Summary
Dado que los GPCR son objetivos atractivos para drogarse, el cribado de ligando GPCR es por lo tanto indispensable para la identificación de compuestos de plomo y para estudios de desorfanización. Hacia estos esfuerzos, describimos PRESTO-Tango, una plataforma de recursos de código abierto utilizada para la elaboración simultánea de perfiles de reclutamiento transitorio de é-arrestin2 en aproximadamente 300 GPCRs utilizando un ensayo de reportero basado en TEV.
Abstract
Como la superfamilia genética más grande y versátil y los mediadores de una gama de vías de señalización celular, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan uno de los objetivos más prometedores para la industria farmacéutica. Ergo, el diseño, la implementación y la optimización de los ensayos de detección de ligandos GPCR es crucial, ya que representan herramientas de control remoto para el descubrimiento de fármacos y para manipular la farmacología y los resultados de GPCR. En el pasado, los ensayos dependientes de la proteína G tipificaran esta área de investigación, detectando eventos inducidos por ligandos y cuantificando la generación de mensajeros secundarios. Sin embargo, desde el advenimiento de la selectividad funcional, así como una mayor conciencia de varias otras vías independientes de la proteína G y las limitaciones asociadas con los ensayos dependientes de la proteína G, hay un mayor impulso hacia la creación de Ensayos de detección de ligando GPCR. Hacia este esfuerzo, describimos la aplicación de uno de esos recursos, la plataforma PRESTO-Tango, un sistema basado en reporteros de luciferasa que permite el interrogatorio paralelo y simultáneo del GPCR-ome humano, una hazaña que anteriormente se consideraba técnica y económicamente inviable. Sobre la base de un ensayo de reclutamiento independiente de proteínaS G, la universalidad del tráfico mediado por la toma de la empresa y la señalización en los GPCR hace de PRESTO-TANGO una herramienta adecuada para estudiar aproximadamente 300 receptores huérfanos. La sensibilidad y robustez de PRESTO-Tango lo hacen adecuado para pantallas primarias de alto rendimiento que utilizan bibliotecas compuestas, empleadas para descubrir nuevos objetivos GPCR para medicamentos conocidos o para descubrir nuevos ligandos para receptores huérfanos.
Introduction
Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la familia más grande y diversa de proteínas transmembranas, que funcionan como interfaces de comunicación entre una célula y su entorno1. La versatilidad de los GPCR se destaca por su capacidad para detectar una amplia gama de ligandos, desde neurotransmisores hasta nucleótidos, péptidos a fotones, y muchos más, así como su capacidad para regular numerosas cascadas de señalización aguas abajo implicadas en el crecimiento celular, migración, diferenciación, apoptosis, disparo celular, etc.2,3. Teniendo en cuenta su ubicuidad e implicación en una multitud de procesos fisiológicos, esta familia de receptores es de suma importancia terapéutica, que se muestra por el hecho de que más de un tercio de los medicamentos prescritos actualmente disponibles se dirigen a los GPCRs4. Sin embargo, estas terapias existentes sólo se dirigen a un pequeño subconjunto de la superfamilia (se estima que el 10%), y la farmacología de muchos GPCR sigue sin aclararse. Además, más de 100 GPCRs existen como receptores huérfanos, ya que no han sido emparejados con un ligando endógeno5. Por lo tanto, el cribado de ligando GPCR es fundamental en la desorfanización y el desarrollo de fármacos, ya que allana el camino hacia el descubrimiento y optimización de plomo, y posiblemente a la fase de ensayo clínico.
Los métodos para el cribado de ligando GPCR han caído tradicionalmente en una de dos categorías, ensayos funcionales independientes de la proteína G o independientes de la proteína G6. La señalización GPCR está regulada por las proteínas G heterotriméricas , que se activan mediante el intercambio de GTP por el PIB consolidado en la subunidad7de la G. Las señales del receptor activado son transducidas por las proteínas G a través de mensajeros secundarios, tales como campo, calcio, DAG e IP3, para mediar la señalización aguas abajo en los efectores aguas abajo8. La naturaleza de las consecuencias funcionales de la señalización de proteína G se ha explotado para crear ensayos a base de células que reflejan la activación del receptor. Estos métodos, que miden eventos proximales (directos) o distales (indirectos) en la señalización de proteínas G, se utilizan con mayor frecuencia para el cribado de ligando GPCR y se han empleado principalmente en estudios de desorfanización6. Entre los ejemplos de ensayos que miden directamente la activación de proteínaG mediada por GPCR se incluyen el ensayo de unión [35S]GTP-S, que mide la unión de un análogo GTP radiomarcado y no hidrolizable a la subunidad De G, y de la transferencia de energía de resonancia de la bioluminiscencia (FRET/BRET, respectivamente) para monitorear las interacciones GPCR-G y G-G, que han ido ganando más tracción a lo largo de los años9,10. Los ensayos que supervisan los eventos distales son las herramientas más utilizadas para la generación de perfiles GPCR; por ejemplo, los ensayos de campo e IP1/3 miden la acumulación intracelular de mensajeros secundarios dependientes de la proteína G, mientras que los ensayos de flujo y reporteros [Ca2+]que implican elementos de respuesta específicos implicados en la activación de la proteína G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) examinan los acontecimientos posteriores a la cascada de señalización11. Si bien la mayoría de los ensayos antes mencionados se pueden realizar a un nivel de alto rendimiento, son bastante sensibles, y cuentan con ciertas ventajas específicas del ensayo (por ejemplo, discriminación entre agonistas completos/parciales, antagonistas neutrales y agonistas inversos en el caso de la unión GTP-S, o la funcionalidad de ensayo en células vivas como [Ca2+] e IP1/3)6, lamentablemente no hay métodos existentes dependientes de la proteína G que se ajusten al interrogatorio de todo el GPCR-ome farmacoliente. Esto se debe en gran medida al acoplamiento nativo de múltiples subfamilias de proteína G a los GPCR, lo que resulta en la señalización en varias cascadas y el acoplamiento desconocido de la proteína G en los GPCR huérfanos. Para mitigar este problema, se han desarrollado ensayos para forzar el acoplamiento promiscuo de proteína G a través de una única lectura de señalización común, como el campo, y Ca2+,aunque la mayoría de ellos son de bajo rendimiento12.
