Summary
Ett protokoll beskrivs för in situ perfusion av musens underkropp, inklusive urinblåsan, prostatan, könsorgan, ben, muskler och fot hud.
Abstract
Ex vivo perfusion är ett viktigt fysiologiskt verktyg för att studera funktionen hos isolerade organ (t.ex. lever, njurar). Samtidigt, på grund av den lilla storleken på musorgan, ex vivo perfusion av ben, urinblåsa, hud, prostata, och reproduktiva organ är utmanande eller inte genomförbart. Här rapporterar vi för första gången en in situ underkroppperfusion krets hos möss som innehåller ovanstående vävnader, men kringgår de viktigaste clearance organ (njure, lever och mjälte). Kretsen är etablerad genom kanylerande buken stora kroppspulsådern och sämre vena cava ovanför höftartären och ven och cauterizing perifera blodkärl. Perfusion utförs via en peristaltisk pump med perfusat flöde bibehålls i upp till 2 h. In situ färgning med fluorescerande lektin och Hoechst lösning bekräftade att microvasculature var framgångsrikt perfused. Denna mus modell kan vara ett mycket användbart verktyg för att studera patologiska processer samt mekanismer för läkemedelstillförsel, migration / metastasering av cirkulerande tumörceller till/ från tumör, och interaktioner av immunsystemet med perfunderade organ och vävnader.
Introduction
Isolerade organ perfusion utvecklades ursprungligen för att studera organfysiologi för transplantation1,2,3,och möjliggjorde förståelse av funktioner i organ utan störningar från andra kroppssystem. Till exempel, isolerade njure och hjärta perfusion var oerhört användbart för att förstå grundläggande principer för hemodynamik och effekter av vasoaktiva medel, medan leverperfusion var viktigt att förstå den metaboliska funktionen, inklusive läkemedelsmetabolism i friska och sjuka vävnad4,5,6,7. Dessutom var perfusionsstudier avgörande för att förstå livskraft och funktion hos organ avsedda för transplantation. I Cancer Researchearch, isolerade tumör perfusion har beskrivits av flera grupper med hjälp av mus, råtta, och nyligen resected mänskliga vävnader8,9. I vissa isolerade tumör perfusion, tumören implanterades i äggstocken fett pad att tvinga tillväxten av tumör levererar blodkärl från mesenteri artär10. Jain gruppen utfört banbrytande studier med isolerad perfusion av kolon adenokarcinom att förstå tumör hemodynamik och metastasering8,11,12,13. Andra innovativa konstruerade ex vivo-inställningar inkluderar en 96-väl plåtbaserad perfusionsenhet för att odla de primära mänskliga multipelt myelomcellerna14 och en modulär flödeskammare för ingenjörskonsterad benmärgsarkitektur och funktionsforskning15.
Förutom fysiologi och patologi studier, organ perfusion har använts för att studera de grundläggande principerna för läkemedelstillförsel. Således beskrev en grupp isolerade råtta lem perfusion och studerade ansamling av liposomer i implanterade sarkom16, medan en annan grupp utförs dissekeras mänskliga njurperfusion att studera endotel inriktning av nanopartiklar17. Ternullo et al. använde en isolerad perfunderad mänsklig hudflik som en nära-till-in vivo hud drog penetration modell18.
Trots dessa framsteg i perfusion av stora organ och vävnader, det har inte förekommit några rapporter om in situ perfusion modeller hos möss som: a) kringgå clearance organ såsom lever, mjälte och njurar; b) inkluderar bäckenorgan, hud, muskler, reproduktionsorgan (hos män), urinblåsa, prostata och benmärg. På grund av dessa organs ringa storlek och den tillförsel vasculature, ex vivo cannulation och etablering av en perfusion krets har inte varit möjligt. Musen är den viktigaste djurmodellen inom cancer- och immunologiforskning och läkemedelsleverans. Förmågan att granska små musorgan skulle tillåta intressanta frågor om läkemedelsleverans till dessa organ, inklusive till tumörer implanteras i bäckenet (urinblåsan, prostata, äggstock, benmärg), som skall besvaras, samt studier av grundläggande fysiologi och immunologi av sjukdomar i dessa organ. För att åtgärda denna brist utvecklade vi en in situ perfusion krets hos möss som potentiellt kan undvika vävnadsskada och är mycket bättre lämpad för funktionell forskning än isolerade organ perfusion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoder som beskrivs här har godkänts av University of Colorado's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Förvärm perfusionssystemet
- Förbered perfusionssystemet före operationen genom att starta ett 37 °C cirkulerande vattenbad för alla vattenmantlade komponenter (perfusatreservoar, fuktig kammare och lock) enligt bilden i figur 1A. Se till att slangen är ren och byt ut vid behov. För att begränsa perfusatvolymen, använd en bubbelfälla i en fuktig kammare som perfusatbehållaren (figur 1B-6).
