Summary
Dato che i GPCR sono interessanti obiettivi drogabili, lo screening dei ligandi GPCR è quindi indispensabile per l'identificazione dei composti di piombo e per gli studi di deorfanotrizzazione. A fronte di questi sforzi, descriviamo PRESTO-Tango, una piattaforma di risorse open source utilizzata per la profilazione simultanea del reclutamento transitorio di z-arrestin2 a circa 300 GPCR utilizzando un test reporter basato su TEV.
Abstract
Essendo la più grande e versatile superfamiglia genica e mediatori di una serie di vie di segnalazione cellulare, i recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) rappresentano uno degli obiettivi più promettenti per l'industria farmaceutica. Ergo, la progettazione, l'implementazione e l'ottimizzazione dei saggi di screening dei ligandi GPCR è fondamentale, in quanto rappresentano strumenti di controllo remoto per la scoperta di farmaci e per la manipolazione della farmacologia e dei risultati del GPCR. In passato, i saggi dipendenti dalla proteina G caratterizzavano quest'area di ricerca, rilevando eventi indotti dal ligando e quantificando la generazione di messaggeri secondari. Tuttavia, dall'avvento della selettività funzionale, così come una maggiore consapevolezza di diversi altri percorsi indipendenti dalla proteina G e dei limiti associati ai saggi dipendenti dalla proteina G, c'è una maggiore spinta verso la creazione di alternative saggi di screening dei ligandi GPCR. A questo scopo, descriviamo l'applicazione di una di queste risorse, la piattaforma PRESTO-Tango, un sistema di giornalista luciferata luciferasi che consente l'interrogatorio parallelo e simultaneo del GPCR-ome umano, un'impresa che in precedenza era considerata tecnicamente ed economicamente irrealizzabile. Sulla base di un saggio di reclutamento indipendente indipendente dalla proteina G-arrestin2, l'universalità della tratta mediata da z-arrestin2 e della segnalazione presso i GPCR rende PRESTO-TANGO uno strumento adatto per studiare circa 300 GPD umani non olfattivi, tra cui circa 100 recettori orfani. La sensibilità e la robustezza di PRESTO-Tango lo rendono adatto per schermi primari ad alto rendimento utilizzando librerie composte, impiegati per scoprire nuovi obiettivi GPCR per farmaci noti o per scoprire nuovi ligandi per i recettori orfani.
Introduction
I recettori accoppiati alle proteine G (GPCR) costituiscono la più grande e diversificata famiglia di proteine transmembrane, operando come interfacce di comunicazione tra una cellula e il suo ambiente1. La versatilità dei GPR è evidenziata dalla loro capacità di rilevare una vasta gamma di ligandi – dai neurotrasmettitori ai nucleotidi, peptidi ai fotoni, e molti altri - così come la loro capacità di regolare numerose cascate di segnalazione a valle coinvolte nella crescita cellulare, migrazione, differenziazione, apoptosi, cottura cellulare, ecc2,3. Considerando la loro ubiquità e il coinvolgimento in una moltitudine di processi fisiologici, questa famiglia di recettori è della massima importanza terapeutica, dimostrare dal fatto che più di un terzo dei farmaci prescritti attualmente disponibili si rivolgono a GPCR4. Tuttavia, queste terapie esistenti si rivolgono solo a un piccolo sottoinsieme della superfamiglia (circa il 10%) e la farmacologia di molti GPCR rimane non chiarita. Inoltre, più di 100 GP esistono come recettori orfani, in quanto non sono stati abbinati a un ligando endogeno5. Pertanto, lo screening dei ligandi GPCR è fondamentale per la deorfamentizzazione e lo sviluppo di farmaci, in quanto spiana la strada verso la scoperta e l'ottimizzazione dei condotti e, eventualmente, verso la fase di sperimentazione clinica.
I metodi per lo screening dei ligandi GPCR sono tradizionalmente rientrati in una delle due categorie, le analisi funzionali indipendenti dalla proteina G o dalla proteina G6. La segnalazione di GPCR è regolata da proteine G eterotrimerici (G , g , che vengono attivate dallo scambio di GTP con il PIL vincolato alla sottounità7 diG . I segnali provenienti dal recettore attivato vengono trasdotti dalle proteine G tramite messaggeri secondari, come cAMP, Calcio, DAG e IP3, per mediare la segnalazione a valle agli effetti a valle8. La natura delle conseguenze funzionali della segnalazione delle proteine G è stata sfruttata per creare analisi basate sulle cellule che riflettono l'attivazione del recettore. Questi metodi, che misurano gli eventi prossimali (diretti) o distali (indiretti) nella segnalazione delle proteine G, sono più frequentemente utilizzati per lo screening dei ligandi GPCR e sono stati principalmente impiegati negli studi di deorfanotrizzazione6. Esempi di saggi che misurano direttamente l'attivazione delle proteine G mediate da GPCR includono il saggio vincolante [35S]GTP che misura il legame di un analogo GTP radioetichettato e non idrolizzabile alla sottounità di G, e il trasferimento di energia per la risonanza di F.risster/bioluminescenza (FRET/BRET, rispettivamente) sonde per monitorare le interazioni GPCR-G . I saggi che monitorano gli eventi distale sono gli strumenti più comunemente utilizzati per la profilazione GPCR; ad esempio, i saggi cAMP e IP1/3 misurano l'accumulo intracellulare di messaggeri secondari dipendenti dalla proteina G, mentre il flusso [Ca2]e i saggi di reporter che coinvolgono elementi di risposta specifici implicati nell'attivazione della proteina G (CRE, NFAT-RE, SRE, SRF-RE) esaminano ulteriormente gli eventi a valle della cascata di segnalazione11. Mentre la maggior parte dei suddetti saggi può essere eseguita a un livello di sono abbastanza sensibili, e vantano alcuni vantaggi specifici per l'analisi (ad esempio, la discriminazione tra agonisti completi/parziali, antagonisti neutri e agonisti inversi nel caso della rilegatura GTPS, o la funzionalità di analisi su cellule vive come [Ca2 ]e IP1/3)6, purtroppo non ci sono metodi dipendenti g-proteina esistenti che si adattino all'interrogatorio dell'intero GPCR-ome farmacologico. Ciò è in gran parte dovuto all'accoppiamento nativo di più sottofamiglie di proteine G ai GPCR, con conseguente segnalazione in diverse cascate e l'accoppiamento sconosciuto delle proteine G agli ORfani GPCR. Per mitigare questo problema, sono stati sviluppati saggi per forzare l'accoppiamento promiscuo di proteine G attraverso un'unica lettura comune di segnalazione, come il cAMP, e Ca2,anche se la maggior parte di essi sono a basso consumo12.
