Summary
मूत्राशय, प्रोस्टेट, यौन अंगों, हड्डी, मांसपेशियों और पैर की त्वचा सहित माउस निचले शरीर के सीटू परफ्यूजन में एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।
Abstract
पूर्व वीवो परफ्यूजन अलग अंगों (जैसे यकृत, गुर्दे) के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण शारीरिक उपकरण है। साथ ही, माउस अंगों के छोटे आकार के कारण, हड्डी, मूत्राशय, त्वचा, प्रोस्टेट और प्रजनन अंगों का पूर्व वीवो पर्फ्यूजन चुनौतीपूर्ण है या व्यवहार्य नहीं है। यहां, हम पहली बार चूहों में सीटू लोअर बॉडी परफ्यूजन सर्किट में रिपोर्ट करते हैं जिसमें उपरोक्त ऊतक शामिल हैं, लेकिन मुख्य निकासी अंगों (गुर्दे, यकृत और तिल्ली) को नजरअंदाज करते हैं। सर्किट इलियाक धमनी और नस और कौतारीय रक्त वाहिकाओं के ऊपर पेट महाधमनी और अवर वेना कावा को कैनुलाटिंग करके स्थापित किया गया है। पर्फ्यूजन 2 घंटे तक बनाए रखा परफ्यूज़ेट प्रवाह के साथ एक परिष्ट पंप के माध्यम से किया जाता है। फ्लोरोसेंट लेक्टिन और होचस्ट समाधान के साथ सीटू धुंधला में पुष्टि की गई कि माइक्रोवसकुलेचर को सफलतापूर्वक केंद्रित किया गया था। यह माउस मॉडल रोग प्रक्रियाओं के साथ-साथ दवा वितरण के तंत्र, ट्यूमर कोशिकाओं को परिसंचारी के प्रवासन/मेटास्टेसिस और पर्फ्यूस्ड अंगों और ऊतकों के साथ प्रतिरक्षा प्रणाली की बातचीत के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण हो सकता है ।
Introduction
अलग अंग परफ्यूजन मूल रूप से प्रत्यारोपण1,,2,3के लिए अंग शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया था, और अन्य शरीर प्रणालियों के हस्तक्षेप के बिना अंगों के कार्यों की समझ सक्षम।, उदाहरण के लिए, अलग-थलग पड़े गुर्दे और हृदय परफ्यूजन हीमोडायनामिक्स के बुनियादी सिद्धांतों और वासोएक्टिव एजेंटों के प्रभावों को समझने में बेहद उपयोगी था, जबकि स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतक,,4, 5,6,,57में दवा चयापचय सहित मेटाबोलिक कार्य को समझने के लिए यकृत परफ्यूजन महत्वपूर्ण था। इसके अलावा, प्रत्यारोपण के लिए इरादा अंगों की व्यवहार्यता और कार्य को समझने में परफ्यूजन अध्ययन महत्वपूर्ण थे। कैंसर शोध खोज में, माउस, चूहे, और हौसले से पुनः प्राप्त मानव ऊतकों का उपयोग करके कई समूहों द्वारा अलग ट्यूमर परफ्यूजन का वर्णन किया गया है8,,9। कुछ अलग ट्यूमर परफ्यूजन में, ट्यूमर अंडाशय वसा पैड में प्रत्यारोपित किया गया था मेसेंट्रीधमनी 10से रक्त वाहिकाओं की आपूर्ति ट्यूमर के विकास के लिए मजबूर करने के लिए । जैन समूह ने ट्यूमर हीमोडायनामिक्स और मेटास्टेसिस 8 , 11 ,,,12,813को समझने के लिए पेट एडेनोकार्सिनोमा के अलग - थलग परफ्यूजन का उपयोग करके अग्रणी अध्ययन किए ।13 अन्य अभिनव इंजीनियर पूर्व वीवो सेटअप में प्राथमिक मानव मल्टीपल मायलोमा कोशिकाओं को संस्कृति के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट-आधारित परफ्यूजन डिवाइस और इंजीनियरिंग बोन मैरो आर्किटेक्चर और फंक्शन रिसर्च15के लिए मॉड्यूलर फ्लो चैंबर शामिल है।14