2. Vaskulär kateterisering
- Inducera anestesi i en 8-10 veckor gammal BALB /c mus med hjälp av en isofluran veterinärisk anestesi maskin med 3-5% isofluran och syreflöde vid 0,3 L/min. Som ett alternativ, använd ketamin/xyazin eller någon annan typ av intraperitoneal anestesi. Utvärdera djupet av anestesi med 2 metoder: tå-nypa och hornhinnans reflex.
- Prewet en 4-0 siden sutur med nål i dubbel destillerat vatten.
- Placera den sövda musen i en supine position på en frigolit ombord med huvudet mot kirurgen och immobilisera framben och bakben med tejp. Torka buken med isopropylalkohol och skär buken längs mittlinjen i en "T"-form med sax. Stoppa blödningen runt snittets kant genom elektrokoagulation (cauterizing).
- Tryck magen, jejunum och kolon till höger sida av buken för att avslöja bukaorta, vena cava, och vanliga iliaca och iliolumbar artärer och vener.
- Under en dissekering mikroskop, hitta och ligate iliolumbar artär / ven i hanen, och äggstocksartären / ven och iliolumbar artär / ven i honan med 4-0 silke suturer (Figur 2 gula linjer).
- Under en dissekering mikroskop, slinga två 4-0 silke suturer under buken stora kroppspulsådern och sämre vena cava (ca 1 cm över höftbenet artär och ven, 1 mm isär, figur 2), och gör en lös knut i suturen närmast höftbenet(Figur 2, vit prickad linje). Alternativt kan en 6-0 siden sutur användas för denna knut.
- Under en dissekering mikroskop, horisontellt anpassa och sträcka både sämre vena cava och buken stora kroppspulsåder med porte-aiguille. Använd en 24 G bevingad skärmad I.V. kateter för att punktera bukaortan, tryck på knappen för att dra tillbaka nålkärnan och för in katetern ca 5 mm i kärlet.
- Upprepa samma procedur med sämre vena cava och binda upp knutar av båda suturer runt de kateteriserade kärlen.
OBS: Nålen kan lätt punktera genom blodkärlet; håll därför kärlen utsträckta och nålen parallellt med kärlet. Dra tillbaka nålkärnorna så snart nålen tränger in ca 1 mm i kärlet. Buken stora kroppspulsåder är under sämre vena cava och mycket tunnare och mer elastisk på grund av att vara innesluten i bindväv. Därför kan aorta "hålla fast" på katetern, och bör därför kateteriseras innan vena cava för att minska sannolikheten för att katetern glider ut.
- Upprepa samma procedur med sämre vena cava och binda upp knutar av båda suturer runt de kateteriserade kärlen.
- Applicera omedelbar lim för att immobilisera katetrar till erector spinae, ersätta bukorganen, och avsluta operationen samtidigt som anestesi.
OBS: Organ som inte helt kan ersättas i bukhålan måste regelbundet fuktas med perfusionsmedium under perfusionsprocessen.
3. Ställ in perfusionssystemet
- Överför musen till den vattenmantlade fuktiga kammaren som är förväxlad till 37 °C på en silikondyna och immobilisera katetervingarna till dynan med 19 G nålar.
- Fyll arteriella kateterns ände (inlopp) med förvärmd perfusionsbuffert (Ringers laktatlösning kompletterad med 5% BSA) och anslut sedan kateteränden med inloppsperfusionsslangen med en skruvkontakt (figur 1B, röd pil).
OBS: Håll kontakten med hemostatiska pincett och immobilisera slangen med tejp för att undvika att flytta katetrerna. - Justera det peristaltiska flödet till 0,6 ml/min och håll perfusionsutflödet (bild 1B,blå pil) öppet i 5-10 minuter för att tvätta bort blodet genom venkatetern. Det kommer att finnas några blodproppar i utloppskatetern; spola ut propparna med perfusatbuffert innan du stänger perfusionskretsen.
- Anslut venkateterns ände med utloppsslangen med en skruvkontakt för att stänga kretsen (bild 1B). Vid denna punkt, utför CO2 gas dödshjälp och kontrollera genom bröstet punktering eller någon annan metod.
- Täck den fuktiga kammaren med det uppvärmda locket. Kontrollera nivån av perfusate regelbundet och lägga till fler om det behövs. Perfusion kan utföras i upp till 2 timmar.