Un aspetto importante del ciclo di vita del GPCR è la cessazione della segnalazione dipendente dalle proteine G, che si verifica in gran parte attraverso il reclutamento di arresti z che induce ladissociazione della proteina G, e infine desensibilizzare il recettore, che è mirato per l'internalizzazione rivestita di clatra1in13 . Le isoforme più onnipresentisamente espresse di z-arrestin sono le non visive z-arrestin1 e z-arrestin2, indicate rispettivamente come arrestin-2 e arrestin-3, rispettivamente14. Inserisci i saggi basati sulle cellule indipendenti della proteina G, che aggiungono una nuova dimensione allo screening dei ligandi GPCR; il traffico di recettori, l'intera cellula senza etichetta e i saggi di reclutamento di arresto z sono tutti esempi degni di nota. I saggi di traffico di GPCR utilizzano ligandi con etichetta fluoroforo o anticorpi co-internalizzati che colpiscono il recettore15, mentre i saggi interi cellulari privi di etichetta utilizzano biosensori che traducono i cambiamenti cellulari indotti dal legame del ligando in output quantificabili, come i segnali elettrici o ottici16. In particolare, le interazioni per eccellenza nel GPCR- Il sistema Tango, sviluppato per la prima volta da Barnea et al. solo dieci anni fa, comporta l'introduzione di tre elementi genetici esogeni: una fusione proteica costituita da z-arrestin2 con proteasi del virus dell'incisione del tabacco (TEVp), un transattivatore di tetraciclina (tTA) legato a un GPCR tramite un virus dell'incisione del tabacco (TEVp), un transattivatore di tetraciclina (tTA) legato a un GPCR tramite un virus dell'incisione del tabacco sito di scissione di scissione (TEVcs) ed è preceduta da una sequenza del capoluogo C del recettore V2pressin (coda V2) per promuovere il reclutamento di arrestate, e un gene reporter luciferasi la cui trascrizione è innescata dal TTA fattore di trascrizione traslocazione al nucleo, che viene liberato dall'ancoraggio della membrana in seguito al reclutamento di z-arrestin2 (Figura 1)18. Le letture quantitative dell'attivazione della GPCR e del reclutamento di z-arrestin2 possono essere successivamente determinate leggendo la luminescenza. Una notevole distinzione è che mentre il traffico di recettori e i metodi interi cellulari privi di etichette sono relativamente a bassa velocità effettiva, il Tango ha diversi vantaggi, tra cui la lettura selettiva che è specifica per il recettore bersaglio e la sensibilità a causa dell'integrazione del segnale, che lo rendono un candidato adatto per lo screening dei ligandi su scala più ampia18.
In considerazione di queste caratteristiche strategiche, Kroeze e altri hanno sviluppato PRESTO-Tango (Parallel Receptor-ome Expression and Screening via Transcriptional Output-Tango), una piattaforma open source ad alta velocità che utilizza l'approccio Tango per profilare il GPCR-ome drogabile in modo parallelo e simultaneo19. Sfruttando il reclutamento "promiscuo" di z-arrestin2 in quasi tutti i GPR, PRESTO-Tango è il primo nel suo genere in termini di analisi funzionali basate sulle cellule, consentendo uno screening rapido "di primo round" di piccoli composti molecolari in quasi tutti i GPL non olfattivi, compresi gli orfani, indipendentedall'accoppiamento della sottofamiglia della proteina G.
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Protocol
1. Screening primario: coltura cellulare e semidici di placche
- Per preparare piastre rivestite in poli-L-lisina (PLL), erogare 20 gradi/pozzetto di una soluzione di riserva di 25 g/mL di PLL in piastre ottiche bianche o nere con un pipetta multicanale elettronico o un dispenser reagente. Incubare le piastre a temperatura ambiente per 0,5–2 h.
NOTA: Se si utilizzano le piastre nere 384-well, si aspettano che il segnale di sfondo sia inferiore rispetto alle piastre bianche. Si raccomanda nocedi nere per ridurre la smarginatura della luminescenza tra pozzi adiacenti. - Per conservare le piastre rivestite e lavare via il PLL in eccesso, rimuovere il PLL facendolo scorrere sul lavandino, toccare asciugare su un tovagliolo di carta e aggiungere 40 -L/pozza di soluzione 1x diluita di antibiotico-antimiotica utilizzando una pipetta multicanale elettronica o un dispenser reagente. Conservare le piastre rivestite di PLL a 4 gradi centigradi fino a quando non sono pronte per la semina delle piastre.
- Mantenere le cellule HTLA (gentilmente fornite dal Dr. Richard Axel) – una linea cellulare renale embrionale umana (HEK293T) che esprime stabilmente il 5% di fetale Bovine Serum, Il 5% del siero di vitello bovino, il 5,5 g/mL di puromicina, 50 g/mL di igromycin, 100 U/mL penicillina, e 100 g/mL streptomycin a 37 gradi centigradi in un incubatore umidizzato contenente 5% CO2.
