Summary
Протокол описан для in situ перфузии нижней части тела мыши, в том числе мочевого пузыря, простаты, половых органов, кости, мышцы и стопы кожи.
Abstract
Ex vivo перфузии является важным физиологическим инструментом для изучения функции изолированных органов (например, печени, почек). В то же время, из-за небольшого размера органов мыши, ex vivo перфузии кости, мочевого пузыря, кожи, простаты и репродуктивных органов является сложной или неосуществимой. Здесь мы впервые сообщаем о схеме перфузии нижней части тела у мышей, которая включает в себя вышеуказанные ткани, но обходит основные органы очистки (почки, печень и селезенка). Схема устанавливается путем канниелирования брюшной аорты и нижней полой вены над подвздошной артерией и венами и прижигания периферических кровеносных сосудов. Перфузия осуществляется через перистальтический насос с перфузионным потоком, поддерживаемым до 2 ч. На месте окрашивания флуоресцентным лектином и раствором Hoechst подтверждается, что микроваскулатура была успешно пронизана. Эта модель мыши может быть очень полезным инструментом для изучения патологических процессов, а также механизмов доставки лекарств, миграции/метастазирования циркулирующих опухолевых клеток в/из опухоли, а также взаимодействия иммунной системы с переполнимыми органами и тканями.
Introduction
Изолированный орган перфузии был первоначально разработан для изучения физиологии органов для трансплантации1,2,3, и позволило понимание функций органов без вмешательства со стороны других систем организма. Например, изолированная перфузия почек и сердца была чрезвычайно полезна для понимания основных принципов гемодинамики и эффектов вазоактивных агентов, в то время как перфузия печени была важна для понимания метаболической функции, включая метаболизм наркотиков в здоровой и больной ткани4,,5,,6,,7. Кроме того, исследования перфузии имеют решающее значение для понимания жизнеспособности и функции органов, предназначенных для трансплантации. В Cancer Researchearch, изолированные перфузии опухоли была описана несколькими группами с помощью мыши, крысы, и свежестекованные человеческие ткани8,9. В некоторых изолированных перфузии опухоли, опухоль была имплантирована в яичников жира площадку, чтобы заставить рост опухоли, снабжающей кровеносные сосуды из мезентерии артерии10. Группа Jain выполнила новаторские исследования с использованием изолированных перфузии аденокарциномы толстой кишки, чтобы понять опухолевую гемодинамику и метастазы8,,11,,12,13. Другие инновационные инженерии ex vivo установки включают 96-ну пластины на основе перфузии устройства для культуры первичных человеческих множественных клеток миеломы14 и модульной камерой потока для инженерной архитектуры костного мозга и функции исследований15.
В дополнение к исследованиям физиологии и патологии, перфузия органов была использована для изучения основных принципов доставки лекарств. Так, одна группа описала изолированную перфузию конечностей крыс и изучила накопление липосом в имплантированных саркомах16,в то время как другая группа выполнила расчлененную перфузию почек человека для изучения эндотелиального таргетинга наночастиц17. Ternullo et al. использовали изолированный переполох кожи человека как близко к vivo модели проникновения препарата кожи18.
Несмотря на эти достижения в перфузии крупных органов и тканей, не было никаких сообщений о на месте перфузии моделей у мышей, что: а) шунтирование органов очистки, таких как печень, селезенка и почки; б) включают органы малого таза, кожу, мышцы, репродуктивные органы (у мужчин), мочевой пузырь, простату и костный мозг. Из-за небольшого размера этих органов и поставки сосудов, ex vivo каннуляция и создание перфузии цепи не представляется возможным. Мышь является наиболее важной моделью животных в исследованиях рака и иммунологии, а также в доставке лекарств. Способность взлетать маленькие органы мыши позволит ответить на интересные вопросы, касающиеся доставки лекарств в эти органы, в том числе к опухолям, имплантированных в таз (пузырь, простата, яичник, костный мозг), а также исследования фундаментальной физиологии и иммунологии заболеваний этих органов. Для решения этой проблемы мы разработали схему перфузии на мышах, которая потенциально может избежать повреждения тканей и гораздо лучше подходит для функциональных исследований, чем изолированные перфузии органов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Колорадо (IACUC).
