Summary
En protokol er beskrevet for in situ perfusion af musen underkroppen, herunder blæren, prostata, kønsorganer, knogle, muskel og fod hud.
Abstract
Ex vivo perfusion er et vigtigt fysiologisk redskab til at undersøge funktionen af isolerede organer (f.eks. lever, nyrer). På samme tid, på grund af den lille størrelse af museorganer, ex vivo perfusion af knogler, blære, hud, prostata, og reproduktive organer er udfordrende eller ikke muligt. Her rapporterer vi for første gang en in situ lavere krop perfusion kredsløb i mus, der omfatter ovenstående væv, men omgår de vigtigste clearance organer (nyre, lever, og milt). Kredsløbet er etableret ved cannulating abdominal aorta og ringere vena cava over iliaca arterie og vene og ætsende perifere blodkar. Perfusion udføres via en peristaltisk pumpe med perfusatflow vedligeholdt i op til 2 timer. In situ farvning med fluorescerende lectin og Hoechst opløsning bekræftede, at mikrovasculature blev gennemtritueret med succes. Denne musemodel kan være et meget nyttigt redskab til at studere patologiske processer samt mekanismer af lægemiddellevering, migration / metastase af cirkulerende tumorceller i / fra tumoren, og interaktioner af immunsystemet med perfunderede organer og væv.
Introduction
Isoleret organperfusion blev oprindeligt udviklet til at studere organfysiologi til transplantation1,,2,3, og aktiveret forståelse af funktioner af organer uden indblanding fra andre organsystemer. For eksempel, isolerede nyre og hjerte perfusion var uhyre nyttig i forståelsen af grundlæggende principper for hæmodynamik og virkninger af vasoaktive stoffer, mens leveren perfusion var vigtigt at forstå den metaboliske funktion, herunder lægemiddelmetabolisme i sunde og sygevæv 4,5,6,7. Desuden var perfusionsundersøgelser afgørende for forståelsen af levedygtigheden og funktionen af organer, der er beregnet til transplantation. I Cancer Researchearch, isolerede tumor perfusion er blevet beskrevet af flere grupper ved hjælp af mus, rotte, og frisk resected humane væv8,9. I nogle isolerede tumor perfusion, tumoren blev implanteret i æggestokkene fedt pad til at tvinge væksten af tumor leverer blodkar fra mesenteri arterie10. Jain-gruppen udførte banebrydende undersøgelser ved hjælp af isolerede perfusion af kolon adenocarcinomer at forstå tumor hæmodynamik og metastase8,,11,,12,13. Andre innovative manipuleret ex vivo opsætninger omfatter en 96-godt plade-baseret perfusion enhed til kultur den primære menneskelige myelomatoseceller 14 og en modulær flow kammer for engineering knoglemarvsarkitektur og funktion forskning15.
Ud over fysiologi og patologi undersøgelser, organperfusion er blevet brugt til at studere de grundlæggende principper for lægemiddellevering. Således beskrev en gruppe isoleret rotteekstremitetperfusion og studerede akkumulering af liposomer i implanteredesarkomer 16, mens en anden gruppe udførte dissekeret human nyreperfusion for at studere endotelmålretningen af nanopartikler17. Ternullo et al. brugte en isoleret perfunderet menneskelig hudflap som en nær-til-in vivo hudstof penetration model18.
På trods af disse fremskridt i perfusion af store organer og væv, der har været nogen rapporter om in situ perfusion modeller i mus, der: a) omgå clearance organer såsom lever, milt og nyrer; b) omfatter bækkenorganer, hud, muskler, kønsorganer (hos mænd), blære, prostata og knoglemarv. På grund af disse organers lille størrelse og den leverende vaskulatur har ex vivo-kanylering og etablering af et perfusionskredsløb ikke været muligt. Musen er den vigtigste dyremodel inden for kræft- og immunologiforskning og lægemiddellevering. Evnen til at gennemgå små museorganer ville give interessante spørgsmål vedrørende levering af lægemidler til disse organer, herunder til tumorer implanteret i bækkenet (blære, prostata, æggestok, knoglemarv), der skal besvares, samt undersøgelser af grundlæggende fysiologi og immunologi af sygdomme i disse organer. For at afhjælpe denne mangel udviklede vi et in situ perfusion kredsløb i mus, der potentielt kan undgå vævsskade og er meget bedre egnet til funktionel forskning end isoleret organperfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder, der er beskrevet her er blevet godkendt af University of Colorado's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Forvarm perfusionssystemet
- Forbered perfusionssystemet før operation ved at starte et 37 °C cirkulerende vandbad til alle vandjakkede komponenter (perfusatbeholder, fugtigt kammer og låg) som vist i en tilpasset konfiguration i figur 1A. Sørg for, at slangen er ren, og udskift om nødvendigt. For at begrænse perfusatvolumen skal der anvendes en boblefælde i et fugtigt kammer som perfusatbeholder (figur 1B-6).