Un aspecto importante del ciclo de vida del GPCR es la terminación de la señalización dependiente de la proteína G, que se produce en gran parte a través del reclutamiento de arrestinas que induce la disociación de la proteína G, y en última instancia desensibilizar el receptor, que está dirigido a la internalización recubierta de clathrin13. Las isoformas más ubicuamente expresadas de la-arrestin son las no visuales de la palabra -arrestin1 y la de la detin2, también denotadas como arrestin-2 y arrestin-3, respectivamente14. Ingrese los ensayos basados en células independientes de la proteína G, que agregan una nueva dimensión al cribado de ligando GPCR; el tráfico de receptores, la célula entera sin etiquetas y los ensayos de reclutamiento de arrestinas son ejemplos notables. Los ensayos de tráfico de GPCR emplean ligandos etiquetados con fluoróforo o anticuerpos cointernalizados dirigidos al receptor15,mientras que los ensayos de células enteras sin etiquetas utilizan biosensores que traducen los cambios celulares inducidos por la unión de ligandos en salidas cuantificables, como señales eléctricas u ópticas16. En particular, las interacciones por excelencia de GPCR-arrestin como un ensayo de reclutamiento de arresten como una herramienta atractiva en el repertorio de ensayos funcionales17. El sistema Tango, desarrollado por primera vez por Barnea et al. hace sólo una década, implica la introducción de tres elementos genéticos exógenos: una fusión proteica consistente en é-arrestin2 con una proteasa del virus de la etch del tabaco (TEVp), un transactivador de tetraciclina (tTA) que se atan a un GPCR a través de un tabaco, etc. sitio de escovades de la proteasa del virus h (TEVcs) y está precedido por una secuencia del Término C del receptor de vasopresina V2 (cola V2) para promover el reclutamiento de arrestina, y un gen de luciferasa reportero cuya transcripción es desencadenada por el tTA factor de transcripción translocación al núcleo, que se libera del anclaje de membrana después de la contratación de la-arrestin2 (Figura 1)18. Las lecturas cuantitativas de la activación del GPCR y el reclutamiento de la lista 2 se pueden determinar posteriormente mediante la lectura de luminiscencia. Una distinción notable es que si bien el tráfico de receptores y los métodos de células enteras sin etiquetas son relativamente de bajo rendimiento, el Tango tiene varias ventajas, incluyendo la lectura selectiva que es específica del receptor objetivo y la sensibilidad debido a la integración de la señal, que lo convierten en un candidato adecuado para la detección de ligandos en una escala más grande18.
En vista de estas características estratégicas, Kroeze y otros desarrollaron PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), una plataforma de código abierto de alto rendimiento que utiliza el enfoque Tango para perfilar el GPCR-ome farmacogable de manera paralela y simultánea19. Aprovechando el reclutamiento "promiscuo" de la prueba de análisis de la palabra 2 a casi todos los GPCR, PRESTO-Tango es el primero de su tipo en términos de ensayos funcionales basados en células, lo que permite un cribado rápido de "primera ronda" de compuestos de moléculas pequeñas en casi todos los PCPR no olfativos, incluidos los huérfanos, independientes del acoplamiento de la subfamilia de proteínas G.
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Protocol
1. Examen primario: cultivo celular y sembrado de placas
- Para preparar placas recubiertas de poli-L-lisina (PLL), dispensar 20 l/bien de una solución de material de 25 g/ml de PLL en placas inferiores ópticas de 384 pocillos blancos o negros utilizando una pipeta electrónica multicanal o un dispensador de reactivos. Incubar las placas a temperatura ambiente durante 0,5–2 h.
NOTA: Si utiliza las placas negras de 384 pocillos, espere que la señal de fondo sea inferior en comparación con las placas blancas. Se recomiendan placas negras para reducir el sangrado de luminiscencia entre pozos adyacentes. - Para conservar las placas recubiertas y lavar el exceso de PLL, retire el PLL golpeándolo sobre el fregadero, toque secar sobre una toalla de papel y agregue 40 l/bien de 1 x solución diluida de antibiótico-antimicótico utilizando una pipeta electrónica multicanal o un dispensador de reactivos. Conservar las placas recubiertas de PLL a 4oC hasta que estén listas para la sembrada de placas.