1. Предварительное нагревание системы перфузии
- Подготовьте систему перфузии перед операцией, начав циркулирующую водяную ванну с 37 градусами по Цельсию для всех компонентов с водяными куртками (перфузиотный резервуар, влажная камера и крышка), как показано в индивидуальной конфигурации на рисунке 1A. Убедитесь, что трубки чистые и заменить, если это необходимо. Чтобы ограничить объем перфузии, используйте ловушку пузыря во влажной камере в качестве перфузиохранилища(рисунок 1B-6).
2. Васкулярная катетеризация
- Индуцировать анестезию в 8-10 недельной мыши BALB/c с помощью изофлоурана ветеринарной анестезии с 3-5% изофлуран и скорость потока кислорода на 0,3 л/мин. В качестве альтернативы, использование кетамина / ксилазина или любой другой тип интраперитонеальной анестезии. Оцените глубину анестезии 2 методами: щепоткой ног и рефлектором роговицы.
- Преветте 4-0 шелковый шов с иглой в двойной дистиллированной воде.
- Поместите анестезируемую мышь в положение на спине на доске из пенополистирола с головой, обращенной к хирургу, и обездвижьте передние конечности и задние конечности лентой. Протрите живот изопропиловым спиртом и разрежьте брюшко вдоль средней линии ножницами. Остановить кровотечение по краю разреза с помощью электрокоагуляции (прижигания).
- Нажмите на желудок, jejunum и толстой кишки в правой части живота, чтобы выявить брюшной аорты, вена кава, и общие подвздошные и iliolumbar артерий и вен.
- Под микроскопом вскрытия, найти и ligate iliolumbar артерии / вены в мужской, и яичников артерии / вены и iliolumbar артерии / вены в женщине с помощью 4-0 шелковых швов (Рисунок 2 желтые линии).
- Под микроскопом рассечения, петля два 4-0 шелковых швов под брюшной аорты и нижней полой вены (около 1 см выше подвздошной артерии и вены, 1 мм друг от друга, Рисунок 2), и сделать свободный узел в шв ближе всего к подвучей сосудов(рисунок 2, белая пунктирная линия). Кроме того, 6-0 шелковый шов может быть использован для этого узла.
- Под микроскопом рассечения горизонтально выравнивается и растягиваются как нижняя вена-кава, так и брюшная аорта с порт-айгюй. Используйте 24-g крылатый катетер I.V. для прокола брюшной аорты, нажмите кнопку, чтобы втягивать ядро иглы и вставить катетер около 5 мм в сосуд.
- Повторите ту же процедуру с нижней полой вены и свяжите узлы обоих швов вокруг катетеризированных сосудов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Игла может легко проколоть через кровеносный сосуд; поэтому держите сосуды растянутыми и игольчатой параллельно с сосудом. Втягивай сердцевина иглы, как только игла проникает примерно на 1 мм в сосуд. Брюшная аорта находится под нижней полой вены и гораздо тоньше и упругой из-за того, что заключена в соединительной ткани. Таким образом, аорта может "держаться" к катетеру, и, таким образом, должны быть катетеризированы до вена кава, чтобы уменьшить вероятность выскальзывания катетера.
- Повторите ту же процедуру с нижней полой вены и свяжите узлы обоих швов вокруг катетеризированных сосудов.
- Нанесите мгновенный клей, чтобы обездвижить катетеры к вереце, заменить органы брюшной полости, и закончить операцию при сохранении анестезии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Органы, которые не могут быть полностью заменены в брюшной полости необходимо будет периодически увлажнять с перфузионной среды во время процесса перфузии.
3. Настройка системы перфузии
- Перенесите мышь в водяную во влажную камеру, предварительно разогрелую до 37 градусов по Цельсию на кремниевой подушечке и обездвижить крылья катетера к колодке с 19 G иглами.
- Заполните конец артериального катетера (вход) с преосвёзенным буфером перфузии (лактатное решение Ringer, дополненное 5% BSA), а затем соедините конец катетера с входным перфузионного тюбинга с помощью разъема винта(рисунок 1B,красная стрелка).
