Summary
Se describe un protocolo para la perfusión in situ de la parte inferior del cuerpo del ratón, incluyendo la vejiga, la próstata, los órganos sexuales, los huesos, los músculos y la piel del pie.
Abstract
La perfusión ex vivo es una herramienta fisiológica importante para estudiar la función de los órganos aislados (por ejemplo, hígado, riñones). Al mismo tiempo, debido al pequeño tamaño de los órganos de ratón, la perfusión ex vivo de hueso, vejiga, piel, próstata y órganos reproductivos es desafiante o no factible. Aquí, informamos por primera vez un circuito de perfusión del cuerpo inferior in situ en ratones que incluye los tejidos anteriores, pero pasa por alto los principales órganos de aclaramiento (riñón, hígado y bazo). El circuito se establece cannulando la aorta abdominal y la vena cava inferior por encima de la arteria ilíaca y la vena y cauterizando los vasos sanguíneos periféricos. La perfusión se realiza a través de una bomba peristáltica con flujo de perfusión mantenido hasta 2 h. La tinción in situ con lectina fluorescente y solución de Hoechst confirmó que la microvasculatura se perfundió con éxito. Este modelo de ratón puede ser una herramienta muy útil para el estudio de procesos patológicos, así como mecanismos de administración de fármacos, migración/metástasis de células tumorales circulantes hacia/desde el tumor, e interacciones del sistema inmunitario con órganos y tejidos perfundidos.
Introduction
La perfusión de órganos aislados fue desarrollada originalmente para estudiar la fisiología de órganos para el trasplante1,2,3, y permitió la comprensión de las funciones de los órganos sin interferencia de otros sistemas del cuerpo. Por ejemplo, la perfusión aislada de riñón y corazón fue inmensamente útil para comprender los principios básicos de la hemodinámica y los efectos de los agentes vasoactivos, mientras que la perfusión hepática era importante para entender la función metabólica, incluido el metabolismo de fármacos en tejidos sanos y enfermos4,,5,,6,,7. Además, los estudios de perfusión fueron fundamentales para comprender la viabilidad y la función de los órganos destinados al trasplante. En Cancer Researchearch, la perfusión tumoral aislada ha sido descrita por varios grupos que utilizan ratón, rata y tejidos humanos recién resecados8,,9. En alguna perfusión tumoral aislada, el tumor se implantó en la almohadilla de grasa del ovario para forzar el crecimiento del tumor que suministra los vasos sanguíneos de la arteria mesenteria10. El grupo Jain realizó estudios pioneros utilizando perfusión aislada de adenocarcinomas de colon para entender la hemodinámica tumoral y metástasis8,11,12,13. Otras configuraciones innovadoras de ingeniería ex vivo incluyen un dispositivo de perfusión basado en placas de 96 pozos para cultivar las células de mieloma múltiple humanas primarias14 y una cámara de flujo modular para la ingeniería de arquitectura de médula ósea y la investigación de funciones15.
Además de los estudios de fisiología y patología, la perfusión de órganos se ha utilizado para estudiar los principios básicos de la administración de fármacos. Así, un grupo describió la perfusión aislada de las extremidades de las ratas y estudió la acumulación de liposomas en sarcomas implantados16,mientras que otro grupo realizó perfusión renal humana diseccionada para estudiar la focalización endotelial de nanopartículas17. Ternullo et al. utilizaron un colgajo de piel humana perfundido aislado como un modelo de penetración de fármacos de piel cercano a in vivo18.
A pesar de estos avances en la perfusión de grandes órganos y tejidos, no ha habido informes sobre modelos de perfusión in situ en ratones que: a) bypassen órganos aclaradores como hígado, bazo y riñones; b) incluir órganos pélvicos, piel, músculo, órganos reproductivos (en hombres), vejiga, próstata y médula ósea. Debido al pequeño tamaño de estos órganos y a la vasculatura suministradora, la cannulación ex vivo y el establecimiento de un circuito de perfusión no han sido factibles. El ratón es el modelo animal más importante en la investigación del cáncer y la inmunología, y la administración de medicamentos. La capacidad de perfunden pequeños órganos de ratón permitiría responder preguntas interesantes sobre la administración de fármacos a estos órganos, incluidos los tumores implantados en la pelvis (vejiga, próstata, ovario, médula ósea), así como estudios de fisiología básica e inmunología de enfermedades de estos órganos. Para abordar esta deficiencia, desarrollamos un circuito de perfusión in situ en ratones que potencialmente puede evitar lesiones tisulares y es mucho más adecuado para la investigación funcional que la perfusión de órganos aislados.