OBS: 5 ml perfusat kommer att behövas för att ställa in det slutna perfusionssystemet. Om det inte finns någon läckande eller ödem kommer volymen av perfusate att minska med mindre än 1 ml och ytterligare buffert kommer inte att behövas. För att undvika ödem framkallas av perifera cirkulerande trombos, perfusion buffert som innehåller 0,002% heparin kan användas under de första 10 minuterna av perfusion, men bör ändras till buffert utan heparin för att undvika läckage vid kanten av snitten. - Tillsätt vid behov ett reagens som du väljer i perfusionsbehållaren eller till injektionsporten när som helst (figur 1B-5). Till exempel kan 10 μL av 10 mg/mL Hoechst33342 tillsättas i perfusatet för att färga cellkärnorna 2 h före slutet av perfusion, eller 50 μL 1 mg/ml dylight 649-lectin för att färga de vaskulära endotelcellerna 30 min före slutet av perfusion.
OBS: Om du försöker färga benmärgen med Hoechst-lösning måste möss injiceras i förväg 30 minuter före operationen. - Efter perfusion med fluorescerande reagenser, tvätta bort med perfusionsbuffert i ytterligare 10 minuter för att minimera bakgrundsfluorescensen.
4. Analys av perfunderade organ
- Samla organ inklusive testikel, prostata, urinblåsa, lårben, muskler och hud (t.ex. fötter). Punktskatt en bit organ ca 1 mm3 och platta mellan två glasglas.
- Studie under inverterad fluorescerande konfokalmikroskop med HJÄLP AV DAPI/Cy5-excitations- och emissionsfilter (excitationslasrar: DAPI, 405 nm; Cy5 640 nm). Använd minst 200x förstoringsmål med en 0,45 numerisk bländare.
- Alternativt, fixa organ med 4% formaldehyd lösning för 24 h och utföra hematoxylin-eosin färgning19.
- För att skapa ett benfönster för intakt benmärgsobservation, immobilisera båda ändarna av lårbenet eller skenbenet och skrapa bort det kortikala benet med den laterala kanten av en 19 G nål för att exponera periosteumet; var noga med att hålla ett tunt lager av kvarvarande ben. Placera ben på en täckslip med fönstret mot glaset och bilden med inverterat fluorescerande konfokalmikroskop med DAPI- och Cy5-kanaler enligt beskrivningen ovan. Cellerna och kärlnätverket i benmärgshålan kan lätt observeras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi sätter upp en sluten krets perfusion system genom cannulation av buken stora kroppspulsåder och sämre vena cava av 8-10 veckor gamla möss samtidigt som volymen av perfusion buffert mindre än 10 ml. Figur 3A visar konfokala bilder efter perfusing vävnader med Ringer lösning som innehåller Hoechst 33342 och DyLight 649-lectin. Muskel, benmärg, testikel, urinblåsa, prostata och fot hud visar effektiv nukleära och vaskulär färgning. Figur 3B visar hematoxylin-eosin färgning av organ efter 3 timmars normothermic perfusion.
Figur 1. Förenklad perfusionsinställning. (A)Systemet omfattar (1) en tryck-/flödesregulator, (2) ett cirkulerande uppvärmt vattenbad, (3) en uppvärmd fuktig kammare med uppvärmt lock och anpassad frigolitrymd, och (4) en peristaltisk pump. (B)Perfusionskretsen visar inlopp (röda linjer) och utlopp (blå linjer), (5) insprutningsporten och (6) den anpassade perfusionsbehållaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Placering av ligated och kanylerade blodkärl i manliga och kvinnliga möss. För att beskriva blodkärlen tillsatts 5 μL/kg 1% Evans Blue dye perfusion medium 30 min före slutet av perfusionen. Hos honmöss är både iliolumbal och äggstocksartärer och vener ligated. Hos hanmöss är iliolumbar artär och ven ligated. Gula och vita linjer visar ungefärlig position för ligering knutar; gula pilar visar faktiska suturer och knutar. Både venösa och arteriella katetrar sätts in. Tarmar togs bort för demonstration ändamål. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Confocal och H & E bilder visar framgångsrika perfusion av organ för 3 h utan uppenbar vävnad skada. Konfikafjällstång: 20 μm för benmärg och 100 μm för andra organ. H&E-skalstång: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den beskrivna kretsen kan användas för att undersöka olika forskningsfrågor, till exempel rollen av olika serumkomponenter och vävnadsbarriärer vid läkemedelsleverans, eller immun- och stamcellshandel. Olika drug delivery-system (t.ex. liposomer och nanopartiklar) kan läggas till perfusatet för att förstå de fysiologiska och biokemiska faktorernas roll vid leverans. Varaktigheten av perfusion kan variera, beroende på vävnaden studerade, vetenskapliga mål, och sammansättningen av perfusate. Vi presenterar här resultaten av perfusion upp till 2 h med hjälp av en grundläggande perfusion media bestående av Ringer lösning med laktat och albumin. Det måste noteras att målet med det nuvarande arbetet var att fastställa perfusion kretsen snarare än att utveckla och optimera perfusion medium och villkor för att stödja optimal organ / vävnad funktion och syresättning. Tillsats av näringsämnen, vitaminer, hormoner och blodkroppar har undersökts utförligt i den tidigare litteraturen, och många perfusion media och syresättning protokoll har beskrivits i dussintals forskningspublikationer i mänskliga och animaliska vävnader7,9,10,11,12,13,16,17,20,21. Förbättringar av perfusatsammansättningen samt syresättning kan möjliggöra långsiktigt underhåll av vävnadsmetabolism vid kroppstemperatur. Således använde vissa grupper röda blodkroppar och syresättning i blodet, vilket avsevärt förbättrar livskraften hos känsliga vävnader17. Perfusion kontroller är också mycket anpassningsbara; Vid behov kan en gasgrenrör för att kontrollera syresättning och tryckmanometer läggas till. Dessutom kan en större perfusate kammare användas, och de fysiologiska parametrarna såsom tryck, temperatur och flöde kan styras av en dator.