- Mantener las células HTLA (proporcionadas amablemente por el Dr. Richard Axel) – una línea de células renales embrionarias humanas (HEK293T) que expresa fácilmente el valor de la é-arrestin2-TEV y la luciferasa impulsada por tTA, en completa el medio modificado de Dulbecco Eagle (DMEM) complementado con 5% de suero fetal bovino, 5% de suero de ternera bovina, 2,5 g/ml de puromicina, 50 g/ml de higromicina, 100 U/ml de penicilina y 100 g/ml de estreptomicina a 37 oC en una incubadora humidificada que contenga 5% deCO2.
- Cultivo de células HTLA en platos de 150 mm y pasar células dos veces por semana con un factor de dilución de 1:10, con un número óptimo de paso celular de 5-25. Asegúrese de que un número suficiente de platos de 150 mm sean confluentes el día de la sembración de placas de 384 pocillos, dependiendo de la escala de la pantalla principal.
NOTA: El uso de células HTLA superior al pasaje 25 puede resultar en una menor viabilidad, lo que produce resultados subóptimos. - Para las células HTLA de semilla para la pantalla primaria, enjuague suavemente el plato o platos de 150 mm con 1x solución salina con búfer de fosfato (PBS), pH 7.4. Separe las células con aproximadamente 6 ml de 0.05% de trippsina/0.53 mM EDTA, y transfiera a un tubo centrífugo que contenga al menos la misma cantidad de medio eagle modificado (DMEM) de Dulbecco completo para neutralizar la trippsina.
- Espíe las células HTLA a 500 x g durante 3 min y resuspenda el gránulo celular a una densidad de 0,22 x 106 células/ml en DMEM completo, omitiendo la adición de 2,5 g/ml de puromicina y 50 g/ml de higromicina, ya que pueden disminuir la eficacia de la transfección.
- Incubar las placas recubiertas de PLL de 384 pocillos necesarias a 37 oC para calentarlas antes de sembrar las células. Retire la solución de almacenamiento de 1x antibiótico antibiótico de la placa(s) recubierta(s) con PLL de 384 pocillos moviendo la placa sobre el fregadero y pegándola sobre una toalla de papel para secarla.
- Células de semilla en las placas recubiertas de PLL de 384 pocillos a una densidad final de 10.000 células/pozo mediante la dosificación de 45 ol de la suspensión HTLA de 0,22 x 106 celdas/ml utilizando una tubería electrónica multicanal. Incubar placas a 37oC durante la noche. Si se prefiere una transfección en el mismo día, las células de semillas a una densidad de 16.000 células/bien y realizar la transfección 4 h más tarde.
NOTA: Para una alta eficiencia de transfección, la confluencia celular del 50-70% es óptima.
2. Análisis primario: preparación y transfecciones de placas de ADN
- Para preparar la placa fuente de ADN de 384 pocillos para la transfección como se muestra en la Figura 2,distribuya los cDNA plásmidos que codifican las construcciones GPCR-Tango de interés en una placa de 96 pocillos, con un GPCR/pozo diferente. El ADN plásmido debe suspenderse en un tampón Tris-EDTA (TE) de 0,1x a una concentración de 50 ng/L.
NOTA: Las placas de ADN de 96 pocillos se pueden sellar y almacenar a -20 oC, y reutilizarse para múltiples experimentos de cribado. Todas las construcciones GPCR-Tango de codificación cDNA están disponibles comercialmente (ver la Tabla de Materiales)y se clonan en el plásmido de neomicina pcDNA3.1. El kit PRESTO-Tango GPCR consta de cuatro placas de 96 pocillos, que incluyen 80 GPPR cada una, un par de pozos con un vector vacío como controles negativos, y pozos de control positivo que sostienen el receptor de dopamina D2 (DRD2), y pozos que llevan un plásmido que codifica una proteína fluorescente (YFP) para realizar un seguimiento de la eficiencia de la transfección. - Usando una pipeta multicanal, transfiera manualmente la solución de ADN del pozo 96 a la placa fuente de ADN de 384 pocillos, añadiendo 10 s por cada 384 pocillos. Para asegurarse de que cada condición del experimento se ensayo en cuadruplicado, la mitad de la placa de ADN de 96 pocillos (filas A-D o E-H) cubrirá una placa completa de 384 pocillos distribuyendo cada GPCR en dos cuadrantes (primer cuadrante - compuesto, segundo cuadrante + compuesto), de modo que el mismo GPCR será infectado en 8 pozos de la placa de 384 pocillos (ver Figura 2 como guía).
- Montar los siguientes reactivos de transfección necesarios para el método de precipitación de fosfato cálcico, como se describe en Jordan et al.20: 0,1x te buffer (1 mM Tris-HCl y 0,1 mM EDTA); 2.5 M CaCl2 solución; 2x Tampón Hepes, pH 7.05 (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1.5 mM Na2HPO4). Esterilice todas las soluciones filtrando y almacenar a 4oC. El día de la transfección, permita que los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de su uso.
- Diluir la solución en stock de 2,5 M CaCl2 en 0,1x TE (dilución 1:8) a una concentración final de 0,313 M CaCl2 y vórtice. Transfiera 40 l de 0,313 M De CaCl2 a la placa de fuente de ADN de 384 pocillos y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta multicanal portátil o un pipeteador automatizado de 384 canales.
