Summary
Um protocolo é descrito para a perfusão in situ do corpo inferior do camundongo, incluindo a bexiga, a próstata, órgãos sexuais, osso, músculo e pele do pé.
Abstract
A ex-perfusão é uma importante ferramenta fisiológica para estudar a função de órgãos isolados (por exemplo, fígado, rins). Ao mesmo tempo, devido ao pequeno tamanho de órgãos de camundongos, a perfusão ex vivo de órgãos ósseos, bexiga, pele, próstata e reprodução é desafiadora ou inviável. Aqui, relatamos pela primeira vez um circuito de perfusão do corpo in situ em camundongos que inclui os tecidos acima, mas contorna os principais órgãos de liberação (rim, fígado e baço). O circuito é estabelecido por cannulação da aorta abdominal e veia cava inferior acima da artéria ilíaca e veia e cauterização dos vasos sanguíneos periféricos. A perfusão é realizada através de uma bomba peristáltica com fluxo perfusado mantido por até 2 h. A coloração in situ com lectina fluorescente e solução Hoechst confirmou que a microvasculatura foi perfundida com sucesso. Este modelo de camundongo pode ser uma ferramenta muito útil para estudar processos patológicos, bem como mecanismos de entrega de drogas, migração/metástase de células tumorais circulantes para/a partir do tumor, e interações do sistema imunológico com órgãos e tecidos perfumados.
Introduction
A perfusão isolada de órgãos foi originalmente desenvolvida para estudar a fisiologia de órgãos para transplante1,,2,,3, e possibilitou a compreensão das funções dos órgãos sem interferência de outros sistemas corporais. Por exemplo, a perfusão renal e cardíaca isolada foi imensamente útil na compreensão dos princípios básicos da hemodinâmica e dos efeitos dos agentes vasoativos, enquanto a perfusão hepática foi importante para a compreensão da função metabólica, incluindo o metabolismo medicamentoso no tecido saudável e doente4,,5,,6,7. Além disso, os estudos de perfusão foram fundamentais na compreensão da viabilidade e função dos órgãos destinados ao transplante. Na Pesquisa do Câncer, a perfusão de tumores isolados foi descrita por vários grupos usando camundongos, ratos e tecidos humanos recentemente ressecados8,,9. Em alguma perfusão tumoral isolada, o tumor foi implantado na almofada de gordura do ovário para forçar o crescimento do tumor que fornece vasos sanguíneos da artéria mesenteria10. O grupo Jain realizou estudos pioneiros utilizando perfusão isolada de adenocarcinomas de cólon para entender hemodinâmica tumoral e metástase8,,11,,12,13. Outras configurações inovadoras projetadas ex vivo incluem um dispositivo de perfusão à base de placas de 96 poços para cultivar as células primárias de mieloma múltiplo humano14 e uma câmara de fluxo modular para engenharia de arquitetura de medula óssea e pesquisa de funções15.
Além dos estudos de fisiologia e patologia, a perfusão de órgãos tem sido utilizada para estudar os princípios básicos do parto de medicamentos. Assim, um grupo descreveu a perfusão isolada de membros de ratos e estudou o acúmulo de lipossomos em sarcomas implantados16, enquanto outro grupo realizou perfusão renal humana dissecada para estudar o direcionamento endotelial de nanopartículas17. Ternullo et al. usaram um retalho de pele humana perfusado isolado como um modelo de penetração de drogas de pele quase in vivo18.
Apesar desses avanços na perfusão de grandes órgãos e tecidos, não houve relatos sobre modelos in situ perfusion em camundongos que: a) desobstruem órgãos de desobstrução, como fígado, baço e rins; b) incluir órgãos pélvicos, pele, músculo, órgãos reprodutivos (no masculino), bexiga, próstata e medula óssea. Devido ao pequeno tamanho desses órgãos e ao fornecimento de vasculatura, a canulação ex vivo e o estabelecimento de um circuito de perfusão não foram viáveis. O rato é o modelo animal mais importante em pesquisa sobre câncer e imunologia, e entrega de medicamentos. A capacidade de permear pequenos órgãos de camundongos permitiria que perguntas interessantes sobre o fornecimento de medicamentos a esses órgãos, inclusive para tumores implantados na pelve (bexiga, próstata, ovário, medula óssea), fossem respondidas, bem como estudos de fisiologia básica e imunologia de doenças desses órgãos. Para lidar com essa deficiência, desenvolvemos um circuito in situ de perfusão em camundongos que pode potencialmente evitar lesões teciduais e é muito mais adequado para pesquisa funcional do que perfusão de órgãos isolados.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Colorado.