- Coltura cellule HTLA in piatti 150 mm e passare le cellule due volte a settimana ad un fattore di diluizione di 1:10, con numero di passaggio cellulare ottimale di 5-25. Assicurarsi che un numero sufficiente di piatti da 150 mm sia confluente il giorno della semina a piastre 384-well, a seconda della scala dello schermo primario.
NOTA: l'uso di cellule HTLA superiori al passaggio 25 può comportare una riduzione della redditività, producendo risultati non ottimali. - Per semine di cellule HTLA per lo schermo primario, sciacquare delicatamente le parabole confluenti da 150 mm con 1x salina con buffer fosfato (PBS), pH 7.4. Staccare le cellule con circa 6 mL di 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA e trasferirle su un tubo di centrifuga contenente almeno la stessa quantità di Dulbecco del mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco per neutralizzare la trypsina.
- Abbassare le cellule HTLA a 500 x g per 3 min e sospendere nuovamente il pellet cellulare ad una densità di 0,22 x 106 cellule/mL in DMEM completo, omettendo l'aggiunta di 2,5 g/mL di metina e 50 g/mL di igromicina in quanto possono diminuire l'efficacia della trasparenza.
- Incubare le necessarie piastre rivestite di PLL a 37 gradi per riscaldarle prima di seminare le cellule. Rimuovere la soluzione di stoccaggio di 1x antibiotic-antimycotic dalle lastre rivestite di 384 pozze ll facendo scorrere la piastra sul lavandino e toccandola su un tovagliolo di carta per asciugarla.
- Le cellule di semi nelle lastre rivestite PLL a 384 pozzetti a densità finale di 10.000 cellule/pozzo, erogando 45 -L delle sospensioni 0,22 x 106 celle/mL HTLA utilizzando un pipet multicanale elettronico. Incubare le piastre a 37 gradi durante la notte. Se si preferisce una trasfezione nello stesso giorno, le cellule di semi ad una densità di 16.000 cellule/bene ed eseguono la trasfezione 4 h più tardi.
NOTA: per un'elevata efficienza di trasfezione, la confluenza cellulare del 50-70% è ottimale.
2. Screening primario: preparazione della piastra del DNA e trasfetazioni
- Per preparare la lastra di origine del DNA di 384 pozzetto per la trasfezione, come illustrato nella Figura 2,distribuire i cDNA plasmid che codificano i costrutti GPCR-Tango di interesse in una lastra di 96 pozze, con un GPCR/well diverso. Il DNA del plasmide deve essere sospeso nel buffer Tris-EDTA (TE) da 0,1x ad una concentrazione di 50 ng/L.
NOTA: Le lastre di DNA del 96 po' possono essere sigillate e conservate a -20 gradi centigradi e riutilizzate per più esperimenti di screening. Tutti i costrutti GPCR-Tango di codifica cDNA sono disponibili in commercio (vedere la Tabella dei materiali) e sono clonati nel plasmide neomicina pcDNA3.1. Il PRESTO-Tango GPCR Kit è costituito da quattro piastre da 96 pozzetti, che includono 80 GPCR ciascuno, un paio di pozzi con un vettore vuoto come controlli negativi, e pozzi di controllo positivi che detengono il recettore della dopamina D2 (DRD2), e pozzi che trasportano una codifica plasmide una proteina fluorescente (YFP) per monitorare l'efficienza della trasfezione. - Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire manualmente la soluzione del DNA dal pozzo 96 alla piastra di origine del DNA di 384 pozze, aggiungendo 10 L per 384-pozzetti. Per garantire che ogni condizione dell'esperimento sia analizzata in quadruplicato, metà della piastra di DNA a 96 ben (righe A-D o E-H) coprirà una piastra completa di 384 pozze didistribuzione di ogni GPCR in due quadranti (primo quadrante - - composto, secondo quadrante ) composto), in modo che lo stesso GPCR sarà trafitto in 8 pozzi della piastra 384-well (vedi Figura 2 come guida).
- Assemblare i seguenti reagenti di trasfezione necessari per il metodo di precipitazione del fosfato di calcio, come descritto da Jordan et al.20: 0.1x buffer TE (1 mM Tris-HCl e 0,1 mM EDTA); Soluzione CaCl2 da 2,5 M; 2x buffer di epes, pH 7,05 (50 mM HEPES, 280 mM NaCl, 1,5 mM Na2HPO4). Sterilizzare tutte le soluzioni filtrando e conservare a 4 gradi centigradi. Il giorno della trasfezione, consentire ai reagenti di raggiungere la temperatura ambiente prima dell'uso.
- Diluire la soluzione di 2,5 M CaCl2 in 0.1x TE (diluizione 1:8) per una concentrazione finale di 0.313 M CaCl2 e vortice. Trasferire 40 L di 0,313 M CaCl2 alla piastra di origine del DNA 384-well e mescolare pipetting su e giù con una pipetta multicanale portatile o un banco automatico 384-channel pipettor.
- Aggiungere 50 lof2x buffer di Hepes alla piastra di origine del DNA 384-well, mescolare di nuovo pipeting su e giù e lasciare riposare per 1 min; ogni 384-po 'di una quantità adeguata di miscela di DNA/trasfezione per la trasfezione di nove piastre 384-bene, a seconda del numero di composti che devono essere testati. Trasferire 10 L della miscela DNA/trasfezione dalla piastra di origine del DNA a 384 pozzetti alle cellule HTLA dei semi e incubare le piastre durante la notte a 37 gradi centigradi.