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Protocol
Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Colorado.
1. Precaliente el sistema de perfusión
- Preparar el sistema de perfusión antes de la cirugía iniciando un baño de agua circulante de 37oC para todos los componentes con camisa de agua (reservorio perfundido, cámara húmeda y tapa) como se muestra en una configuración personalizada en la Figura 1A. Asegúrese de que el tubo esté limpio y sustitúyalo si es necesario. Para limitar el volumen de perfuto, utilice una trampa de burbujas dentro de una cámara húmeda como el depósito de perfusión (Figura 1B-6).
2. Cateterismo vascular
- Inducir anestesia en un ratón BALB/c de 8-10 semanas de edad utilizando una máquina de anestesia veterinaria isoflurano con 3-5% de isoflurano y caudal de oxígeno a 0,3 L/min. Como alternativa, utilice ketamina/xilazina o cualquier otro tipo de anestesia intraperitoneal. Evaluar la profundidad de la anestesia mediante 2 métodos: toe-pinch y reflejo corneal.
- Prewet una sutura de seda 4-0 con aguja en agua doble destilada.
- Coloque el ratón anestesiado en una posición supina sobre una placa de espuma de poliestireno con la cabeza mirando al cirujano e inmovilice las extremidades delanteras y traseras con cinta adhesiva. Limpie el abdomen con alcohol isopropílico y corte el abdomen a lo largo de la línea media en forma de "T" con tijeras. Deje de sangrar alrededor del borde de la incisión por electrocoagulación (cauterización).
- Empuje el estómago, el yema y el colon hacia el lado derecho del abdomen para revelar la aorta abdominal, la vena cava y las arterias y venas iliacas e iliolumbar comunes.
- Bajo un microscopio de disección, busque y liga la arteria/vena de iliolumbar en el macho, y la arteria/vena ovárica y la arteria/vena de iliolumbar en la hembra utilizando suturas de seda 4-0(Figura 2 líneas amarillas).
- Bajo un microscopio de disección, en bucle dos suturas de seda 4-0 debajo de la aorta abdominal y vena cava inferior (aproximadamente 1 cm por encima de la arteria ilíaca y la vena, 1 mm de separación, Figura 2), y hacer un nudo suelto en la sutura más cercana a los vasos ilíacos (Figura 2, línea punteada blanca). Alternativamente, una sutura de seda 6-0 se puede utilizar para este nudo.
- Bajo un microscopio de disección, alinee y estire horizontalmente tanto la vena cava inferior como la aorta abdominal con porte-aiguille. Utilice un catéter intravenoso blindado de 24 G para perforar la aorta abdominal, presione el botón para retraer el núcleo de la aguja e inserte el catéter unos 5 mm en el recipiente.
- Repita el mismo procedimiento con la vena cava inferior y ate nudos de ambas suturas alrededor de los vasos cateterizados.
NOTA: La aguja puede perforar fácilmente a través del vaso sanguíneo; por lo tanto, mantener los vasos estirados y la aguja paralela con el recipiente. Retirar el núcleo de la aguja tan pronto como la aguja penetre aproximadamente 1 mm en el recipiente. La aorta abdominal está debajo de la vena cava inferior y mucho más delgada y elástica debido a estar envuelta en el tejido conectivo. Por lo tanto, la aorta puede "aferrarse" al catéter, y por lo tanto debe ser cateterizada antes de la vena cava para reducir la probabilidad de que el catéter se salga.
- Repita el mismo procedimiento con la vena cava inferior y ate nudos de ambas suturas alrededor de los vasos cateterizados.
- Aplicar pegamento instantáneo para inmovilizar los catéteres a la espina erédica, reemplazar los órganos abdominales y terminar la cirugía mientras se mantiene la anestesia.
NOTA: Los órganos que no se pueden reemplazar por completo en la cavidad abdominal deberán humedecer periódicamente con un medio de perfusión durante el proceso de perfusión.
3. Configure el sistema de perfusión
- Transfiera el ratón a la cámara húmeda con camisa de agua precalentada a 37 oC en una almohadilla de silicio e inmovilice las alas del catéter a la almohadilla con agujas de 19 G.
- Llene el extremo del catéter arterial (entrada) con el tampón de perfusión precalentado (solución de lactato de Ringer complementada con 5% de BSA), y luego conecte el extremo del catéter con el tubo de perfusión de entrada utilizando un conector atornillado(Figura 1B,flecha roja).