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите разъем с гемостатическими щипцами и обездвижить трубки с лентой, чтобы избежать перемещения катетеров. - Отрегулируйте скорость перистальтического потока до 0,6 м/мин и держите отток перфузии(рисунок 1B,синяя стрелка) открытым в течение 5-10 мин, чтобы промыть кровь через венозный катетер. Там будет несколько сгустков в выходе катетер; промыть сгустки с перфузионной буфера перед закрытием перфузии цепи.
- Подключите конец венозного катетера с розеткой трубки с помощью разъема винта, чтобы закрыть схему(Рисунок 1B). На данный момент, выполнить CO2 газовой эвтаназии и проверить по груди прокол или любой другой метод.
- Накройте влажную камеру разогретой крышкой. Проверьте уровень перфузии периодически и добавить больше, если это необходимо. Перфузия может быть выполнена до 2 часов.
ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мЛ перфузии потребуется для создания закрытой системы перфузии. Если утечки или отеков нет, объем перфузии уменьшится менее чем на 1 мл и дополнительный буфер не потребуется. Чтобы избежать отеков, вызванных периферическим циркулирующим тромбом, буфер перфузии, содержащий 0,002% гепарина, может быть использован в первые 10 минут перфузии, но должен быть изменен на буфер без гепарина, чтобы избежать утечки на краю разрезов. - При необходимости добавьте реагент выбора в перфузионный резервуар или в порт впрыска в любое время(рисунок 1B-5). Например, 10 мл 10 мг/мл Hoechst33342 могут быть добавлены в перфузиат, чтобы окрашивать ядра клеток 2 ч до конца перфузии, или 50 мл 1 мг/мл DyLight 649-lectin, чтобы окрашивать сосудистые эндотелиальные клетки за 30 мин до конца перфутиона.
ПРИМЕЧАНИЕ: При попытке пятна костного мозга с hoechst решение, мышей необходимо предварительно вводить 30 минут до операции. - После перфузии флуоресцентными реагентами, промыть с буфером перфузии еще 10 минут, чтобы свести к минимуму фон флуоресценции.
4. Анализ перфузированных органов
- Собирайте органы, включая яички, простату, мочевой пузырь, бедренную кость, мышцы и кожу (например, ноги). Акциз на кусок органа около 1 мм3 и сгладить между двумя стеклянными слайдами.
- Исследование под перевернутым флуоресцентным конфокальным микроскопом с использованием DAPI/Cy5 excitation и эмиссионных фильтров (возбуждение лазеров : DAPI, 405 нм; Cy5,640 нм). Используйте по крайней мере 200-ю цель увеличения с численной диафрагмой 0,45.
- Кроме того, исправить органы с 4% формальдегида раствор для 24 ч и выполнять гематоксилин-эозин окрашивания19.
- Чтобы создать окно кости для нетронутого наблюдения костного мозга, обездвижить оба конца бедренной кости или голени и соскребать корковую кость с боковой кромкой 19 G иглы подвергать периостюм; заботиться, чтобы сохранить тонкий слой остаточной кости. Поместите кость на крышку скольжения с окном, обращенным к стеклу и изображение с перевернутым флуоресцентным конфокальным микроскопом с использованием DAPI и Cy5 каналов, как описано выше. Клетки и сосудистая сеть в полости костного мозга можно легко наблюдать.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы создали замкнутую систему перфузии цепи через каннулуля брюшной аорты и нижней полой вены 8-10 недельных мышей, сохраняя при этом объем буфера перфузии менее 10 мл. Рисунок 3A показывает конфокалные изображения после перфузии тканей с раствором Ringer, содержащим Hoechst 33342 и DyLight 649-lectin. Мышцы, костный мозг, яички, мочевой пузырь, простата и кожа ног показывают эффективное ядерное и сосудистое окрашивание. Рисунок 3B показывает гематоксилин-эозин окрашивания органов после 3 часов нормотермической перфузии.
