Interrogatorio paralelo del reclutamiento de la serie 2 para la detección de ligandos a escala de GPCR a escala mediante el ensayo PRESTO-Tango
Summary
Dado que los GPCR son objetivos atractivos para drogarse, el cribado de ligando GPCR es por lo tanto indispensable para la identificación de compuestos de plomo y para estudios de desorfanización. Hacia estos esfuerzos, describimos PRESTO-Tango, una plataforma de recursos de código abierto utilizada para la elaboración simultánea de perfiles de reclutamiento transitorio de é-arrestin2 en aproximadamente 300 GPCRs utilizando un ensayo de reportero basado en TEV.
Abstract
Como la superfamilia genética más grande y versátil y los mediadores de una gama de vías de señalización celular, los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) representan uno de los objetivos más prometedores para la industria farmacéutica. Ergo, el diseño, la implementación y la optimización de los ensayos de detección de ligandos GPCR es crucial, ya que representan herramientas de control remoto para el descubrimiento de fármacos y para manipular la farmacología y los resultados de GPCR. En el pasado, los ensayos dependientes de la proteína G tipificaran esta área de investigación, detectando eventos inducidos por ligandos y cuantificando la generación de mensajeros secundarios. Sin embargo, desde el advenimiento de la selectividad funcional, así como una mayor conciencia de varias otras vías independientes de la proteína G y las limitaciones asociadas con los ensayos dependientes de la proteína G, hay un mayor impulso hacia la creación de Ensayos de detección de ligando GPCR. Hacia este esfuerzo, describimos la aplicación de uno de esos recursos, la plataforma PRESTO-Tango, un sistema basado en reporteros de luciferasa que permite el interrogatorio paralelo y simultáneo del GPCR-ome humano, una hazaña que anteriormente se consideraba técnica y económicamente inviable. Sobre la base de un ensayo de reclutamiento independiente de proteínaS G, la universalidad del tráfico mediado por la toma de la empresa y la señalización en los GPCR hace de PRESTO-TANGO una herramienta adecuada para estudiar aproximadamente 300 receptores huérfanos. La sensibilidad y robustez de PRESTO-Tango lo hacen adecuado para pantallas primarias de alto rendimiento que utilizan bibliotecas compuestas, empleadas para descubrir nuevos objetivos GPCR para medicamentos conocidos o para descubrir nuevos ligandos para receptores huérfanos.
Introduction
Los receptores acoplados a proteínas G (GPCR) constituyen la familia más grande y diversa de proteínas transmembranas, que funcionan como interfaces de comunicación entre una célula y su entorno1. La versatilidad de los GPCR se destaca por su capacidad para detectar una amplia gama de ligandos, desde neurotransmisores hasta nucleótidos, péptidos a fotones, y muchos más, así como su capacidad para regular numerosas cascadas de señalización aguas abajo implicadas en el crecimiento celular, migración, diferenciación, apoptosis, disparo celular, etc.2,3. Teniendo en cuenta su ubicuidad e implicación en una multitud de procesos fisiológicos, esta familia de receptores es de suma importancia terapéutica, que se muestra por el hecho de que más de un tercio de los medicamentos prescritos actualmente disponibles se dirigen a los GPCRs4. Sin embargo, estas terapias existentes sólo se dirigen a un pequeño subconjunto de la superfamilia (se estima que el 10%), y la farmacología de muchos GPCR sigue sin aclararse. Además, más de 100 GPCRs existen como receptores huérfanos, ya que no han sido emparejados con un ligando endógeno5. Por lo tanto, el cribado de ligando GPCR es fundamental en la desorfanización y el desarrollo de fármacos, ya que allana el camino hacia el descubrimiento y optimización de plomo, y posiblemente a la fase de ensayo clínico.
Los métodos para el cribado de ligando GPCR han caído tradicionalmente en una de dos categorías, ensayos funcionales independientes de la proteína G o independientes de la proteína G6. La señalización GPCR está regulada por las proteínas G heterotriméricas , que se activan mediante el intercambio de GTP por el PIB consolidado en la subunidad7de la G. Las señales del receptor activado son transducidas por las proteínas G a través de mensajeros secundarios, tales como campo, calcio, DAG e IP3, para mediar la señalización aguas abajo en los efectores aguas abajo8. La naturaleza de las consecuencias funcionales de la señalización de proteína G se ha explotado para crear ensayos a base de células que reflejan la activación del receptor. Estos métodos, que miden eventos proximales (directos) o distales (indirectos) en la señalización de proteínas G, se utilizan con mayor frecuencia para el cribado de ligando GPCR y se han empleado principalmente en estudios de desorfanización6. Entre los ejemplos de ensayos que miden directamente la activación de proteínaG mediada por GPCR se incluyen el ensayo de unión [35S]GTP-S, que mide la unión de un análogo GTP radiomarcado y no hidrolizable a la subunidad De G, y de la transferencia de energía de resonancia de la bioluminiscencia (FRET/BRET, respectivamente) para monitorear las interacciones GPCR-G y G-G, que han ido ganando más tracción a lo largo de los años9,10. Los ensayos que supervisan los eventos distales son las herramientas más utilizadas para la generación de perfiles GPCR; por ejemplo, los ensayos de campo e IP1/3 miden la acumulación intracelular de mensajeros secundarios dependientes de la proteína G, mientras que los ensayos de flujo y reporteros [Ca2+]que implican elementos de respuesta específicos implicados en la activación de la proteína G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) examinan los acontecimientos posteriores a la cascada de señalización11. Si bien la mayoría de los ensayos antes mencionados se pueden realizar a un nivel de alto rendimiento, son bastante sensibles, y cuentan con ciertas ventajas específicas del ensayo (por ejemplo, discriminación entre agonistas completos/parciales, antagonistas neutrales y agonistas inversos en el caso de la unión GTP-S, o la funcionalidad de ensayo en células vivas como [Ca2+] e IP1/3)6, lamentablemente no hay métodos existentes dependientes de la proteína G que se ajusten al interrogatorio de todo el GPCR-ome farmacoliente. Esto se debe en gran medida al acoplamiento nativo de múltiples subfamilias de proteína G a los GPCR, lo que resulta en la señalización en varias cascadas y el acoplamiento desconocido de la proteína G en los GPCR huérfanos. Para mitigar este problema, se han desarrollado ensayos para forzar el acoplamiento promiscuo de proteína G a través de una única lectura de señalización común, como el campo, y Ca2+,aunque la mayoría de ellos son de bajo rendimiento12.