NOTA: Sujete el conector con fórceps hemostáticos e inmovilice el tubo con cinta adhesiva para evitar mover los catéteres. - Ajuste el caudal peristáltico a 0,6 ml/min y mantenga la salida de perfusión(Figura 1B,flecha azul) abierta durante 5-10 min para lavar la sangre a través del catéter venoso. Habrá algunos coágulos en el catéter de salida; eliminar los coágulos con tampón perfuma antes de cerrar el circuito de perfusión.
- Conecte el extremo del catéter venoso con el tubo de salida utilizando un conector atornillado para cerrar el circuito (Figura 1B). En este punto, realizar la eutanasia de gasCO2 y verificar por punción torácica o cualquier otro método.
- Cubra la cámara húmeda con la tapa caliente. Compruebe el nivel de perfusión periódicamente y agregue más si es necesario. La perfusión se puede realizar durante un máximo de 2 horas.
NOTA: Se necesitarán 5 ml de perfusate para configurar el sistema de perfusión cerrado. Si no hay fugas o edema, el volumen de perfusato disminuirá en menos de 1 ml y no se necesitará un tampón adicional. Para evitar el edema inducido por el trombo circulante periférico, el tampón de perfusión que contiene 0,002% de heparina se puede utilizar en los primeros 10 minutos de perfusión, pero debe cambiarse a tampón sin heparina para evitar la fuga en el borde de las incisiones. - Si es necesario, añada un reactivo de elección en el depósito de perfusión o en el puerto de inyección en cualquier momento(Figura 1B-5). Por ejemplo, se pueden añadir 10 ml de Hoechst33342 de 10 mg/ml de Hoechst33342 en el perfuso para manchar los núcleos celulares 2 h antes del final de la perfusión, o 50 ml de 1 mg/mllight 649-lectina para manchar las células enhelials vasculares 30 min antes del final de la perfusión.
NOTA: Si intenta manchar la médula ósea con la solución de Hoechst, los ratones necesitarán ser pre-inyectados 30 minutos antes de la cirugía. - Después de la perfusión con reactivos fluorescentes, lave con tampón de perfusión durante otros 10 minutos para minimizar la fluorescencia de fondo.
4. Análisis de órganos perfundidos
- Recoger órganos como testículos, próstata, vejiga, fémur, músculo y piel (por ejemplo, pies). Ex impuestos un pedazo de órgano de aproximadamente 1 mm3 y aplanar entre dos diapositivas de vidrio.
- Estudio bajo microscopio confocal fluorescente invertido utilizando filtros de excitación y emisión DAPI/Cy5 (láseres de excitación: DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). Utilice al menos un objetivo de ampliación de 200x con una apertura numérica de 0,45.
- Alternativamente, fijar los órganos con 4% de solución de formaldehído para 24 h y realizar la tinción de hematoxilina-eosina19.
- Para crear una ventana ósea para la observación intacta de la médula ósea, inmovilice ambos extremos del fémur o la tibia y raspe el hueso cortical con el borde lateral de una aguja de 19 G para exponer el periosteum; tener cuidado de mantener una fina capa de hueso residual. Coloque el hueso en un resbalón de cubierta con la ventana orientada al vidrio y la imagen con microscopio confocal fluorescente invertido utilizando los canales DAPI y Cy5 como se describió anteriormente. Las células y la red vascular en la cavidad de la médula ósea se pueden observar fácilmente.
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Representative Results
Configuramos un sistema de perfusión de circuito cerrado a través de la cánula de la aorta abdominal y la vena cava inferior de ratones de 8-10 semanas de edad manteniendo el volumen de tampón de perfusión inferior a 10 ml. La Figura 3A muestra imágenes confocales después de perfumar tejidos con la solución de Ringer que contiene Hoechst 33342 y DyLight 649-lectina. El músculo, la médula ósea, los testículos, la vejiga, la próstata y la piel del pie muestran una tinción nuclear y vascular eficiente. La Figura 3B muestra la tinción de hematoxilina-eosina de órganos después de 3 horas de perfusión no madretérmica.