1. Pré-aqueça o sistema de perfusão
- Prepare o sistema de perfusão antes da cirurgia iniciando um banho de água circulante de 37 °C para todos os componentes reveses de água (reservatório perfusado, câmara úmida e tampa) como mostrado em uma configuração personalizada na Figura 1A. Certifique-se de que a tubulação está limpa e substitua se necessário. Para limitar o volume perfusado, use uma armadilha de bolhas dentro de uma câmara úmida como o reservatório perfusado(Figura 1B-6).
2. Cateterismo vascular
- Induzir anestesia em um rato BALB/c de 8-10 semanas de idade usando uma máquina de anestesia veterinária isoflurane com 3-5% de isoflurane e taxa de fluxo de oxigênio em 0,3 L/min. Como alternativa, use cetamina/xilazina ou qualquer outro tipo de anestesia intraperitoneal. Avalie a profundidade da anestesia por 2 métodos: pinça do dedo do dedo do sol e reflexo da córnea.
- Prewet uma sutura de seda 4-0 com agulha em água dupla destilada.
- Coloque o rato anestesiado em uma posição supina em uma placa de isopor com a cabeça voltada para o cirurgião e imobilize membros dianteiros e membros traseiros com fita. Limpe o abdômen com álcool isopropílico e corte o abdômen ao longo da linha média em forma de "T" com uma tesoura. Pare de sangrar ao redor da borda da incisão por eletrocoagulação (cauterização).
- Empurre o estômago, jejunum e cólon para o lado direito do abdômen para revelar a aorta abdominal, vena cava, e artérias e veias ilíacas e ilí lombar comuns.
- Sob um microscópio de dissecção, encontre e ligate a artéria/veia iliolumbar no masculino, e artéria ovariana/veia e a artéria iliolumbar/veia na fêmea usando suturas de seda 4-0(Figura 2 linhas amarelas).
- Sob um microscópio de dissecção, enrole duas suturas de seda 4-0 sob a aorta abdominal e a veia inferior (cerca de 1 cm acima da artéria ilíaca e veia, 1 mm de distância, Figura 2), e faça um nó solto na sutura mais próxima dos vasos ilíicos(Figura 2, linha pontilhada branca). Alternativamente, uma sutura de seda 6-0 pode ser usada para este nó.
- Sob um microscópio de dissecção, alinhar horizontalmente e esticar tanto a veia cava inferior quanto a aorta abdominal com porte-aiguille. Use um cateter de 24 G blindado blindado para perfurar a aorta abdominal, aperte o botão para retrair o núcleo da agulha e insira o cateter cerca de 5 mm no vaso.
- Repita o mesmo procedimento com a veia cava inferior e amarre nós de ambas as suturas ao redor dos vasos cateterizados.
NOTA: A agulha pode facilmente perfurar através do vaso sanguíneo; portanto, mantenha os vasos esticados e agulha paralelamente com o vaso. Retraia o núcleo da agulha assim que a agulha penetrar cerca de 1 mm no vaso. A aorta abdominal está sob a veia cava inferior e muito mais fina e elástica devido ao envolta em tecido conjuntivo. Portanto, a aorta pode "segurar" o cateter e, portanto, deve ser cateterizada antes da veia cava para reduzir a probabilidade de o cateter escorregar.
- Repita o mesmo procedimento com a veia cava inferior e amarre nós de ambas as suturas ao redor dos vasos cateterizados.
- Aplique cola instantânea para imobilizar os cateteres no spinae eretor, substituir os órgãos abdominais e terminar a cirurgia mantendo a anestesia.
NOTA: Órgãos que não podem ser completamente substituídos na cavidade abdominal precisarão ser periodicamente umedecidos com meio de perfusão durante o processo de perfusão.
3. Configure o sistema de perfusão
- Transfira o mouse para a câmara úmida revestida de água pré-encolhida a 37 °C em uma almofada de silicone e imobilize as asas do cateter para a almofada com agulhas de 19 G.
- Encha a extremidade (entrada) do cateter arterial com tampão de perfusão pré-ensaboada (solução de lactato do Ringer complementada com 5% de BSA) e, em seguida, conecte a extremidade do cateter com a tubulação de perfusão de entrada usando um conector de parafuso -on(Figura 1B, seta vermelha).