2. Vaskulær kateterisation
- Induceseri anæstesi i en 8-10 uger gammel BALB/c mus ved hjælp af en isofluran veterinær anæstesi maskine med 3-5% isofluran og ilt flow på 0,3 L / min. Som et alternativ, bruge ketamin/xylazin eller enhver anden form for intraperitoneal anæstesi. Vurder dybden af anæstesi ved 2 metoder: tå-knivspids og hornhinde refleks.
- Prewet en 4-0 silke sutur med nål i dobbelt destilleret vand.
- Placer den anesthetized mus i en liggende position på en Styrofoam bord med hovedet vender kirurgen og immobilisere forelimbs og bagben med tape. Tør maven med isopropyl alkohol og skære maven langs midterlinjen i en "T" form med en saks. Stop blødning omkring kanten af snittet ved elektrokoagulation (cauterizing).
- Skub maven, jejunum og tyktarmen til højre side af maven for at afsløre abdominal aorta, vena cava, og fælles iliolumbar arterier og vener.
- Under en dissektion mikroskop, finde og ligate iliolumbar arterie / vene i hannen, og æggestokkene arterie / vene og iliolumbar arterie / vene i den kvindelige ved hjælp af 4-0 silke suturer (Figur 2 gule linjer).
- Under en dissektion mikroskop, loop to 4-0 silke suturer under abdominal aorta og ringere vena cava (ca. 1 cm over iliaca arterie og vene, 1 mm fra hinanden, Figur 2), og gøre en løs knude i suturen tættest på iliaca fartøjer(Figur 2, hvid stiplet linje). Alternativt kan en 6-0 silke sutur bruges til denne knude.
- Under en dissektion mikroskop, vandret tilpasse og strække både ringere vena cava og abdominal aorta med porte-aiguille. Brug et 24 G bevinget afskærmet I.V. kateter til at punktere abdominal aorta, tryk på knappen for at trække nålekernen tilbage og indsætte kateteret ca. 5 mm i karret.
- Gentag den samme procedure med den ringere vena cava og binde knuder af begge suturer omkring kateteriserede fartøjer.
BEMÆRK: Nålen kan nemt punktere gennem blodkarret; Hold derfor fartøjerne strakt og nålen parallelt med karret. Træk nålekernen tilbage, så snart nålen trænger ca. 1 mm ind i karret. Den abdominale aorta er under ringere vena cava og meget tyndere og mere elastisk på grund af at være indkapslet i bindevæv. Derfor kan aorta "holde på" til kateteret, og bør derfor kateteriseres før vena cava at reducere sandsynligheden for kateteret glider ud.
- Gentag den samme procedure med den ringere vena cava og binde knuder af begge suturer omkring kateteriserede fartøjer.
- Påfør øjeblikkelig lim til immobilisere katetre til erector spinae, erstatte abdominale organer, og afslutte operationen og samtidig opretholde anæstesi.
BEMÆRK: Organer, der ikke kan udskiftes helt ind i bughulen, skal med jævne mellemrum fugtes med perfusionsmedium under perfusionsprocessen.
3. Konfigurer perfusionssystemet
- Musen overføres til det vandjakkede fugtige kammer førvarmet til 37 °C på en siliciumpude, og katetatorvingerne immobiliseres til puden med 19 G-nåle.
- Fyld arterielkatetrets ende (indløb) med forvarmet perfusionsbuffer (Ringers laktatopløsning suppleret med 5% BSA), og tilslut derefter kateterenden med indløbsperfusionsslangen ved hjælp af et skrue-on-stik (Figur 1B, rød pil).