शरीर विज्ञान और पैथोलॉजी अध्ययन के अलावा, दवा वितरण के बुनियादी सिद्धांतों का अध्ययन करने के लिए अंग परफ्यूजन का उपयोग किया गया है। इस प्रकार, एक समूह ने अलग चूहे के अंग परफ्यूजन का वर्णन किया और प्रत्यारोपित सारकोमा16में लिपोसोम के संचय का अध्ययन किया, जबकि एक अन्य समूह ने नैनोकणों के एंडोथेलियल लक्ष्यीकरण का अध्ययन करने के लिए मानव गुर्दे के परफ्यूजन का अध्ययन किया। टेरनुलो एट अल ने एक अलग-थलग मानव त्वचा फ्लैप का उपयोग वीवो त्वचा दवा प्रवेश मॉडल18के रूप में किया।
बड़े अंगों और ऊतकों के परफ्यूजन में इन प्रगति के बावजूद, चूहों में सीटू परफ्यूजन मॉडल में कोई रिपोर्ट नहीं आई है: ए) यकृत, तिल्ली और गुर्दे जैसे निकासी अंगों को बाईपास करें; ख) में पेल्विक अंग, त्वचा, मांसपेशी, प्रजनन अंग (पुरुष में), मूत्राशय, प्रोस्टेट और बोन मैरो शामिल हैं। इन अंगों के छोटे आकार और आपूर्ति वाले वैक्यूलेचर, पूर्व वीवो कैनुलेशन और परफ्यूजन सर्किट की स्थापना के कारण संभव नहीं हो पाया है। माउस कैंसर और इम्यूनोलॉजी अनुसंधान, और दवा वितरण में सबसे महत्वपूर्ण पशु मॉडल है। छोटे माउस अंगों को छिद्रित करने की क्षमता इन अंगों को दवा वितरण के बारे में दिलचस्प सवालों की अनुमति होगी, जिसमें श्रोणि (मूत्राशय, प्रोस्टेट, अंडाशय, अस्थि मज्जा) में प्रत्यारोपित ट्यूमर शामिल हैं, साथ ही इन अंगों के रोगों की बुनियादी शरीर विज्ञान और इम्यूनोलॉजी के अध्ययन भी शामिल हैं। इस कमी को दूर करने के लिए, हमने चूहों में सीटू परफ्यूजन सर्किट विकसित किया जो संभावित रूप से ऊतक की चोट से बच सकता है और अलग अंग परफ्यूजन की तुलना में कार्यात्मक अनुसंधान के लिए बेहतर अनुकूल है।
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Protocol
यहां वर्णित सभी तरीकों को यूनिवर्सिटी ऑफ कोलोराडो की इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी (IACUC) ने मंजूरी दे दी है ।
1. परफ्यूजन सिस्टम को प्री-हीट करें
- सभी पानी-जैकेट वाले घटकों (परफ्यूसेट जलाशय, नम कक्ष और ढक्कन) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस परिसंचारी पानी स्नान शुरू करके सर्जरी से पहले परफ्यूजन सिस्टम तैयार करें, जैसा कि चित्र 1 एमें एक अनुकूलित विन्यास में दिखाया गया है। सुनिश्चित करें कि ट्यूबिंग साफ है और यदि आवश्यक हो तो बदलें। परफ्यूसेट वॉल्यूम को सीमित करने के लिए, एक नम कक्ष के भीतर एक बुलबुला जाल का उपयोग परफ्यूसेट जलाशय(चित्रा 1बी-6)के रूप में करें।
2. वैस्कुलर कैथेटराइजेशन
- 0.3 एल/मिनट पर 3-5% आइसोफ्लाणेन और ऑक्सीजन प्रवाह दर के साथ एक आइसोफ्लाणे पशु चिकित्सा संज्ञाहरण मशीन का उपयोग कर एक 8-10 सप्ताह पुराने BALB/c माउस में संज्ञाहरण प्रेरित करें । एक विकल्प के रूप में, केटामाइन/जाइलाज़ीन या किसी अन्य प्रकार के इंट्रापेरिटोनियल एनेस्थीसिया का उपयोग करें। 2 तरीकों से संज्ञाहरण की गहराई का मूल्यांकन करें: अंगुली-चुटकी और कॉर्नियल पलटा।
- डबल आसुत पानी में सुई के साथ एक 4-0 रेशम सीवन prewet।
- एनेस्थेटाइज्ड माउस को स्टायरोफोम बोर्ड पर एक रीढ़ की स्थिति में रखें जिसमें सर्जन का सामना करना पड़ रहा है और टेप के साथ अग्रभाग और पिछले अंगों को स्थिर करें। आइसोप्रोपिल अल्कोहल के साथ पेट को पोंछें और कैंची के साथ "टी" आकार में मिडलाइन के साथ पेट को काटें। इलेक्ट्रोकोटुलेशन (कॉटराइजिंग) द्वारा चीरा के किनारे के चारों ओर रक्तस्राव बंद करो।