Un aspecto importante del ciclo de vida del GPCR es la terminación de la señalización dependiente de la proteína G, que se produce en gran parte a través del reclutamiento de arrestinas que induce la disociación de la proteína G, y en última instancia desensibilizar el receptor, que está dirigido a la internalización recubierta de clathrin13. Las isoformas más ubicuamente expresadas de la-arrestin son las no visuales de la palabra -arrestin1 y la de la detin2, también denotadas como arrestin-2 y arrestin-3, respectivamente14. Ingrese los ensayos basados en células independientes de la proteína G, que agregan una nueva dimensión al cribado de ligando GPCR; el tráfico de receptores, la célula entera sin etiquetas y los ensayos de reclutamiento de arrestinas son ejemplos notables. Los ensayos de tráfico de GPCR emplean ligandos etiquetados con fluoróforo o anticuerpos cointernalizados dirigidos al receptor15,mientras que los ensayos de células enteras sin etiquetas utilizan biosensores que traducen los cambios celulares inducidos por la unión de ligandos en salidas cuantificables, como señales eléctricas u ópticas16. En particular, las interacciones por excelencia de GPCR-arrestin como un ensayo de reclutamiento de arresten como una herramienta atractiva en el repertorio de ensayos funcionales17. El sistema Tango, desarrollado por primera vez por Barnea et al. hace sólo una década, implica la introducción de tres elementos genéticos exógenos: una fusión proteica consistente en é-arrestin2 con una proteasa del virus de la etch del tabaco (TEVp), un transactivador de tetraciclina (tTA) que se atan a un GPCR a través de un tabaco, etc. sitio de escovades de la proteasa del virus h (TEVcs) y está precedido por una secuencia del Término C del receptor de vasopresina V2 (cola V2) para promover el reclutamiento de arrestina, y un gen de luciferasa reportero cuya transcripción es desencadenada por el tTA factor de transcripción translocación al núcleo, que se libera del anclaje de membrana después de la contratación de la-arrestin2 (Figura 1)18. Las lecturas cuantitativas de la activación del GPCR y el reclutamiento de la lista 2 se pueden determinar posteriormente mediante la lectura de luminiscencia. Una distinción notable es que si bien el tráfico de receptores y los métodos de células enteras sin etiquetas son relativamente de bajo rendimiento, el Tango tiene varias ventajas, incluyendo la lectura selectiva que es específica del receptor objetivo y la sensibilidad debido a la integración de la señal, que lo convierten en un candidato adecuado para la detección de ligandos en una escala más grande18.
En vista de estas características estratégicas, Kroeze y otros desarrollaron PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), una plataforma de código abierto de alto rendimiento que utiliza el enfoque Tango para perfilar el GPCR-ome farmacogable de manera paralela y simultánea19. Aprovechando el reclutamiento “promiscuo” de la prueba de análisis de la palabra 2 a casi todos los GPCR, PRESTO-Tango es el primero de su tipo en términos de ensayos funcionales basados en células, lo que permite un cribado rápido de “primera ronda” de compuestos de moléculas pequeñas en casi todos los PCPR no olfativos, incluidos los huérfanos, independientes del acoplamiento de la subfamilia de proteínas G.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los GPCR dinámicos de conformación son potencias de transducción de señales. Las propiedades fisioquímicas de los bolsillos de unión de estos receptores hephelicales, así como su relevancia fisiológica subrayan la necesidad de herramientas de detección de ligando GPCR. Como se presentó anteriormente, el ensayo PRESTO-Tango es rápido, sensible y fácil de usar, prestándose al desarrollo de drogas. Este ensayo no sólo mide la activación inducida por agonistas, sino que también se puede utilizar para cuantifi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación Sanitaria (subvención de la CIHR #MOP142219).
Materials
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2×3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
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