- Añadir 50 l de 2 x tampón Hepes a la placa fuente de ADN de 384 pocillos, mezclar de nuevo pipeteando hacia arriba y hacia abajo y dejar reposar durante 1 min; cada 384 pocillos tendrá una cantidad adecuada de mezcla de ADN/transfección para la transfección de nueve placas de 384 pocillos, dependiendo del número de compuestos que deban ser probados. Transfiera 10 l de la mezcla de ADN/transfección de la placa fuente de ADN de 384 pocillos a las células HTLA sembradas e incubar las placas durante la noche a 37 oC.
3. Examen primario: Estimulación celular
- Veinticuatro horas más tarde, decantar los medios celulares transinfectados moviendo suavemente la placa de 384 pocillos sobre el fregadero y pegándola sobre una toalla de papel, o con una cabeza de aspirador. Añadir lentamente 40 l de medios hambrientos (DMEM complementado con 1% de suero bovino fetal dializado (dFBS) y 1x antibiótico/antimicótico), teniendo cuidado de evitar tocar las células directamente.
- Pipet 20 l del compuesto de interés a una concentración 3x (concentración final de la droga en la placa celular será 1x) en las filas alternas con estimulación (+), y 20 l de tampón del vehículo para las filas alternas sin (-) compuesto. Regrese la placa celular a 37oC en 5% deCO2 e incubar durante al menos 16 h.
4. Examen primario: Lectura de luminiscencia
- Preparar el reactivo Glo, modificado de Baker y Boyce21: 108 mM Tris-HCl; 42 mM Tris-Base, 75 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM Dithiothrei-tol (DTT), 0,2 mM Coenzima A, 0,14 mg/ml D-Luciferin, 1,1 mM DE ATP, 0,25% v/v Tritón X-100, 2 mM de hidrosulfito de sodio.
NOTA: Las soluciones de stock de los reactivos se pueden hacer con antelación, a excepción de D-Luciferin, que siempre se añade recién al reactivo Glo en su forma en polvo. Si se utilizaron placas negras, la cantidad de D-Luciferin se puede aumentar hasta 0,25 mg/ml. - A las 16-24 h después de la estimulación, decantar los medios celulares transinfectados moviendo suavemente la placa de 384 pocillos sobre el fregadero y pegándola sobre una toalla de papel. Añadir 20 l/pozo de reactivo Glo e incubar la placa a temperatura ambiente durante 5-20 min. Lea las placas utilizando un contador de luminiscencia de microplaca, con un tiempo de integración de 1 s/pozo.
5. Examen primario: Análisis de datos
- Exportar los archivos guardados desde el contador de luminiscencia como una hoja de cálculo; los resultados se registrarán en unidades de luminiscencia relativas (RLU). Sobre la base de la disposición de la placa de 384 pocillos, calcule la activación (cambio de plegado) de cada receptor utilizando la siguiente fórmula:
NOTA: Aquí la muestra RLU se refiere al valor de cada uno de los cuatro pozos de réplica del cuadrante estimulado (+ compuesto), RLU de fondo medio es la media de los controles negativos en la placa, y RLU basal media se refiere a la media del cuadrante no tratado de ese mismo receptor (- compuesto). Además, calcule la desviación estándar de los 4 puntos de datos para verificar la calidad de los resultados. Se recomienda realizar una transformación log2 en la media de los cambios de pliegue para corregir cualquier heteroskedasticidad; la base log2 es una opción práctica para ayudar a identificar los golpes positivos. Establezca empíricamente los umbrales de posicionación positivos; hay que tener en cuenta que algunos receptores pueden tener tan bajo como 2 veces aumento y hasta 40 veces aumento para otros con agonista completo. - En función de los resultados, seleccione los GPCR que son posibles éxitos positivos para el cribado secundario.
6. Examen secundario: Sembrado celular y transfecciones
- Células HTLA de subcultivo en platos de 100 mm a una densidad celular total de 5 x 106 células en 11 ml de medios completos (4,55 x 105/ml) e incubar a 37oC durante 24 h. Si se prefiere una transfección en el mismo día, las células de semillas a una densidad de 7,5 x 106 células y realizar la transfección 4 h más tarde.
- Precaliente los reactivos necesarios para la precipitación de fosfato de calcio a temperatura ambiente. Combinar 450 l de tampón TE de 0,1x con 50 ml de CaCl2 de 2,5 M y vórtice rápidamente; estas cantidades son específicas para un plato de 100 mm, en función del volumen de medio de crecimiento que contiene.
- En un tubo, añadir 500 ml de la solución TE/CaCl2 a 10 g de GPCR cDNA y vórtice. Añadir 500 l de 2 solución tampón Hepes en el tubo, agitar vigorosamente (no vórtice), e incubar durante 1 min.
NOTA: 1 g de cualquier plásmido que codifica una proteína fluorescente (por ejemplo, YFP, mCherry, etc.) puede ser co-transfect con 9 g de ADNC GPCR para un total de 10 g. La proteína fluorescente se utiliza para realizar un seguimiento de la eficiencia de la transfección, y esta cantidad mínima no interferirá con el ensayo. - Inmediatamente después de la incubación corta, dispensar la solución de 1 ml en las células. Mezcle suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para distribuir uniformemente el precipitado, teniendo cuidado de no agitar la placa, e incubar a 37 oC durante 24 h.
- Al día siguiente, observe la eficiencia de la transfección observando la expresión de la proteína fluorescente bajo un generador de células fluorescentes; transfecciones superiores al 50% de cobertura son ideales.