NOTA: Segure o conector com fórceps hemostáticos e imobilize a tubulação com fita adesiva para evitar mover os cateteres. - Ajuste a taxa de fluxo peristáltico para 0,6 mL/min e mantenha a saída de perfusão(Figura 1B, seta azul) aberta por 5-10 minutos para lavar o sangue através do cateter venoso. Haverá alguns coágulos no cateter de saída; limpe os coágulos com tampão perfusado antes de fechar o circuito de perfusão.
- Conecte a extremidade do cateter venoso com a tubulação de saída usando um conector parafusar para fechar o circuito(Figura 1B). Neste ponto, realize a eutanásia de gás CO2 e verifique por punção torácica ou qualquer outro método.
- Cubra a câmara úmida com a tampa aquecida. Verifique o nível de perfusato periodicamente e adicione mais, se necessário. A perfusão pode ser realizada por até 2 horas.
NOTA: Serão necessários 5 mL de perfusato para configurar o sistema de perfusão fechado. Se não houver vazamento ou edema, o volume de perfusato diminuirá em menos de 1 mL e não será necessário buffer adicional. Para evitar edema induzido por trombos de circulação periférico, o tampão de perfusão contendo heparina de 0,002% pode ser usado nos primeiros 10 minutos de perfusão, mas deve ser alterado para tampão sem heparina para evitar o vazamento na borda das incisões. - Se necessário, adicione um reagente de escolha no reservatório de perfusão ou na porta de injeção a qualquer momento(Figura 1B-5). Por exemplo, 10 μL de 10 mg/mL Hoechst33342 pode ser adicionado no perfusato para manchar os núcleos celulares 2 h antes do fim da perfusão, ou 50 μL de 1 mg/mL DyLight 649-lectina para manchar as células endoteliais vasculares 30 minutos antes do fim da perfusão.
NOTA: Se tentar manchar a medula óssea com a solução Hoechst, os camundongos precisarão ser pré-injetados 30 minutos antes da cirurgia. - Após a perfusão com reagentes fluorescentes, lave com tampão de perfusão por mais 10 minutos para minimizar a fluorescência de fundo.
4. Análise de órgãos perfumados
- Coletar órgãos incluindo testículos, próstata, bexiga, fêmur, músculo e pele (por exemplo, pés). Extite um pedaço de órgão cerca de 1 mm3 e achate entre dois slides de vidro.
- Estudo sob microscópio confocal fluorescente invertido utilizando filtros de excitação e emissão DAPI/Cy5 (lasers de excitação : DAPI, 405 nm; Cy5,640 nm). Use pelo menos o objetivo de ampliação de 200x com uma abertura numérica de 0,45.
- Alternativamente, fixar os órgãos com 4% de solução de formaldeído por 24 h e realizar a coloração hematoxilina-eosina19.
- Para criar uma janela óssea para observação intacta da medula óssea, imobilize ambas as extremidades do fêmur ou tíbia e raspe o osso cortical com a borda lateral de uma agulha de 19 G para expor o periósteo; tome cuidado para manter uma fina camada de osso residual. Coloque o osso em um deslizamento de tampa com a janela voltada para o vidro e imagem com microscópio confocal fluorescente invertido usando canais DAPI e Cy5 conforme descrito acima. As células e a rede vascular na cavidade da medula óssea podem ser facilmente observadas.
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Representative Results
Montamos um sistema de perfusão de circuito fechado através da canulação da aorta abdominal e da cava vena inferior de camundongos de 8 a 10 semanas de idade, mantendo o volume de tampão de perfusão inferior a 10 mL. A Figura 3A mostra imagens confocais após perfumar tecidos com a solução de Ringer contendo Hoechst 33342 e DyLight 649-lectina. Músculo, medula óssea, testis, bexiga, próstata e pele do pé mostram uma coloração nuclear e vascular eficiente. A Figura 3B mostra a coloração hematoxilina-eosina dos órgãos após 3 horas de perfusão normoérmica.