Figura 1. Configuración simplificada de perfusión. (A) El sistema incluye (1) un controlador de presión/flujo, (2) un baño de agua caliente circulante, (3) una cámara húmeda calentada con cubierta calentada y espaciador de espuma de poliestireno personalizado, y (4) una bomba peristáltica. (B) El circuito de perfusión muestra la entrada (líneas rojas) y la salida (líneas azules), (5) el puerto de inyección y (6) el depósito de perfusión personalizado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Localización de vasos sanguíneos ligados y canulados en ratones machos y hembras. Con el fin de esbozar los vasos sanguíneos, se añadieron 5 l/kg de tinte azul de 1% Evans al medio de perfusión 30 min antes del final de la perfusión. En ratones hembra, tanto las arterias y venas iliolumbar como las ovárgicas están ligadas. En ratones machos, la arteria iliolumbar y la vena están ligadas. Las líneas amarillas y blancas muestran la posición aproximada de los nudos de ligadura; flechas amarillas muestran suturas y nudos reales. Se insertan catéteres venosos y arteriales. Los intestinos fueron retirados con fines de demostración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Las imágenes confocales y H&E muestran una perfusión exitosa de órganos durante 3 h sin lesiones tisulares aparentes. Barra de escala confocal: 20 m para la médula ósea y 100 m para otros órganos. Barra de escala H&E: 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El circuito descrito se puede utilizar para sondear varias preguntas de investigación, por ejemplo, el papel de diferentes componentes séricos y barreras tisulares en la administración de fármacos, o el tráfico inmune y de células madre. Se pueden añadir diferentes sistemas de administración de medicamentos (por ejemplo, liposomas y nanopartículas) al perfuso para comprender el papel de los factores fisiológicos y bioquímicos en el parto. La duración de la perfusión puede variar, dependiendo del tejido estudiado, los objetivos científicos y la composición de perfusate. Aquí presentamos los resultados de la perfusión de hasta 2 h utilizando un medio básico de perfusión que consiste en la solución de Ringer con lactato y albúmina. Cabe señalar que el objetivo del presente trabajo era establecer el circuito de perfusión en lugar de desarrollar y optimizar el medio de perfusión y las condiciones para apoyar la función óptima del órgano/tejido y la oxigenación. La adición de nutrientes, vitaminas, hormonas y células sanguíneas se han investigado ampliamente en la literatura anterior, y numerosos medios de perfusión y protocolos de oxigenación se han descrito en docenas de publicaciones de investigación en tejidos humanos y animales7,,9,10,11,12,13,16,17,20,21. Los refinamientos de la composición de perfusión, así como la oxigenación pueden permitir el mantenimiento a largo plazo del metabolismo tisular a temperatura corporal. Por lo tanto, algunos grupos utilizaron glóbulos rojos y oxigenación de la sangre, lo que mejora en gran medida la viabilidad de los tejidos sensibles17. Los controles de perfusión también son altamente personalizables; si es necesario, se puede añadir un colector de gas para controlar la oxigenación y el manómetro de presión. Además, se puede utilizar una cámara de perfuto más grande, y los parámetros fisiológicos como la presión, la temperatura y el caudal pueden ser controlados por una computadora.
Hay varias limitaciones en el circuito de perfusión. El útero y los ovarios en ratones hembra no pudieron ser perfundidos debido a la ligadura de la arteria ovárica y la vena. Además, observamos que la perfusión de testículos estaba incompleta, posiblemente debido a un suministro de sangre alternativo no incluido en el circuito de perfusión.
Con suficiente práctica, el procedimiento de canulación se puede realizar dentro de 20-30 min con una tasa de éxito de más del 80%. La tasa de éxito depende en gran medida de la capacidad de cannular la aorta y la vena cava sin perforar el recipiente como se explica en el paso 2.7. Es importante en el paso 2 para minimizar la lesión a los tejidos y pequeños vasos sanguíneos en el área quirúrgica debido a posibles fugas y pérdida de perfuto. En el paso 2.5, siempre se debe perforar la arteria primero, y tomar precauciones para que el catéter no se extraiga. En el paso 3, al conectar el extremo de los catéteres al tubo, asegúrese de sujetar el catéter firmemente usando porte-aiguille para evitar mover la aguja. La presión arterial es directamente proporcional al caudal; por lo tanto, el caudal de perfusate debe ser inferior a 0,6 ml/min para mantener la presión fisiológica. Por último, se prefiere mantener los latidos del corazón hasta que se cierre el circuito de perfusión, ya que esto mejorará la perfusión de la microvasculatura.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El estudio fue apoyado por la subvención DE NIH CA194058 a DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (Grant No 31771093), el Proyecto de Colaboración Internacional de la Provincia de Jilin (No.201180414085GH), los Fondos Fundamentales de Investigación para las Universidades Centrales, el Programa para el Equipo de Investigación Innovadora de Ciencia y Tecnología JLU (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
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