BEMÆRK: Hold stikket med hæmostatisk tapper, og immobilisere slangen med tape for at undgå at flytte katetrene. - Juster den peristaltiske strømningshastighed til 0,6 ml/min. og hold perfusionudløbet(Figur 1B, blå pil) åbent i 5-10 min for at vaske blodet ud gennem venekateteret. Der vil være nogle blodpropper i udløbskatetret; blodpropperne med perfusatbuffer, før perfusionskredsløbet lukkes.
- Tilslut venekatetrets ende med udløbsslangen ved hjælp af et skruestik for at lukke kredsløbet (Figur 1B). På dette tidspunkt, udføre CO2 gas eutanasi og kontrollere ved brystet punktering eller enhver anden metode.
- Dæk det fugtige kammer med det varme låg. Kontroller niveauet af perfusat med jævne mellemrum og tilføje mere, hvis det er nødvendigt. Perfusion kan udføres i op til 2 timer.
BEMÆRK: Der skal bruges 5 ml perfusat for at opsætte det lukkede perfusionssystem. Hvis der ikke er nogen lækage eller ødem, vil mængden af perfusat falde med mindre end 1 ml, og yderligere buffer vil ikke være nødvendig. For at undgå ødem induceret af perifert cirkulerende trombe, perfusion buffer indeholdende 0,002% heparin kan anvendes i de første 10 minutter af perfusion, men bør ændres til buffer uden heparin for at undgå utæt på kanten af indsnit. - Om nødvendigt tilsættes et reagens i perfusionsbeholderen eller til injektionsporten når som helst (figur 1B-5). For eksempel kan 10 μL af 10 mg/ml Hoechst33342 tilsættes i perfusatet for at plette cellekernerne 2 timer før enden af perfusion, eller 50 μL 1 mg/ml DyLight 649-lectin for at plette de vaskulære endotelceller 30 min før enden af perfusion.
BEMÆRK: Hvis der forsøges at plette knoglemarven med Hoechst-opløsning, skal musene forindsprøjtes 30 minutter før operationen. - Efter perfusion med fluorescerende reagenser, vaskes ud med perfusion buffer i yderligere 10 minutter for at minimere baggrunden fluorescens.
4. Analyse af perfunderede organer
- Indsamle organer, herunder testik, prostata, blære, lårben, muskel, og hud (f.eks fødder). Punktafgifter et stykke organ omkring 1 mm3 og flade mellem to glas dias.
- Undersøgelse under inverteret fluorescerende konfokal mikroskop ved hjælp af DAPI/Cy5 excitation og emissionsfiltre (excitation lasere: DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). Brug mindst 200x forstørrelsesmål med en 0,45 numerisk blænde.
- Alternativt kan organerne repareres med 4% formaldehydopløsning i 24 timer, og hæmatoxylin-eosin farvning19.
- For at skabe et knoglevindue til intakt knoglemarvsobservation immobiliseres begge ender af lårbenet eller skinnebenet og skraber den kortikale knogle væk med den laterale kant af en 19 G nål for at eksponere periosteum; pas på at holde et tyndt lag af resterende knogle. Placer knoglen på et dæksel slip med vinduet vender glasset og billedet med omvendt fluorescerende confocal mikroskop ved hjælp af DAPI og Cy5 kanaler som beskrevet ovenfor. Cellerne og vaskulære netværk i knoglemarven hulrum kan let observeres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har oprettet et lukket kredsløb perfusion system gennem cannulation af abdominal aorta og ringere vena cava af 8-10 uger gamle mus og samtidig holde mængden af perfusion buffer mindre end 10 ml. Figur 3A viser konfosale billeder efter perfusing af væv med Ringers opløsning indeholdende Hoechst 33342 og DyLight 649-lectin. Muskel, knoglemarv, testik, blære, prostata, og fodhud viser effektiv nuklear og vaskulær farvning. Figur 3B viser hæmatoxylin-eosin farvning af organer efter 3 timers normoterm perfusion.