- पेट महाधमनी, वेना कावा, और आम इलियाक और इलिओलंबर धमनियों और नसों को प्रकट करने के लिए पेट के दाईं ओर पेट, जेजुनियम और कोलन को पुश करें।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, खोजें और पुरुष में iliolumbar धमनी/नस, और अंडाशय धमनी/नस और iliolumbar धमनी/नस महिला में 4-0 रेशमटांके (चित्रा 2 पीली रेखाओं) का उपयोग कर ।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, पेट महाधमनी और अवर वेना कावा के नीचे दो 4-0 रेशम टांके लूप (इलियाक धमनी और नस के ऊपर लगभग 1 सेमी, 1 मिमी के अलावा, चित्रा 2),और इलियाक जहाजों(चित्रा 2,सफेद बिंदीदार रेखा) के निकटतम सीवन में एक ढीली गाँठ बनाएं। वैकल्पिक रूप से, इस गाँठ के लिए 6-0 रेशम सीवन का उपयोग किया जा सकता है।
- एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, क्षैतिज रूप से संरेखित करें और दोनों अवर वेना कावा और पेट महाधमनी को पोर्टे-एगुइल के साथ फैलाए। पेट महाधमनी पंचर करने के लिए एक 24 जी पंखों वाला ढाल I.V. कैथेटर का प्रयोग करें, सुई कोर वापस लेने के लिए बटन पुश और पोत में 5 मिमी के बारे में कैथेटर डालें ।
- अवर वेना कावा के साथ एक ही प्रक्रिया दोहराएं और कैथेटरीकृत जहाजों के चारों ओर दोनों टांके के समुद्री मील को बांधें।
नोट: सुई आसानी से रक्त वाहिका के माध्यम से पंचर कर सकते हैं; इसलिए, जहाजों को फैलाए रखें और जहाज के साथ सुई समानांतर रखें। जैसे ही सुई पोत में लगभग 1 मिमी प्रवेश करती है, सुई कोर को वापस ले लें। पेट महाधमनी अवर वेना कावा के नीचे है और संयोजी ऊतक में संलग्न होने के कारण बहुत पतले और अधिक लोचदार हैं। इसलिए, महाधमनी कैथेटर के लिए "पकड़" कर सकते हैं, और इस प्रकार कैथेटर बाहर फिसल की संभावना को कम करने के लिए वेना कावा से पहले कैथेटर किया जाना चाहिए ।
- अवर वेना कावा के साथ एक ही प्रक्रिया दोहराएं और कैथेटरीकृत जहाजों के चारों ओर दोनों टांके के समुद्री मील को बांधें।
- कैथेटर को इरेक्टर स्पाइन में स्थिर करने, पेट के अंगों को बदलने और संज्ञाहरण बनाए रखते हुए सर्जरी समाप्त करने के लिए तत्काल गोंद लागू करें।
नोट: जिन अंगों को पूरी तरह से पेट की गुहा में नहीं बदला जा सकता है, उन्हें परफ्यूजन प्रक्रिया के दौरान समय-समय पर परफ्यूजन माध्यम से गीला करने की आवश्यकता होगी।
3. परफ्यूजन सिस्टम सेट करें
- एक सिलिकॉन पैड पर 37 डिग्री सेल्सियस तक पहले से बने पानी के जैकेट वाले नम कक्ष में माउस को स्थानांतरित करें और कैथेटर पंखों को 19 जी सुइयों के साथ पैड में स्थिर करें।
- प्रीवार्म्ड परफ्यूजन बफर (रिंगर के लैक्टेट समाधान 5% बीएसए के साथ पूरक) के साथ धमनी कैथेटर के अंत (इनलेट) को भरें, और फिर स्क्रू-ऑन कनेक्टर(चित्रा 1 बी,लाल तीर) का उपयोग करके कैथेटर अंत को इनलेट पर्फ्यूजन ट्यूबिंग से जोड़ें।
नोट: कन्वरेटर को हीमोस्टैटिक संदंश के साथ पकड़ें और कैथेटर को ले जाने से बचने के लिए टेप के साथ ट्यूबिंग को स्थिर करें। - परिस्थित प्रवाह दर को 0.6 एमएल/न्यूनतम में समायोजित करें और वेनस कैथेटर के माध्यम से रक्त को धोने के लिए 5-10 मिनट के लिए पर्फ्यूजन आउटफ्लो(चित्रा 1B,नीला तीर) को खुला रखें। आउटलेट कैथेटर में कुछ थक्के होंगे; परफ्यूजन सर्किट को बंद करने से पहले परफ्यूजन बफर के साथ थक्के को बाहर निकालें।