Figura 1. Configuração simplificada de perfusão. (A) O sistema inclui (1) um controlador de taxa de pressão/fluxo, (2) um banho de água aquecida circulante, (3) uma câmara úmida aquecida com tampa aquecida e espaçador de isopor personalizado, e (4) uma bomba peristáltica. (B) O circuito de perfusão mostra entrada (linhas vermelhas) e saída (linhas azuis), (5) a porta de injeção e (6) o reservatório de perfusão personalizado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Localização de vasos sanguíneos ligados e canulados em camundongos machos e fêmeas. Para delinear os vasos sanguíneos, 5 μL/kg de 1% de corante Evans Blue foi adicionado ao meio de perfusão 30 minutos antes do fim da perfusão. Em camundongos fêmeas, artérias e veias iliolumbar e ovariana são ligadas. Em camundongos machos, artéria iliolumbar e veia são ligadas. Linhas amarelas e brancas mostram posição aproximada de nós de ligadura; setas amarelas mostram suturas e nós reais. Tanto cateteres venosos quanto arteriais são inseridos. Os intestinos foram removidos para fins de demonstração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Imagens confocal e H&E mostram perfusão bem sucedida de órgãos por 3 h sem lesão tecidual aparente. Barra de escala confocal: 20 μm para medula óssea e 100 μm para outros órgãos. Barra de escala de H&E: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O circuito descrito pode ser usado para sondar várias questões de pesquisa, por exemplo, o papel de diferentes componentes séricos e barreiras teciduais no fornecimento de drogas, ou tráfico de células-tronco e imunes. Diferentes sistemas de entrega de medicamentos (por exemplo, lipossomos e nanopartículas) podem ser adicionados ao perfusato, a fim de entender o papel dos fatores fisiológicos e bioquímicos na entrega. A duração da perfusão pode variar, dependendo do tecido estudado, dos objetivos científicos e da composição do perfusato. Apresentamos aqui os resultados da perfusão até 2h usando uma mídia básica de perfusão consistindo da solução de Ringer com lactato e albumina. Deve-se notar que o objetivo do presente trabalho foi estabelecer o circuito de perfusão em vez de desenvolver e otimizar o meio de perfusão e as condições para suportar a função ideal do órgão/tecido e a oxigenação. A adição de nutrientes, vitaminas, hormônios e células sanguíneas tem sido amplamente investigada na literatura anterior, e numerosos protocolos de perfusão e oxigenação foram descritos em dezenas de publicações de pesquisa em tecidos humanos e animais7,,9,,10,,11,12,,13,16,17,,20,,21. Refinamentos da composição perfusada, bem como a oxigenação podem permitir a manutenção a longo prazo do metabolismo tecidual à temperatura corporal. Assim, alguns grupos utilizaram glóbulos vermelhos e oxigenação sanguínea, o que melhora muito a viabilidade dos tecidos sensíveis17. Os controles de perfusão também são altamente personalizáveis; se necessário, um coletor de gás para controlar a oxigenação e o manômetro de pressão pode ser adicionado. Além disso, uma câmara de perfusato maior pode ser usada, e os parâmetros fisiológicos como pressão, temperatura e taxa de fluxo podem ser controlados por um computador.
Existem várias limitações no circuito de perfusão. O útero e os ovários em camundongos fêmeas não puderam ser perfundidos devido à ligadura da artéria ovariana e da veia. Além disso, observou-se que a perfusão dos testis estava incompleta, possivelmente devido ao suprimento de sangue alternativo não incluído no circuito de perfusão.
Com prática suficiente, o procedimento de cannulação pode ser realizado dentro de 20-30 min com uma taxa de sucesso superior a 80%. A taxa de sucesso depende muito da capacidade de cannular a aorta e a veia cava sem perfurar o vaso como discutido no Passo 2.7. É importante na etapa 2 minimizar a lesão nos tecidos e pequenos vasos sanguíneos na área cirúrgica devido a possíveis vazamentos e perda de perfusato. Na etapa 2.5, deve-se sempre perfurar a artéria primeiro, e tomar precauções para que o cateter não seja retirado. Na etapa 3, ao conectar a extremidade dos cateteres à tubulação, certifique-se de segurar o cateter firmemente usando porte-aiguille para evitar mover a agulha. A pressão arterial é diretamente proporcional à taxa de fluxo; portanto, a taxa de fluxo de perfusato deve ser inferior a 0,6 mL/min para manter a pressão fisiológica. Por fim, é preferível manter os batimentos cardíacos até que o circuito de perfusão esteja fechado, pois isso melhorará a perfusão da microvasculatura.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
O estudo foi apoiado pela concessão do NIH CA194058 ao DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); Fundação Nacional de Ciência Natural da China (Grant nº 31771093), o Projeto de Colaboração Internacional da Província de Jilin (nº 201180414085GH), os Fundos Fundamentais de Pesquisa para as Universidades Centrais, o Programa de Pesquisa Inovadora em Ciência e Tecnologia da JLU (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
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