3. Screening primario: Stimolazione cellulare
- Ventiquattro ore dopo, decantare il supporto cellulare trascurato facendo scorrere delicatamente la piastra 384-well sopra il lavandino e toccandolo su un asciugamano di carta, o con una testa di aspiratore. Aggiungere lentamente 40 ll di supporti affamati (DMEM integrato con 1% diallyzed siero bovino fetale (dFBS) e 1x antibiotico/antimicotico), facendo attenzione a evitare di toccare direttamente le cellule.
- Pipet 20 - L of the compound of interest at a 3x concentration (la concentrazione finale del farmaco nella piastra cellulare sarà 1x) nelle file alternate con stimolazione (z) e 20 -L di cuscinetto del veicolo per le righe alternate senza (-) composto. Riportare la piastra cellulare a 37 gradi centigradi nel 5% di CO2 e incubare per almeno 16 h.
4. Screening primario: lettura della luminescenza
- Preparare il reagente Glo, modificato da Baker e Boyce21: 108 mM Tris–HCl; 42 mM Tris-Base, 75 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 5 mM Dithiothrei-tol (DTT), 0,2 mM Coenzyme A, 0.14 mg/ml D-Luciferin, 1.1 mM ATP, 0.25% v/v Triton X-100, 2 mM Sodium
NOTA: le soluzioni di riserva dei reagenti possono essere fatte in anticipo, ad eccezione di D-Luciferin, che viene sempre appena aggiunto al reagente Glo nella sua forma in polvere. Se sono state utilizzate piastre nere, la quantità di D-Luciferin può essere aumentata fino a 0,25 mg/mL. - A 16-24 h dopo la stimolazione, decantare il supporto cellulare trascurato facendo scorrere delicatamente la piastra 384-po'sul lavandino e toccandola su un tovagliolo di carta. Aggiungete 20 gradi di reagente Glo e incubate la piastra a temperatura ambiente per 5-20 min. Leggete le piastre utilizzando un contatore di luminescenza a microlamila, con un tempo di integrazione di 1 s/well.
5. Screening primario: analisi dei dati
- Esportare i file salvati dal contatore della luminescenza come foglio di calcolo; i risultati saranno registrati in unità di luminescenza relative (RLU). In base al layout della piastra 384-pozze, calcolare l'attivazione (cambiamento di piega) di ogni recettore utilizzando la seguente formula:
NOTA: Qui Sample RLU si riferisce al valore di ciascuno dei quattro pozzi replicati del quadrante stimolato (composto), RLU sfondo medio è la media dei controlli negativi sulla piastra, e basale medio RLU si riferisce alla media del quadrante non trattato di quello stesso recettore (- composto). Inoltre, calcolare la deviazione standard dei 4 punti dati per verificare la qualità dei risultati. Si consiglia di eseguire una trasformazione log2 sulla media delle modifiche di piegatura per rettificare qualsiasi eteroskedasticity; la base log2 è una scelta pratica per aiutare a identificare i risultati positivi. Empiricamente impostare le soglie di successo positivo; va notato che alcuni recettori possono avere basso come aumento di 2 volte e fino a 40 volte aumento per gli altri con agonista completa. - In base ai risultati, selezionare i GPCr che sono potenziali risultati positivi per lo screening secondario.
6. Screening secondario: semina cellulare e trasfetazioni
- Cellule HTLA di sottocoltura in piatti da 100 mm ad una densità cellulare totale di 5 x 106 cellule in 11 mL di supporti completi (4,55 x 105/mL) e incubare a 37 s per 24 h. Se si preferisce una trasfezione nello stesso giorno, le cellule di semi ad una densità di 7,5 x 106 cellule ed eseguono la trasfezione 4 h in un secondo momento.
- Preriscaldare i reagenti necessari per le precipitazioni di fosfato di calcio a temperatura ambiente. Unire 450 l l di 0,1 x di TE tampone con 50 , 2,5 M CaCl2 e rapidamente vortice; queste quantità sono specifiche per un piatto da 100 mm, in base al volume del mezzo di crescita che detiene.
- In un tubo, aggiungere 500 l della soluzione TE/CaCl2 a 10 g di GPCR cDNA e vortice. Aggiungere nel tubo 500 l di 2x soluzione cuscinetto per il tampone di epes, agitare vigorosamente (non vortice) e incubare per 1 min.
N.: 1 g di qualsiasi plasmide che codifica una proteina fluorescente (ad esempio YFP, mCherry, ecc.) può essere co-transfett con 9 g di CDNA GPCR per un totale di 10 g. La proteina fluorescente viene utilizzata per monitorare l'efficienza della trasfezione, e questa quantità minima non interferirà con il saggio. - Subito dopo la breve incubazione, dispensare la soluzione da 1 mL gocciola sulle cellule. Per sfoltire delicatamente la piastra avanti e indietro per distribuire uniformemente il precipitato, facendo attenzione a non ruotare la piastra, e incubare a 37 gradi centigradi per 24 ore.
- Il giorno seguente, osservare l'efficienza della trasfezione osservando l'espressione della proteina fluorescente sotto un imager cellulare fluorescente; trasfettazioni superiori al 50% di copertura sono l'ideale.
- Incubare le necessarie 384 catrine rivestite di PLL nell'incubatrice a 37 gradi centigradi per scaldarla prima di seminare le cellule. Rimuovere la soluzione di stoccaggio di 1x antibiotic-antimycotic dalle lastre rivestite di 384 pozze ll facendo scorrere la piastra sul lavandino e toccandola su un tovagliolo di carta per asciugarla.