- सर्किट(चित्रा 1B)को बंद करने के लिए एक स्क्रू-ऑन कनेक्टर का उपयोग करके आउटलेट ट्यूबिंग के साथ शिरस कैथेटर के अंत को कनेक्ट करें। इस बिंदु पर, सीओ2 गैस इच्छामृत्यु करें और छाती पंचर या किसी अन्य विधि से सत्यापित करें।
- नम कक्ष को गर्म ढक्कन से ढक दें। समय-समय पर परफ्यूसेट के स्तर की जांच करें और यदि आवश्यक हो तो अधिक जोड़ें। परफ्यूजन 2 घंटे तक किया जा सकता है।
नोट: बंद परफ्यूजन सिस्टम स्थापित करने के लिए 5 एमएल परफ्यूज़ेट की आवश्यकता होगी। यदि कोई लीक या एडिमा नहीं है, तो परफ्यूसेट की मात्रा 1 मिलील से कम हो जाएगी और अतिरिक्त बफर की आवश्यकता नहीं होगी। परिधीय परिसंचारी थ्रोम्बस से प्रेरित एडिमा से बचने के लिए, 0.002% हेपरिन युक्त परफ्यूजन बफर का उपयोग पहले 10 मिनट के परफ्यूजन में किया जा सकता है, लेकिन चीरों के किनारे पर लीक होने से बचने के लिए हेपरिन के बिना बफर में बदला जाना चाहिए। - यदि आवश्यक हो, तो किसी भी समय परफ्यूजन जलाशय या इंजेक्शन पोर्ट में पसंद का एक अभिवाक जोड़ें(चित्रा 1बी-5)। उदाहरण के लिए, 10 मिलीग्राम/एमएल Hoechst33342 के 10 μL परफ्यूजन के अंत से पहले सेल नाभिक 2 घंटे दाग करने के लिए परफ्यूज में जोड़ा जा सकता है, या 1 मिलीग्राम/mL DyLight ६४९ के ५० माइक्रोन-lectin के लिए वैस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को दाग 30 मिनट से पहले ।
नोट: यदि Hoechst समाधान के साथ अस्थि मज्जा दाग करने का प्रयास, चूहों को सर्जरी से पहले 30 मिनट पूर्व इंजेक्शन की आवश्यकता होगी । - फ्लोरोसेंट रिएजेंट्स के साथ परफ्यूजन के बाद, पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए एक और 10 मिनट के लिए परफ्यूजन बफर के साथ धोएं।
4. परफ्यूज अंगों का विश्लेषण
- टेस्टिस, प्रोस्टेट, मूत्राशय, फीमर, मांसपेशी और त्वचा (जैसे, पैर) सहित अंगों को इकट्ठा करें। उत्पाद शुल्क के बारे में अंग का एक टुकड़ा 1मिमी 3 और दो गिलास स्लाइड के बीच समतल।
- DaPI/Cy5 उत्तेजन और उत्सर्जन फिल्टर (उत्तेजन लेजर: DAPI, ४०५ एनएम; का उपयोग कर उल्टे फ्लोरोसेंट कंफोकल माइक्रोस्कोप के तहत अध्ययन; Cy5,640 एनएम) । 0.45 न्यूमेरिकल अपर्चर के साथ कम से कम 200x आवर्धन उद्देश्य का उपयोग करें।
- वैकल्पिक रूप से, 24 घंटे के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड समाधान के साथ अंगों को ठीक करें और हेमटॉक्सीलिन-इओसिन स्टेनिंग19करें।
- बरकरार अस्थि मज्जा अवलोकन के लिए एक हड्डी खिड़की बनाने के लिए, फीमर या टिबिया के दोनों सिरों को स्थिर करें और पेरिओस्टियम का पर्दाफाश करने के लिए 19 जी सुई के पार्श्व किनारे के साथ कॉर्टिकल हड्डी को दूर करें; अवशिष्ट हड्डी की एक पतली परत रखने के लिए ध्यान रखना। ऊपर वर्णित DAPI और Cy5 चैनलों का उपयोग करके उल्टे फ्लोरोसेंट कंफोकल माइक्रोस्कोप के साथ कांच और छवि का सामना कर रही खिड़की के साथ एक कवर स्लिप पर हड्डी रखें। बोन मैरो गुहा में कोशिकाओं और संवहनी नेटवर्क को आसानी से देखा जा सकता है।
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Representative Results
