 (1), 137-142 (2002).