Figur 1. Forenklet perfusion setup. (A)Systemet omfatter (1) en tryk-/strømningshastighedsregulator, (2) et cirkulerende opvarmet vandbad, (3) et opvarmet fugtigt kammer med opvarmet dæksel og brugerdefineret Styrofoam afstandsenhed og (4) en peristaltisk pumpe. (B) Perfusionkredsløbet viser indløb (røde linjer) og udløb (blå linjer), (5) injektionsporten og (6) det tilpassede perfusionsreservoir. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Placering af ligelagte og konybede blodkar i han- og hunmus. For at skitsere blodkarrene, 5 μL/kg af 1% Evans Blå farvestof blev tilføjet til perfusion medium 30 min før udgangen af perfusion. Hos hunmus er både iliolumbar og ovariearterier og vener ligated. Hos hanmus er iliolumbar arterie og vene ligated. Gule og hvide linjer viser omtrentlig position af ligationsknuder; gule pile viser faktiske suturer og knuder. Både vene- og arterielle katetre indsættes. Tarmene blev fjernet til demonstration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Konfocytring og H & E billeder viser vellykket perfusion af organer i 3 timer uden synlige vævsskade. Konfocyt vægtbar: 20 μm for knoglemarv og 100 μm for andre organer. H&E skala bar: 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det beskrevne kredsløb kan bruges til at sonde forskellige forskningsspørgsmål, for eksempel den rolle, som forskellige serumkomponenter og vævsbarrierer i lægemiddellevering, eller immun-og stamcellehandel. Forskellige lægemiddelleveringssystemer (f.eks. liposomer og nanopartikler) kan føjes til perfusatet for at forstå de fysiologiske og biokemiske faktorers rolle i leveringen. Varigheden af perfusion kan variere, afhængigt af det undersøgte væv, videnskabelige mål, og sammensætningen af perfusat. Vi præsenterer her resultaterne af perfusion op til 2 timer ved hjælp af en grundlæggende perfusion medier bestående af Ringer's opløsning med laktat og albumin. Det skal bemærkes, at målet med det nuværende arbejde var at etablere perfusion kredsløb i stedet for at udvikle og optimere perfusion medium og betingelser for at støtte optimal organ / væv funktion og iltning. Tilsætning af næringsstoffer, vitaminer, hormoner, og blodlegemer er blevet grundigt undersøgt i den foregående litteratur, og talrige perfusion medier og iltning protokoller er blevet beskrevet i snesevis af forskning publikationer i menneskers og dyrsvæv 7,9,10,11,12,13,16,17,,20,21. Forbedringer af perfusatsammensætningen samt iltning kan muliggøre langsigtet vedligeholdelse af vævsmetabolisme ved kropstemperatur. Således, nogle grupper anvendes røde blodlegemer og blod iltning, hvilket i høj grad forbedrer levedygtigheden af følsomme væv17. Perfusion kontrol er også meget tilpasselig; om nødvendigt kan der tilsættes en gasmanifold til kontrol af iltning og trykmanometer. Desuden kan et større perfusatkammer anvendes, og de fysiologiske parametre som tryk, temperatur og strømningshastighed kan styres af en computer.
Der er flere begrænsninger i perfusion kredsløb. Livmoderen og æggestokkene i hunmus kunne ikke perfunderes på grund af ligation af æggestokkene arterie og vene. Vi bemærkede også, at perfusion af testis var ufuldstændig, muligvis på grund af alternativ blodforsyning, der ikke er inkluderet i perfusionkredsløbet.
Med tilstrækkelig praksis kan kan kantningsproceduren udføres inden for 20-30 min med en succesrate på over 80%. Succesraten afhænger i høj grad af evnen til at kanyle aorta og vena cava uden at punktere fartøjet som beskrevet i trin 2.7. Det er vigtigt i trin 2 for at minimere skader på væv og små blodkar i det kirurgiske område på grund af potentielle lækager og tab af perfusat. I trin 2.5 skal man altid punktere arterien først og tage forholdsregler, så kateteret ikke trækkes ud. I trin 3 skal du ved tilslutning af katetreens ende til slangen sørge for at holde kateteret tæt ved hjælp af porte-aiguille for at undgå at flytte nålen. Blodtryk er direkte proportional med strømningshastighed; Derfor skal perfusatets strømningshastighed være lavere end 0,6 ml/min. for at opretholde det fysiologiske tryk. Endelig foretrækkes det at opretholde hjerteslag, indtil perfusion kredsløbet er lukket, da dette vil forbedre perfusion af mikrovasculature.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Undersøgelsen blev støttet af NIH tilskud CA194058 til DS, Skaggs School of Pharmacy ADR frø tilskud program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31771093), Projektet for internationalt samarbejde i Jilin-provinsen (nr. 201180414085GH), de grundlæggende forskningsfonde for de centrale universiteter, programmet for JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125 (2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419 (2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986 (2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).