हम पेट महाधमनी के कैनुलेशन और 8-10 सप्ताह पुराने चूहों के अवर वेना कावा के माध्यम से एक बंद सर्किट पर्फ्यूजन प्रणाली की स्थापना की, जबकि 10 एमएल से कम परफ्यूजन बफर की मात्रा रखते हुए । चित्रा 3A रिंगर के समाधान के साथ ऊतकों को छिद्रित करने के बाद कॉन्फोकल छवियों को दिखाता है जिसमें होचस्ट 33342 और डाइलाइट 649-लेक्टिन शामिल हैं। मांसपेशी, बोन मैरो, टेस्टिस, मूत्राशय, प्रोस्टेट, और पैर की त्वचा कुशल परमाणु और संवहनी धुंधला दिखाते हैं। चित्रा 3B नॉर्मोथर्मिक परफ्यूजन के 3 घंटे बाद अंगों के हेमटॉक्सीलिन-ईओसिन धुंधला दिखाता है।
चित्रा 1. सरलीकृत परफ्यूजन सेटअप। (क)प्रणाली में (1) एक दबाव/प्रवाह दर नियंत्रक, (2) एक परिसंचारी गर्म पानी स्नान, (3) गर्म कवर और कस्टम स्टायरोफोम स्पेसर के साथ एक गर्म नम कक्ष, और (4) एक पेरिस्टाल्टिक पंप शामिल हैं । (ख)परफ्यूजन सर्किट इनलेट (लाल रेखाएं) और आउटलेट (नीली रेखाएं), (5) इंजेक्शन बंदरगाह और (6) अनुकूलित परफ्यूजन जलाशय दिखाता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2। नर और मादा चूहों में लिगाटेड और कैनुलेटेड रक्त वाहिकाओं का स्थान। रक्त वाहिकाओं को रेखांकित करने के लिए, परफ्यूजन के अंत से पहले 5 माइक्रोन/किलो 1% इवांस ब्लू डाई को परफ्यूजन मीडियम 30 मिनट में जोड़ा गया था । मादा चूहों में, इलिओलंबर और अंडाशय की धमनियों और नसों दोनों को लिगा किया जाता है। नर चूहों में, इलियोलिंबर धमनी और नस को लिगा किया जाता है। पीली और सफेद रेखाएं लिगेशन नॉट की अनुमानित स्थिति दिखाती हैं; पीले तीर वास्तविक टांके और समुद्री मील दिखाते हैं। दोनों शिरीकार और धमनी कैथेटर डाले जाते हैं। प्रदर्शन के प्रयोजनों के लिए आंतों को हटा दिया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 3। कॉन्फोकल और एच एंड ई छवियां 3 घंटे के लिए अंगों के सफल परफ्यूजन दिखाती हैं जिसमें कोई स्पष्ट ऊतक चोट नहीं है। कॉन्फोकल स्केल बार: बोन मैरो के लिए 20 माइक्रोन और अन्य अंगों के लिए 100 माइक्रोन। एच एंड ई स्केल बार: 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वर्णित सर्किट का उपयोग विभिन्न शोध प्रश्नों की जांच करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए दवा वितरण, या प्रतिरक्षा और स्टेम सेल तस्करी में विभिन्न सीरम घटकों और ऊतक बाधाओं की भूमिका। प्रसव में शारीरिक और जैव रासायनिक कारकों की भूमिका को समझने के लिए विभिन्न दवा वितरण प्रणालियों (जैसे, लिपोसोम्स और नैनोकण) को परफ्यूसेट में जोड़ा जा सकता है। परफ्यूजन की अवधि ऊतक अध्ययन, वैज्ञानिक लक्ष्यों और परफ्यूसेट की संरचना के आधार पर भिन्न हो सकती है। हम यहां लैक्टेट और एल्बुमिन के साथ रिंगर के समाधान से मिलकर एक बुनियादी परफ्यूजन मीडिया का उपयोग करके 2 घंटे तक परफ्यूजन के परिणाम पेश करते हैं। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वर्तमान कार्य का लक्ष्य पर्फ्यूजन सर्किट को विकसित करने और अनुकूलित करने के बजाय परफ्यूजन माध्यम और शर्तों को इष्टतम अंग/ऊतक समारोह और ऑक्सीजन का समर्थन करने के लिए स्थापित करना था । पिछले साहित्य में पोषक तत्वों, विटामिन, हार्मोन और रक्त कोशिकाओं के अलावा बड़े पैमाने पर जांच की गई है, और मानव और पशु ऊतकों में दर्जनों शोध प्रकाशनों,,11,,7,9, 10,11, 12, 13, 16,13,,,17,17,20,,21में कई परफ्यूजन मीडिया और ऑक्सीजनेशन प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है।