Рисунок 1. Упрощенная настройка перфузии. (A) Система включает в себя (1) контроллер скорости давления/потока, (2) циркулирующую водяную ванну с подогревом, (3) нагретую влажную камеру с нагретой крышкой и пользовательским пространным проплывщиком из пенополистирола и (4) перистальтическим насосом. (B) Схема перфузии показывает вход (красные линии) и розетку (синие линии), (5) порт впрыска и (6) индивидуальный резервуар перфузии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Расположение лигаированных и консервированных кровеносных сосудов у мышей мужского и женского пола. Для того, чтобы очертить кровеносные сосуды, 5 МЛ/кг 1% красителя Evans Blue было добавлено в перифузию среды 30 мин до конца перфузии. У самок мышей, как iliolumbar и яичников артерий и вен велись. У мышей-самцов перевязывая ими илиолумальная артерия и вены. желтые и белые линии показывают приблизительное положение узлов перевязки; желтые стрелки показывают фактические швы и узлы. Вставляются как венозные, так и артериальные катетеры. В демонстрационных целях были удалены кишечники. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Confocal и Н И изображения показывают успешное перфузии органов на 3 ч без видимых повреждений тканей. Бар конфокальной шкалы: 20 мкм для костного мозга и 100 мкм для других органов. Бар масштаба H и E: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанная схема может быть использована для зондирования различных вопросов исследований, например, роли различных компонентов сыворотки и тканевых барьеров в доставке лекарств или торговле иммунной и стволовыми клетками. Различные системы доставки лекарств (например, липосомы и наночастицы) могут быть добавлены в перфузию, чтобы понять роль физиологических и биохимических факторов в доставке. Продолжительность перфузии может варьироваться, в зависимости от исследуемой ткани, научных целей и состава перфузии. Мы представляем здесь результаты перфузии до 2 ч с использованием основных средств perfusion, состоящий из решения Ringer с лактатом и альбумином. Следует отметить, что цель нынешней работы заключается в создании схемы перфузии, а не в разработке и оптимизации перфузии среды и условий для поддержки оптимальной функции органа/ткани и оксигенации. Добавление питательных веществ, витаминов, гормонов и клеток крови были широко исследованы в предыдущей литературе, и многочисленные средства perfusion средств массовой информации и оксигенации протоколы были описаны в десятках научных публикаций в человеческих и животных тканей7,9,10,11,12,13,16,17,20,21. Уточнения перфузионного состава, а также оксигенации могут обеспечить долгосрочное поддержание метаболизма тканей при температуре тела. Таким образом, некоторые группы использовали красные кровяные тельца и оксигенацию крови, что значительно повышает жизнеспособность чувствительных тканей17. Элементы управления perfusion также очень настраиваемы; при необходимости может быть добавлен газ для контроля оксигенации и давления манометра. Кроме того, можно использовать более большую перфузивную камеру, а физиологические параметры, такие как давление, температура и скорость потока, могут контролироваться компьютером.
Есть несколько ограничений в цепи перфузии. Матка и яичники у самок мышей не могут быть перелиты из-за перевязки яичников артерии и вены. Кроме того, мы заметили, что перфузия яичка была неполной, возможно, из-за альтернативного кровоснабжения, не включенных в схему перфузии.
При достаточной практике, процедура канюляции может быть выполнена в течение 20-30 мин с показателем успеха более 80%. Коэффициент успеха во многом зависит от способности канюляции аорты и вены кавы без прокола судна, как это обсуждалось в шаге 2.7. Важно на второй шаг, чтобы свести к минимуму травмы тканей и мелких кровеносных сосудов в хирургической области из-за потенциальных утечек и потери перфузии. В шаге 2.5, нужно всегда проколоть артерию сперва, и принять меры предосторожности так, что катетер не будет вытягиван вне. В шаге 3, при подключении катетеров 'конец трубки, убедитесь, что держать катетер плотно с помощью porte-aiguille, чтобы избежать перемещения иглы. Кровяное давление прямо пропорционально скорости потока; поэтому скорость течения перфузии должна быть ниже 0,6 мл/мин для поддержания физиологического давления. Наконец, предпочтительно поддерживать сердцебиение до тех пор, пока цепь перфузии закрыта, так как это улучшит перфузию микроваскулатуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Исследование было поддержано NIH грант CA194058 DS, Skaggs школа фармации ADR программы субсидирования семян (DS); Национальный фонд естественных наук Китая (Грант No 317771093), Проект международного сотрудничества провинции Цзилинь (No.20180414085Г), Фонд фундаментальных исследований для центральных университетов, Программа для JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125 (2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419 (2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986 (2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).