- Sciacquare delicatamente le cellule trasinfettate con la soluzione Versene (1X PBS, pH 7.4; 0,53 mM EDTA) e staccarsi aggiungendo 3 mL di 0,05% di trypsin/0,53 mM EDTA al piatto. Trasferire il contenuto in un tubo di centrifuga contenente almeno una quantità uguale di DMEM completo per neutralizzare la trypsin.
- Ruotare le celle a 500 x g per 3 min e risospendere le celle ad una densità di 0,4 x 106 cellule / mL in supporti affamati. Le cellule di semi nelle lastre rivestite in PLL a 384 pozzetti rivestiti in PLL ad una densità finale di 25.000 cellule/bene erogando 45 ll della sospensione cellulare utilizzando un pipet multicanale elettronico. Riportare le piastre a 37 gradi centigradi per un minimo di 4 h, consentendo alle cellule di attaccarsi correttamente ai pozzi prima di procedere alla stimolazione.
7. Screening secondario: Preparazione della piastra di droga per la curva di dose a 16 punti (mezzo tronco)
- In una piastra di 96 pozze, aggiungere 270 l di 1X buffer di droga HBSS (1x Hank's Balanced Salt Solution [HBSS], 20 mM HEPES pH 7.4, 1x antibiotic-antimycotic), escludendo l'ultima riga (riga H) della piastra, come mostrato nella Figura 4.
NOTA: Per peptidi, molecole colloidali e composti scarsamente solubili in acqua, viene suggerita l'aggiunta di 0,1-1% di BSA. Per prevenire l'ossidazione dei farmaci, può essere aggiunto anche fino allo 0,01% acido ascorbico. - Dal broto del farmaco, preparare una soluzione farmacologica (indicata come la concentrazione "Alta") calcolando una concentrazione finale di 3x (la concentrazione finale del farmaco nella piastra cellulare sarà 1x). Ad esempio, per una curva dose-risposta con una concentrazione più alta di 10 M, preparare la concentrazione "Alta" a 30 M. Pipet 300 -L di concentrazione "Alta" in pozzi nella fila H.
- In un altro tubo, preparare la concentrazione "Bassa", che rappresenta la concentrazione "Alta" divisa per 3.16 (mezzo-log). Sulla base dell'esempio precedente, la concentrazione "Bassa" sarebbe di 9,49 M. Pipet 300 L di concentrazione "Bassa" in pozzi nella fila H, adiacenti ai pozzi "Alto".
NOTA: Il numero totale di 96-pozzi necessari nella fila H dipenderà dal numero di cellule e dalle condizioni di stimolazione. Quattro pozzi (due "Alto" e due "Basso") avrà un'ampia soluzione farmacologica per stimolare un intero 384 bene piatto. - Eseguire una diluizione seriale con il pipettaggio di 30 l di soluzione farmacologica dai pozzetti "Alto" e "Basso" della riga H alla riga precedente (riga G) e mescolare pipettando manualmente su e giù, o come consigliato, utilizzando una pipetta elettronica multicanale con la funzione "Pipette and Mix". Ripetere questo passaggio fino a quando la prima e più diluita riga (riga A), scartando le punte tra le diluizioni.
NOTA: se lo si desidera, le diluizioni seriali possono essere interrotte prima della riga A, che rappresenta un controllo interno senza alcun farmaco, in altre parole, un "true zero". - Utilizzando la Figura 4 come riferimento, stimolare le cellule trasfette con la pipipipenza di 20 gradi l della colonna "Bassa" diluizioni dalla piastra del pozzo 96 alle file A-O della piastra precedentemente semistata 384-well, così come 20L delle diluizioni di colonna "Alta" ai pozzi B-P. Incubare la piastra a 37 gradi centigradi per un minimo di 16 h.
8. Screening secondario: lettura della luminescenza e analisi dei dati
- A 16-24 h dopo la stimolazione, decantare il supporto cellulare trascurato facendo scorrere delicatamente la piastra 384-po'sul lavandino e toccandola su un tovagliolo di carta. Aggiungete 20 gradi di reagente Glo e incubate la piastra a temperatura ambiente per 5-20 min. Leggete le piastre utilizzando un contatore di luminescenza a microlamila, con un tempo di integrazione di 1 s/well.
- Esportare i file salvati dal contatore della luminescenza come foglio di calcolo; i risultati saranno registrati in unità di luminescenza relative (RLU). Trasferisci i dati della piastra 384-po ' a un software di statistiche per analizzare i risultati utilizzando la sua analisi XY integrata per adattarsi alla curva di regressione non lineare. Selezionare la funzione di stimolazione dose-risposta a 3 parametri integrata "Log(agonist) vs risposta (tre parametri)",
NOTA: Qui Top e Bottom sono altipiani nelle unità dell'asse Y, rispettivamente la risposta massima e il livello basale, EC50 è la concentrazione dell'agonista che genera una risposta del 50% tra Superiore e Inferiore, e X si riferisce alla concentrazione di log dell'agonista. Questo modello presuppone che la curva dose-risposta abbia una pendenza Hill standard di 1.