- Incubar la(s) placa(s) recubierta(s) de PLL de 384 pocillos necesaria(s) en la incubadora a 37oC para calentarla antes de sembrar las células. Retire la solución de almacenamiento de 1x antibiótico antibiótico de la placa(s) recubierta(s) con PLL de 384 pocillos moviendo la placa sobre el fregadero y pegándola sobre una toalla de papel para secarla.
- Enjuague suavemente las células transinfectadas con la solución de Versene (1X PBS, pH 7.4; 0.53 mM EDTA) y desmonte agregando 3 ml de 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA al plato. Transfiera el contenido a un tubo centrífugo que contenga al menos una cantidad igual de DMEM completo para neutralizar la trippsina.
- Gire las células a 500 x g durante 3 min y resuspenda las celdas a una densidad de 0,4 x 106 celdas/ml en medios hambrientos. Células de semilla en la placa(s) recubierta(s) de 384 pocillos con PLL a una densidad final de 25.000 células/pozo mediante la dosificación de 45 l de la suspensión celular utilizando un pipeta multicanal electrónico. Devolver las placas a los 37oC durante un mínimo de 4 h, permitiendo que las células se adhieran correctamente a los pozos antes de proceder a la estimulación.
7. Examen secundario: Preparación de placas farmacológicas para curva de dosis de 16 puntos (medio log)
- En una placa de 96 pocillos, añada 270 ml de tampón de drogas 1X HBSS (1 x Solución de sal equilibrada de Hank [HBSS], 20 mM DE HEPES pH 7.4, 1x antibiótico-antimicótico), excluyendo la última fila (fila H) de la placa, como se muestra en la Figura 4.
NOTA: Para péptidos, moléculas coloidales y compuestos poco solubles en agua, se sugiere la adición de 0.1–1% BSA. Para prevenir la oxidación de fármacos, también se puede añadir hasta un 0,01% de ácido ascórbico. - A partir de la población de drogas, preparar una solución de drogas (denominada la "alta" concentración) mediante el cálculo de una concentración final 3x (concentración final de la droga en la placa celular será 1x). Por ejemplo, para una curva dosis-respuesta con 10 m como su concentración más alta, prepare la concentración "alta" a 30 oM. Pipet 300 l de concentración "alta" en pozos en la fila H.
- En otro tubo, preparar la concentración "Baja", que representa la concentración "Alta" dividida por 3.16 (medio registro). Según el ejemplo anterior, la concentración "Baja" sería de 9,49 m. Pipet 300 l de concentración "baja" en pozos en la fila H, adyacentes a los pozos "Alto".
NOTA: El número total de 96 pozos necesarios en la fila H dependerá del número de células y las condiciones de estimulación. Cuatro pozos (dos "Alto" y dos "Bajo") tendrán una amplia solución de fármaco para estimular una placa de pozo 384 entera. - Realice una dilución en serie pipeteando 30 l de solución de fármaco según lo recomendado desde los pozos "Alto" y "Bajo" de la fila H a la fila anterior (fila G) y mezcle pipeteando manualmente hacia arriba y hacia abajo, o según se recomienda, utilizando una pipeta electrónica multicanal con la función "Pipeta y Mezcla". Repita este paso hasta la primera fila más diluida (fila A), mientras descarta las puntas entre diluciones.
NOTA: Si se desea, las diluciones en serie se pueden detener antes de la fila A, representando un control interno sin fármaco, es decir, un "verdadero cero". - Usando la Figura 4 como referencia, estimule las células transfectó mediante el pipeteo de 20 l de las diluciones de columna "baja" desde la placa de 96 pocillos a las filas A-O de la placa de 384 pocillos previamente sembrada, así como 20 l de las diluciones de columna "Altas" a los pozos B–P. Incubar la placa a 37 oC durante un mínimo de 16 h.
8. Examen secundario: Lectura de luminiscencia y análisis de datos
- A las 16-24 h después de la estimulación, decantar los medios celulares transinfectados moviendo suavemente la placa de 384 pocillos sobre el fregadero y pegándola sobre una toalla de papel. Añadir 20 l/pozo de reactivo Glo e incubar la placa a temperatura ambiente durante 5-20 min. Lea las placas utilizando un contador de luminiscencia de microplaca, con un tiempo de integración de 1 s/pozo.
- Exportar los archivos guardados desde el contador de luminiscencia como una hoja de cálculo; los resultados se registrarán en unidades de luminiscencia relativas (RLU). Transfiera los datos de la placa de 384 pocillos a un software de estadísticas para analizar los resultados utilizando su análisis XY incorporado para el ajuste de curva de regresión no lineal. Seleccione la función de estimulación dosis-respuesta de 3 parámetros integrada "Log(agonist) vs. respuesta (tres parámetros)",
NOTA: Aquí Top e Bottom son mesetas en las unidades del eje Y, respectivamente la respuesta máxima y el nivel basal, EC50 es la concentración del agonista que genera una respuesta del 50% entre superior e inferior, y X se refiere a la concentración de troncos del agonista. Este modelo supone que la curva de dosis-respuesta tiene una pendiente de pendiente de pendiente estándar de 1.