12 परफ्यूसेट संरचना के शोधन के साथ-साथ ऑक्सीजन शरीर के तापमान पर ऊतक चयापचय के दीर्घकालिक रखरखाव को सक्षम कर सकता है। इस प्रकार, कुछ समूहों ने लाल रक्त कोशिकाओं और रक्त ऑक्सीजन का उपयोग किया, जो संवेदनशील ऊतकों की व्यवहार्यता में काफी सुधार करता है17। पर्फ्यूजन नियंत्रण भी अत्यधिक अनुकूलन योग्य हैं; यदि आवश्यक हो, तो ऑक्सीजन और दबाव मनोमीटर को नियंत्रित करने के लिए एक गैस कई गुना जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, एक बड़ा परफ्यूसेट कक्ष का उपयोग किया जा सकता है, और दबाव, तापमान और प्रवाह दर जैसे शारीरिक मापदंडों को कंप्यूटर द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है।
परफ्यूजन सर्किट में कई सीमाएं हैं। अंडाशय धमनी और नस के बंधन के कारण मादा चूहों में गर्भाशय और अंडाशय को छिद्रित नहीं किया जा सका। इसके अलावा, हमने देखा कि टेस्टिस का पर्फ्यूजन अधूरा था, संभवतः वैकल्पिक रक्त आपूर्ति के कारण परफ्यूजन सर्किट में शामिल नहीं था।
पर्याप्त अभ्यास के साथ, कैनुलेशन प्रक्रिया 80% से अधिक की सफलता दर के साथ 20-30 मिनट के भीतर किया जा सकता है। सफलता की दर अत्यधिक चरण 2.7 में चर्चा के रूप में पोत पंचर के बिना महाधमनी और वेना कावा कैनुलेट करने की क्षमता पर निर्भर करता है। संभावित लीक और परफ्यूसेट की हानि के कारण सर्जिकल क्षेत्र में ऊतकों और छोटे रक्त वाहिकाओं को चोट को कम करने के लिए चरण 2 में महत्वपूर्ण है। चरण 2.5 में, हमेशा धमनी को पहले पंचर करना चाहिए, और सावधानी बरतें ताकि कैथेटर को बाहर नहीं निकाला जा सके। चरण 3 में, कैथेटर के अंत को टयूबिंग से जोड़ते समय, सुई को आगे बढ़ने से बचने के लिए कैथेटर को पोर्टे-एगुइल का उपयोग करके कसकर पकड़ना सुनिश्चित करें। रक्तचाप प्रवाह दर के लिए सीधे आनुपातिक है; इसलिए, शारीरिक दबाव बनाए रखने के लिए परफ्यूसेट की प्रवाह दर 0.6 एमएल/न्यूनतम से कम होनी चाहिए। अंत में, यह दिल की धड़कन को बनाए रखने के लिए पसंद किया जाता है जब तक परफ्यूजन सर्किट बंद हो जाता है, क्योंकि इससे माइक्रोवसकुलेचर के परफ्यूजन में सुधार होगा।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
अध्ययन एनआईएच अनुदान CA194058 द्वारा डीएस, स्काग्स स्कूल ऑफ फार्मेसी एडीआर सीड ग्रांट प्रोग्राम (डीएस) को समर्थित किया गया था; नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (ग्रांट नंबर 31771093), जिजिन प्रांत के अंतरराष्ट्रीय सहयोग की परियोजना (संख्या 201180414085GH), केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान कोष, जेएनएलयू विज्ञान और प्रौद्योगिकी अभिनव अनुसंधान टीम (2017TD-27, 2019TD-36) के लिए कार्यक्रम।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125 (2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419 (2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A. Gluconeogenesis in the perfused rat liver. Biochemical Journal. 101 (2), 284-292 (1966).
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986 (2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).