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Representative Results
Utilizzando il protocollo PRESTO-Tango presentato nel presente documento, un estratto di granulo cromaffina (CG) è stato esaminato contro 168 obiettivi GPCR non olfattivi, con la maggior parte dei quali sono recettori orfani. La profilazione di tale estratto è stata eseguita esaminando la mobilitazione di arresto z2 presso i recettori scelti, sulla base del principio progettato da Barnea et al.18 (Figura 1). Plasmid cDNA dei GPCR di interesse è stato preso dal kit PRESTO-Tango GPCR e assemblato in due 96 benpiatti nel layout desiderato. In totale, sono state trafettate quattro piastre di 384 pozzo con cellule HTLA, poiché ogni metà delle piastre di DNA del pozzo 96 è stata trasformata in una piastra completa di 384 pozzetti, con conseguente transinfezione di ogni recettore in due quadranti (otto 384-pozzi totali). Uno dei due quadranti è stato stimolato con l'estratto di CG; altre colonne C–D, G–H, K–L e O–P rappresentavano la stimolazione ( ) rappresentata dalla stimolazione (( Figura 2). Dei 168 GPCR che sono stati interrogati nello screening primario, solo due recettori erano contendenti come potenziali obiettivi attivi, in particolare il recettore della dopamina D3 (DRD3) e l'opsina 5 (OPN5). DRD3 ha prodotto una modifica significativa di 4,70, mentre OPN5 ha prodotto una risposta leggermente inferiore di 2,39, entrambi rispondendo alla soglia di soglia cut-off di log2 fold change >2. In confronto, il controllo positivo per lo schermo primario è stato DRD2 stimolato con quinpirole, un agonista selettivo di questo recettore, e ha prodotto un log2 fold change di 4.58 (Figura 3). Per riprodurre queste finestre di segnale ed eliminare la possibilità di colpi falsi positivi, è stato condotto uno schermo secondario con i recettori di cui sopra. Oltre a testare l'estratto di CG, dato che DRD3 è un recettore non orfano, un'altra condizione è stata preparata come un controllo positivo, in particolare la stimolazione con quinpirole, uno dei suoi agonisti selettivi. D'altra parte, OPN5 è un recettore orfano e come tale, nessun agonista di riferimento può essere testato insieme all'estratto di CG come un controllo positivo; solo buffer è stato testato come un controllo negativo. In particolare, le soluzioni di stock CG e quinpirole a 10 mM sono state diluite a 30 m e 9,49 M, le corrispondenti concentrazioni "High" e "Low" nella riga inferiore (riga H) della piastra di 96-drug; queste formulazioni diventeranno 10-5 M e 10-5,5 M una volta che 20 -L sarà erogato sulle cellule trascurate in 40 -L di mezzo affamato, per un totale di 60 gradi all'interno di ogni 384-bene. Come descritto in precedenza, le diluizioni seriali sono state eseguite in modo tale che le formazioni di droga più diluite per 10-12 M e 10-12,5 M si trovino nella riga superiore (riga A) (Figura 4). Le curve dose-risposta dallo screening secondario sono state create utilizzando GraphPad Prism per valutare la potenza e l'efficacia del ligando. Rispetto al quinpirole, l'estratto di CG ha prodotto finestre di segnale simili e valori EC50, confermando ne è la validità come un colpo attivo a DRD3. Tuttavia, è stata prodotta una curva di dose piatta simile al controllo negativo per OPN5, escludendola come possibile obiettivo per l'estratto di CG (Figura 5).
Figura 1: Progettazione modulare dei costrutti TANGO (A) e schema generale per il saggio di assunzione di z-arrestin (Tango) (B). (A) I costrutti di tango GPCR sono costituiti da vari elementi del modulo nel seguente ordine: un segnale HA/flag tag, il CDS GPCR, un recettore Vasopressin 2 coda C-terminale, teV protease scissione e un fattore di trascrizione tTA. (B) Il principio dell'assaggio tango prevede la traduzione transitoria dei plasmidi del tango GPCR nelle cellule HTLA, le cellule HEK293T esprimono stabilmente una proteina di fusione proteae di teV-arrestatoin2 e un gene di reporter luciferasi la cui espressione viene attivata dalla tTA. L'attivazione del GPCR alla fine comporterà la mobilitazione del teV di z-arrestin2-TEV al recettore, portando la proteasi in stretta vicinanza al suo sito di scissione. Di conseguenza, il tTA viene sposto dalla coda GPCR, liberando il fattore di trascrizione per traslocare nel nucleo e attivare l'espressione luciferale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Layout della piastra cDNA 96-well e piastra cellulare 384-bene per la trasfezione e la stimolazione nello screening primario PRESTO-TANGO. Rappresentazione della preparazione di una piastra di origine cDNA 384-well per la trasfezione, i costrutti di tango GPCR vengono prima trasferiti da una metà di una piastra di 96 pozzetti in una piastra completa di 384 pozzetti, con ogni recettore trasvenuto in ottavo. In questa impostazione, la stimolazione delle cellule con ( ) e senza (-) il farmaco(s) di interesse si verificherà in quadruplicato per ogni singolo recettore. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentazioni grafiche dell'identificazione dei colpi dallo screening primario PRESTO-Tango. Come prova di concetto, è stata analizzata l'attività biologica di un estratto di granulo di cromofaffina (CG) sulla GPCRom. Le cellule HTLA sono state traffettate in 384 piastre di pozzo con 168 costrutti di tango GPCR, e sia stimolato con l'estratto di CG (composto) o con buffer veicolo (- composto). pcDNA3.1 è stato utilizzato come controllo negativo, e il recettore DRD2 stimolato con quinpirole è stato utilizzato come controllo positivo. Le finestre di segnale (A) e il cambiamento di piegatura log2 (B) nell'attivazione del recettore è stato calcolato tra i pozze in assenza o presenza di estratto CG. Tutte le barre di errore rappresentano SD (n - quattro misure). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Layout della preparazione della piastra di droga di 96 pozzeperli per la stimolazione nello screening secondario. Rappresentazione della preparazione di una piastra antidroga di 96 pozze per la stimolazione cellulare, le diluizioni seriali per un intervallo di curva di dose di 16 punti partono da 10-5 M (concentrazione finale) nella fila H, con intervalli di mezzo log tra ogni punto fino a 10-12,5 M nella riga A. colonne di droga "Alto" e "Basso" per stimolare l'alternanza di file del seme 384-bene piastra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Risposte della curva di dose per la profilazione composta e la dimostrazione del reclutamento di z-arrestin2 nei GPCR nello screening secondario. Le cellule HTLA sono state trasinate transitoriamente con i recettori DRD3 (A) e OPN5 (B). Entrambe le condizioni trasfette sono state stimolate con un estratto di CG con incrementi di mezzo registro, così come il quinpirole agonista specifico di DRD3 come controllo positivo e buffer del veicolo per OPN5 come controllo negativo. Tutte le barre di errore rappresentano SD (n - tre misure). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
I GPCR conformazionalmente dinamici sono centrali elettriche di trasduzione del segnale. Le proprietà fisiochimiche delle tasche di legame di questi recettori eptahelici, così come la loro rilevanza fisiologica sottolineano la necessità di strumenti di screening dei ligandi GPCR. Come presentato in precedenza, l'analisi PRESTO-Tango è rapida, sensibile e user-friendly, prestandosi allo sviluppo di farmaci. Non solo questo saggio misura l'attivazione indotta dagli agonisti, ma può anche essere utilizzata per quantificare l'attività di antagonisti e modulatori allosteric19. Alla luce della selettività funzionale, un concetto che suggerisce che diverse strutture farmacologiche possono suscitare diverse cascate di segnalazione del recettore su un singolo recettore, confrontando l'attivazione del percorso della proteina G utilizzando i saggi dipendenti dalla proteina G con il reclutamento di z-arrestin utilizzando il reclutamento di z-arrestin utilizzando il singolo effetto di piombo con effetti collaterali negativi ridotti. In particolare, la sua indipendenza dal rilevamento dell'accoppiamento delle proteine G aiuta a identificare i partner di accoppiamento per i GPCR orfani che non sarebbero stati precedentemente rilevati dai saggi dipendenti dalla proteina G.
Per garantire la coerenza e la robustezza degli schermi PRESTO-Tango, è necessario prestare attenzione a tutte le fasi del protocollo, poiché le perturbazioni introdotte saranno amplificate a causa della natura di questa piattaforma. Naturalmente, ci sono misure generali comuni a tutti gli schermi HTS che dovrebbero essere presi in considerazione, come l'utilizzo di reagenti dello stesso lotto / formulazione per garantire la stabilità identica e l'attività biologica in tutto, oltre a mantenere le condizioni sul sistema HTS coerenti come la densità di semina cellulare e il tempo di incubazione del farmaco. Il formato miniaturizzato di PRESTO-Tango richiede attenzione a un paio di punti critici: la variazione nella densità di semina cellulare e la loro distribuzione omogenea (agglomerazione contro sospensione a singola cellula) tra pozzi, bassa efficienza di trasfezione e scarsa stimolazione e consegna composta di composti impediranno la riproducibilità quotidiana e la piastra a piastra. A tal fine, triturare la sospensione cellulare HTLA per omogeneizzare la soluzione prima della semina e garantire una confluenza cellulare del 50-70% prima della trasfazione. Il veicolo per la consegna dei composti deve essere verificato, con il solforosi dimetilo che è il vettore più comune. Tipicamente, la più alta concentrazione delle nostre curve di dose è di 10 M, ma questo può cambiare a seconda della natura e della potenza del composto; è importante testare varie concentrazioni per dedurre la tolleranza cellulare e la tossicità.
Dato che alcuni GPCR hanno un'elevata attività costitutiva, un problema che può sorgere durante lo screening è un intervallo dinamico ridotto e un segnale di fondo superiore al previsto. Questo può essere un po 'mitigato assicurando che la fame di siero viene eseguita con media DMEM integrato con 1% dFBS. Va preso in considerazione che se l'uscita di luminescenza è abbastanza alta, ci può ancora essere sanguinamento-attraverso in pozzi adiacenti, che possono provocare cambiamenti di piega erroneamente calcolati. I segnali non rilevabili o bassi (supponendo che sia prevista una risposta) possono essere spiegati in diversi modi, vale a dire scarsa espressione di GPCR (s) nelle cellule HTLA, l'attività biologica del composto viene persa rendendolo inefficace, o i recettori in questione non reclutano intrinsecamente z-arrestin2. Rispettivamente, valutare la quantità e la qualità del DNA del recettore plasmid trasfetato, testare altri preparati/lotti del composto inefficace in questione e eseguire tecniche di interazione proteina-proteina ortologere come BRET/FRET o co-immunoprecipitazioni sono alcune soluzioni suggerite a questo problema. Inoltre, l'espressione del recettore potrebbe anche essere migliorata subclonando i recettori Tango di interesse in vettori lentivirali e trasdusegnando le cellule HTLA, generando una linea cellulare stabile HTLA-GPCR. Un cambiamento nella potenza prevista di un agonista durante lo screening secondario potrebbe implicare che il tempo di stimolazione del farmaco e/o la concentrazione di composto necessario per stimolare una risposta è insufficiente o che le diluizioni seriali della piastra di droga sono state preparate in modo errato. L'uso di una pipetta elettronica multicanale o di un sistema automatico di pipettor senza cambiare suggerimenti durante la creazione di diluizioni seriali di droga potrebbe essere un problema quando si lavora con composti appiccicosi.