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Representative Results
Utilizando el protocolo PRESTO-Tango presentado en este documento, un extracto de gráulo de cromafina (CG) se basó en 168 objetivos GPCR no olfativos, siendo la mayoría receptores huérfanos. La elaboración de perfiles de dicho extracto se llevó a cabo examinando la movilización de la lista 2 en los receptores elegidos, sobre la base del principio diseñado por Barnea et al.18 (Figura 1). El ADN plasmico de los GPCR de interés fue tomado del kit GPCR PRESTO-Tango y montado en dos 96 placas de pozo en el diseño deseado. En total, cuatro placas de 384 pocillos sembradas con células HTLA fueron infectadas, ya que cada mitad de las placas de ADN de 96 pocillos se convirtieron en una placa completa de 384 pocillos, lo que dio lugar a que cada receptor se transfectó en dos cuadrantes (ocho pozos 384 en total). Uno de los dos cuadrantes fue estimulado con el extracto de CG; las filas alternas C–D, G–H, K–L y O–P representaban la estimulación (+)(Figura 2). De los 168 GPCR que fueron interrogados en el cribado primario, sólo dos receptores eran contendientes como objetivos activos potenciales, específicamente el receptor de dopamina D3 (DRD3) y la opsin 5 (OPN5). DRD3 produjo un cambio significativo de log2fold de 4.70, mientras que OPN5 produjo una respuesta ligeramente menor de 2.39, ambos cumpliendo con el límite de límite de cambio de pliegue log2 >2. En comparación, el control positivo para la pantalla primaria fue DRD2 estimulado con quinpirole, un agonista selectivo de este receptor, y produjo un cambio de pliegue log2 de 4.58(Figura 3). Para reproducir estas ventanas de señal y eliminar la posibilidad de golpes falsos positivos, se llevó a cabo una pantalla secundaria con los receptores antes mencionados. Además de probar el extracto de CG, dado que DRD3 es un receptor no huérfano, otra condición se preparó como un control positivo, específicamente la estimulación con quinpirole, uno de sus agonistas selectivos. Por otro lado, OPN5 es un receptor huérfano y como tal, ningún agonista de referencia puede ser probado junto con el extracto de CG como un control positivo; solo se probó el búfer como un control negativo. La caracterización farmacológica adicional de estos dos BG se realizó mediante la preparación de curvas de dosis de 16 puntos que van de 10-5 M a 10-12,5 M. Específicamente, el extracto de CG y las soluciones de calquía a 10 mM se diluyeron a 30 m y 9,49 m, las concentraciones correspondientes "altas" y "bajas" en la fila inferior (fila H) de la placa de fármaco de 96 pocillos; estas formulaciones se convertirán en 10-5 M y 10-5,5 M una vez que se dispensará 20 l en las células transtrampeadas en 40 oL de medio hambriento, para un total de 60 ml dentro de cada 384-pozo. Como se describió anteriormente, se realizaron diluciones en serie de tal manera que las formaciones de fármacos más diluidas para 10-12 M y 10-12.5 M se encuentran en la fila superior (fila A)(Figura 4). Las curvas de dosis-respuesta del cribado secundario se crearon utilizando GraphPad Prism para evaluar la potencia y eficacia del ligando. En comparación con el quinpirole, el extracto de CG produjo ventanas de señal similares y valores EC50, confirmando su validez como un golpe activo en DRD3. Sin embargo, se produjo una curva de dosis plana similar al control negativo para OPN5, descartándola como un posible objetivo para el extracto de CG(Figura 5).
Figura 1: Diseño modular de las construcciones de TANGO (A) y esquema general para el ensayo de reclutamiento de la arandela (Tango) (B). (A) Las construcciones de TANGO GPCR consisten en varios elementos del módulo en el siguiente orden: una etiqueta de señal HA/FLAG, el GPCR CDS, una cola de vasopresina receptor 2 C-terminal, sitio de escisión de proteasa TEV y un factor de transcripción tTA. (B) El principio del ensayo de tango consiste en transfectar transitoriamente los plásmidos de tango GPCR en células HTLA, células HEK293T que expresan de forma estable una proteína de fusión proteasa de la arrestina2-TEV y un gen reportero de luciferasa cuya expresión es activada por tTA. La activación de la GPCR eventualmente dará lugar a la movilización de la -arrestin2-TEV al receptor, acercando a la proteasa cerca de su sitio de escisión. Como resultado, el tTA se corta de la cola del GPCR, liberando el factor de transcripción para translocar en el núcleo y activar la expresión de luciferasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Diseños de placa de ADNc de 96 pocillos y placa celular de 384 pocillos para transfección y estimulación en el cribado primario PRESTO-TANGO. Representando la preparación de una placa fuente de ADNc de 384 pocillos para la transfección, las construcciones de TANGO de GPCR se transfieren primero de la mitad de una placa de 96 pocillos a una placa completa de 384 pocillos, con cada receptor siendo transinfectado en octuplicado. En este ajuste, la estimulación de las células con (+) y sin (-) el(los) fármaco(s) de interés ocurrirá en cuadruplicado para cada receptor individual. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Representaciones gráficas de la identificación de aciertos de la proyección primaria PRESTO-Tango. Como prueba de concepto, se analizó la actividad biológica de un extracto de gráfnulo de cromafina (CG) en el GPCRome. Las células HTLA fueron transfectó en 384 placas de pozo con 168 construcciones de GPCR Tango, y ya sea estimuladas con el extracto de CG (+ compuesto) o con el tampón del vehículo (- compuesto). pcDNA3.1 se utilizó como un control negativo, y el receptor DRD2 estimulado con quinpirole se utilizó como un control positivo. Las ventanas de señal (A) y el cambio de pliegue log2 (B) en la activación del receptor se calcularon entre los pozos en ausencia o presencia de extracto de CG. Todas las barras de error representan SD (n a cuatro medidas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Disposición de la preparación de placas de medicamentos de 96 pocillos para la estimulación en el cribado secundario. Representando la preparación de una placa de fármaco de 96 pocillos para la estimulación celular, las diluciones en serie para un rango de curva de dosis de 16 puntos comienzan en 10-5 M (concentración final) en la fila H, con intervalos de medio registro entre cada punto hasta 10-12,5 M en la fila A. "Alto" y "Bajo" columnas de fármacos se utilizan para estimular filas alternas de la placa de 384 pocillos de semillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Respuestas de curva de dosis para perfilado compuesto y demostración de reclutamiento de é-arrestin2 a GPCRs en cribado secundario. Las células HTLA se transtrcómoron transitoriamente con receptores DRD3 (A) y OPN5 (B). Ambas condiciones transfectótivas fueron estimuladas con un extracto de CG en incrementos de medio registro, así como el quinpirole agonista específico DRD3 como un control positivo, y el búfer del vehículo para OPN5 como un control negativo. Todas las barras de error representan SD (n a tres medidas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los GPCR dinámicos de conformación son potencias de transducción de señales. Las propiedades fisioquímicas de los bolsillos de unión de estos receptores hephelicales, así como su relevancia fisiológica subrayan la necesidad de herramientas de detección de ligando GPCR. Como se presentó anteriormente, el ensayo PRESTO-Tango es rápido, sensible y fácil de usar, prestándose al desarrollo de drogas. Este ensayo no sólo mide la activación inducida por agonistas, sino que también se puede utilizar para cuantificar la actividad de los antagonistas y moduladores alostéricos19. A la luz de la selectividad funcional, un concepto que sugiere que diferentes estructuras de fármacos pueden provocar diferentes cascadas de señalización de receptores en un solo receptor, comparando la activación de la vía de la proteína G utilizando ensayos dependientes de la proteína G con reclutamiento de é-arrestin usando PRESTO-Tango podría proporcionar señales para el diseño de compuestos de plomo con efectos secundarios negativos reducidos. En particular, su independencia de detectar el acoplamiento de proteína G ayuda a identificar a los socios de acoplamiento de los PPCOr huérfanos que no habrían sido detectados previamente por ensayos dependientes de la proteína G.
Para garantizar la consistencia y robustez de las pantallas PRESTO-Tango, se debe tener cuidado en todos los pasos del protocolo, ya que las perturbaciones introducidas se magnificarán debido a la naturaleza de esta plataforma. Por supuesto, hay medidas generales comunes a todas las pantallas HTS que deben tenerse en cuenta, como el uso de reactivos del mismo lote/formulación para garantizar la estabilidad y la actividad biológica idénticas en todo el tiempo, así como mantener las condiciones en el sistema HTS consistentes, como la densidad de la semilla celular y el tiempo de incubación de fármacos. El formato miniaturizado de PRESTO-Tango exige atención a un par de puntos críticos: la variación en la densidad de la semilla celular y su distribución homogénea (reducción versus suspensión de una sola célula) entre pozos, baja eficiencia de transfección y poca estimulación y entrega de compuestos evitará la reproducibilidad diaria y de placa a placa. Para ello, triturar la suspensión de la célula HTLA para homogeneizar la solución antes de la sembrada y asegurar una confluencia celular del 50-70% antes de la transfección. Debe verificarse el vehículo para la entrega de los compuestos, siendo el dimetilsulfóxido el portador más común. Típicamente, la concentración más alta de nuestras curvas de dosis es de 10 M, pero esto puede cambiar dependiendo de la naturaleza y potencia del compuesto; es importante probar varias concentraciones para deducir la tolerancia celular y la toxicidad.
Dado que algunos GPCR tienen una alta actividad constitutiva, un problema que puede surgir durante el cribado es un rango dinámico reducido y una señal de fondo que es mayor de lo esperado. Esto puede ser algo mitigado asegurando que la inanición sérica se está realizando con medio DMEM complementado con 1% dFBS. Debe tenerse en cuenta que si la salida de luminiscencia es lo suficientemente alta, todavía puede haber sangrado a través de pozos adyacentes, lo que puede resultar en cambios de pliegue calculados erróneamente. Las señales indetectables o bajas (suponiendo que se espera una respuesta) pueden explicarse de varias maneras, a saber, una mala expresión de GPCR en las células HTLA, la actividad biológica del compuesto se pierde por lo que es ineficaz, o los receptores en cuestión no reclutan intrínsecamente a la detención2. Respetuosamente, evaluar la cantidad y calidad del ADN del receptor de plásmido transopete, probar otras preparaciones/lotes del compuesto ineficaz en cuestión, y realizar técnicas de interacción proteína-proteína ortopéloga como BRET/FRET o co-inmunoprecipitación son algunas soluciones sugeridas a este problema. Además, la expresión del receptor también podría mejorarse suclonando los receptores de Tango de interés en vectores lentivirales y transduciendo células HTLA, generando una línea celular estable HTLA-GPCR. Un cambio en la potencia esperada de un agonista durante el cribado secundario podría implicar que el tiempo de estimulación del fármaco y / o la concentración del compuesto necesario para estimular una respuesta es insuficiente, o que las diluciones seriales de la placa de fármaco se prepararon incorrectamente. El uso de una pipeta electrónica multicanal o un sistema automatizado de pipeteador sin cambiar las puntas en el medio al crear diluciones seriales de fármacos podría ser un problema al trabajar con compuestos pegajosos.