Notevoli differenze tra l'analisi Tango originale sviluppata da Barnea et al.18 e la piattaforma PRESTO-Tango includono la progettazione del recettore in un formato modulare, costituito da sequenze ottimizzate per codon, che migliora l'espressione del recettore nelle cellule dei mammiferi, i tag dell'epitopo per convalidare tale espressione e siti di restrizione che affiancano i GPCR, la coda V2 e il TEVcs-tTA, consentendo l'escissione di parti e subcloning. Ancora più importante, PRESTO-Tango supera il saggio Tango in termini di potenza di screening e design sperimentale. Il test quadruplicato del campione di circa 300 GPCR viene effettuato solo in 8 lastre ben 384, tenendo conto dei controlli negativi sui retrossimi e dei controlli positivi per monitorare l'efficienza della trasfezione. Mentre PRESTO-Tango è adatto per lo screening del GPCR-ome con un solo composto di interesse, l'interrogatorio con più leganti può anche essere eseguito, anche se a costi diversi e l'uso di risorse, come con librerie composte di piccole molecole raggruppate o di serie o campioni biologici che consistono di miscele di varie entità chimiche. Certo, questo problema può essere attenuato riducendo il numero di composti da interrogare eseguendo analisi di somiglianza chimica e diversità delle librerie composte in questione. Mentre la piattaforma PRESTO-Tango è più applicabile ai fini dello screening primario, la profilazione secondaria può essere eseguita su scala più piccola, in formati a media o bassa velocità, per confermare le conseguenze funzionali della stimolazione del ligando. Tuttavia, come per tutti gli altri saggi di GPCR, va riconosciuto che non ci sono controlli positivi adatti per i recettori orfani durante lo screening secondario con il saggio Tango. Tuttavia, i potenziali risultati positivi possono essere identificati se i dati di uscita possono essere montati su una curva sigmoidal dose-risposta, con una finestra di segnale computerato e un valore EC50. È anche importante notare che il meccanismo di attività del ligando, sia per i recettori orfani o non orfani, non può essere chiarito senza eseguire saggi paralleli.
Con tutti i componenti di PRESTO-Tango già ottimizzati, tra cui la linea cellulare HTLA e i costrutti GPCR Tango, è necessario poco spazio per la modifica a parte la scelta della formulazione composta (s) da utilizzare per la stimolazione dei farmaci. Se lo si desidera, una linea cellulare HTLA che esprime stabilmente un recettore può essere facilmente generata clonando il recettore GPCR-Tango all'interno del vettore pIRESbleo3 consigliato (Clonetech) e selezionando cloni utilizzando la zeocina. Per quanto riguarda lo scambio da pcDNA3.1 a pIRESbleo3, è sufficiente digerire il costrutto GPCR Tango con NotI e XbaI e inserirlo nel vettore di destinazione nei siti di restrizione NotI e NheI. Nonostante ciò, ci sono strade per adattare e ottimizzare questa tecnologia. Uno dei pilastri di questa tecnologia sono le cellule HTLA, una linea cellulare HEK293T che esprime stabilmente un gene di fusione di TEV-arresto zin2 e un giornalista di luciferasi dipendenti dalla tTA, gentilmente fornita dal laboratorio di Richard Axel. Mentre è una componente cruciale di PRESTO-Tango, attualmente non ci sono altre alternative in termini di origine della linea cellulare, o dei geni che esprimono. Inoltre, le future linee cellulari ingegnerizzate possono essere generate per esprimere altri geni di fusione TEV per tracciare altre proteine oltre a z-arrestin2, in particolare quelle che sono state precedentemente mostrate per interagire o reperibili in residenza ai GPCR, come 14-3-322, SAP9723e -arrestin1, che è l'isoformazione prevalente di arresti non visivi nei vertebrati24. Questo può essere ottenuto utilizzando le cellule HTL parentali che contenevano esclusivamente il reporter luciferasi controllato dal promotore tetO7. Una limitazione a PRESTO-Tango è l'attivazione non specifica del promotore reporter. Sulla base di un sistema normativo dipendente dalla tetraciclina (sistema tet), l'elemento tetraciclino-reattivo (TRE) controlla l'espressione del reporter luciferate a valle. Tuttavia, studi precedenti hanno dimostrato espressione "persa" di luciferasi a causa di fattori di trascrizione endogeni25,26. Di conseguenza, alcuni composti potrebbero attivare il reporter indipendentemente dal reclutamento o dall'attivazione di GPCR, aumentando il numero di falsi positivi. Un altro problema che emerge, comune anche ad altri metodi HTS, sono "battitori frequenti", composti promiscui che stimolano risposte sostanziali in diversi obiettivi27. Ciò nonostante, il set-up di screening parallelo del PRESTO-Tango facilita l'identificazione di questi artefatti, che possono essere ulteriormente testati per confermare il loro effetto sull'attività di luciferasi. Complessivamente, PRESTO-Tango ha fornito solide basi per lo studio del reclutamento di arrestin ai GPDR, e nel più ampio schema di scoperta di farmaci, come utile strumento di screening e deorfamentazione dei ligandi GPCR.
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Disclosures
Gli authour non dichiarano interessi concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dai Canadian Institutes of Health Research (CIHR grant #MOP142219).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, BLACK, with lid, Sterile | NUNC | 12-566 | |
| 384 Well Optical Bottom Plates, Polystyrene Polymer Base, Cell Culture Treated, White, with lid, Sterile | NUNC | 12-566-1 | |
| 384 Well Round Bottom, Polypropylene, Non-Treated, Blue, non-sterile, without lid | ThermoFisher | 12-565-390 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Wisent | 450-115-EL | |
| D-Luciferin, sodium salt | GoldBio | LUCNA | |
| DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10-013-CV | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 15–300 µL | Eppendorf | 4861000155 | |
| Eppendorf Xplorer, 12-channel, variable, 5–100 µL | Eppendorf | 4861000139 | |
| Matrix Platemate 2x3 | ThermoFisher | 801-10001 | |
| MicroBeta 1450 Wallac | Perkin Elmer | ||
| Penicilin-Streptomycin | Wisent | 450-201-EL | |
| Poly-L-Lysine hydrobromide | Millipore-Sigma | P2636-500MG | |
| Roth Lab PRESTO-Tango GPCR Kit | Addgene | Kit #1000000068 |
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