Las diferencias notables entre el ensayo original de Tango desarrollado por Barnea et al.18 y la plataforma PRESTO-Tango incluyen el diseño del receptor en un formato modular, que consiste en secuencias optimizadas para codón, que mejora la expresión del receptor en células de mamíferos, etiquetas de epítopos para validar dicha expresión, y sitios de restricción que flanquean los GPCR, la cola V2 y TEVcs-tTA, lo que permite la escisión de las partes y el subcloning. Lo más importante es que PRESTO-Tango supera el ensayo de tango en términos de potencia de proyección y diseño experimental. Las pruebas de muestras cuadruplicadas de aproximadamente 300 GPCRs se realizan en solo 8 placas de 384 pocillos, al tiempo que se contabilizan controles de fondo negativos y controles positivos para supervisar la eficiencia de la transfección. Mientras que PRESTO-Tango es adecuado para el cribado de la GPCR-ome con un solo compuesto de interés, también se pueden realizar interrogantes con múltiples ligandos, aunque a un mayor costo y uso de recursos, como con bibliotecas de compuestos de moléculas pequeñas agrupadas o agrupadas o muestras biológicas que consisten en mezclas de varias entidades químicas. Concedido, este problema puede mitigarse reduciendo el número de compuestos a interrogar mediante la realización de análisis químicos de similitud y diversidad de las bibliotecas compuestas en cuestión. Si bien la plataforma PRESTO-Tango es más aplicable para fines de cribado primario, la generación de perfiles secundarios se puede realizar a menor escala, en formatos de rendimiento medio o bajo, para confirmar las consecuencias funcionales de la estimulación de ligandos. Sin embargo, al igual que con todos los demás ensayos GPCR, debe reconocerse que no hay controles positivos adecuados para los receptores huérfanos durante el cribado secundario con el ensayo Tango. No obstante, se pueden identificar posibles golpes positivos si los datos de salida se pueden instalar en una curva de dosis-respuesta sigmoidal, con una ventana de señal calculada y un valor EC50. También es importante tener en cuenta que el mecanismo de actividad de ligando, ya sea para receptores huérfanos o no huérfanos, no se puede aclarar sin ejecutar ensayos paralelos.
Con todos los componentes de PRESTO-Tango ya optimizados, incluyendo la línea celular HTLA y las construcciones de GPCR Tango, se requiere poco espacio para la modificación, aparte de la elección de la formulación compuesta que se utilizará para la estimulación de fármacos. Si se desea, una línea celular HTLA que expresa fácilmente un receptor se puede generar fácilmente mediante la clonación de dicho receptor GPCR-Tango dentro del vector pIRESbleo3 recomendado (Clonetech), y la selección de clones mediante zeocina. Con respecto al intercambio de pcDNA3.1 a pIRESbleo3, simplemente digiere la construcción GPCR Tango con NotI y XbaI e insértela en el vector de destino en los sitios de restricción NotI y NheI. No obstante, existen vías para adaptar y optimizar esta tecnología. Uno de los pilares de esta tecnología son las células HTLA, una línea celular HEK293T que expresa de forma estable un gen de fusión de la empresa y un reportero de luciferasa dependiente de tTA, suministrado amablemente desde el laboratorio de Richard Axel. Si bien es un componente crucial de PRESTO-Tango, actualmente no hay otras alternativas en términos de origen de la línea celular, o los genes que expresan. Por otra parte, se pueden generar futuras líneas celulares de ingeniería para expresar otros genes de fusión TEV para rastrear otras proteínas además de la -arrestin2, específicamente aquellas que se ha demostrado previamente que interactúan o se encuentran en residencia a los GPCR, tales como 14-3-322, SAP9723, y -arrestin1, que es la isoforma más frecuente de las arrestinas no visuales en los vertebrados24. Esto se puede lograr mediante el uso de las células HTL parentales que sólo contenían el reportero luciferasa controlado por el promotor tetO7. Una limitación a PRESTO-Tango es la activación no específica del promotor del reportero. Basado en un sistema regulador dependiente de la tetraciclina (sistema de tet), el elemento sensible a la tetraciclina (TRE) controla la expresión del reportero de luciferasa aguas abajo. Sin embargo, estudios anteriores han demostrado expresión "fugada" de luciferasa debido a factores de transcripción endógenos25,26. Como resultado, algunos compuestos podrían activar al reportero independientemente del reclutamiento de la lista 2 o de la activación del GPCR, aumentando el número de falsos positivos. Otra cuestión que surge, también común a otros métodos de HTS, son los "frecuentees bateadores", compuestos promiscuos que estimulan respuestas sustanciales en varios objetivos27. No obstante, la configuración de cribado paralelo del PRESTO-Tango facilita la identificación de estos artefactos, que pueden ser probados para confirmar su efecto en la actividad de la luciferasa. En conjunto, PRESTO-Tango ha proporcionado bases sólidas para el estudio del reclutamiento de arrestinación a LOS GPCR, y en el esquema más amplio de descubrimiento de fármacos, como una herramienta de detección y desorfanización de ligandos GPCR.
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Disclosures
Las horas de la compra no declaran intereses en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (subvención de la CIHR #MOP142219).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2x3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
References
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