Det finns flera begränsningar i perfusionskretsen. Livmodern och äggstockarna hos kvinnliga möss kunde inte perfunderas på grund av ligering av äggstocksartär och ven. Dessutom observerade vi att perfusion av testikel var ofullständig, möjligen på grund av alternativ blodtillförsel som inte ingår i perfusion kretsen.
Med tillräcklig praxis kan cannlering förfarandet utföras inom 20-30 min med en framgång på över 80%. Framgången beror mycket på förmågan att kannleriera och vena cava utan att punktera fartyget som diskuteras i steg 2.7. Det är viktigt i steg 2 för att minimera skador på vävnader och små blodkärl i det kirurgiska området på grund av potentiella läckor och förlust av perfusat. I steg 2.5 måste man alltid punktera artären först och vidta försiktighetsåtgärder så att katetern inte dras ut. I steg 3, när katetrernas ände ansluts till slangen, se till att hålla katetern tätt med porte-aiguille för att undvika att flytta nålen. Blodtrycket är direkt proportionellt mot flödeshastigheten; Därför måste perfusatflödet vara lägre än 0,6 ml/min för att bibehålla det fysiologiska trycket. Slutligen är det föredras att behålla hjärtslagen tills perfusionskretsen är stängd, eftersom detta kommer att förbättra perfusion av mikrovaskulatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Studien stöddes av NIH-bidraget CA194058 till DS, Skaggs School of Pharmacy ADR seed grant program (DS); National Natural Science Foundation of China (anslag nr 31771093), projektet för internationellt samarbete av Jilin-provinsen (no.201180414085GH), grundforskningsfonderna för de centrala universiteten, programmet för JLU Science and Technology Innovative Research Team (2017TD-27, 2019TD-36).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 3.5x-90x stereo zoom microscope on boom stand with LED light | Amscope | SKU: SM-3BZ-80S | |
| Carbon dioxide, USP | Airgas healthcare | 19087-5283 | |
| Confocal microscope | NIKON | ECLIPSE Ti2 | |
| Disposable Sterile Cautery Pen with High Temp | FIAB | F7244 | |
| Moist chamber bubble trap (part 6 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733692 | Customized as the perfisate container; also enabled constant pressure perfusion |
| Moist chamber cover with quartz window (part 3 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 733524 | keep the chamber's temperature |
| Moist chamber with metal tube heat exchanger | Harvard Apparatus | 732901 | Water-jacketed moist chamber with lid to maintain perfusate and mouse temperature |
| Olsen-Hegar needle holders with suture cutters | Fine Science Tools (FST) | 125014 | |
| Oxygen compressed, USP | Airgas healthcare | C2649150AE06 | |
| Roller pump (part 4 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 730113 | deliver perfusate to cannula in the moist chamber |
| SCP plugsys servo control F/Perfusion (part 1 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 732806 | control the purfusion speed |
| Silicone pad | Harvard Apparatus | ||
| Silicone tubing set (arrows in Figure 1) | Harvard Apparatus (TYGON) | 733456 | |
| Student standard pattern forceps | Fine Science Tools (FST) | 91100-12 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools (FST) | 14001-14 | |
| Table for moist chamber | Harvard Apparatus | 734198 | |
| Thermocirculator (part 2 in Figure 1) | Harvard Apparatus | 724927 | circulating water bath for all water-jacketed components |
| Three-way stopcock (part 5 in Figure 1) | Cole-Palmer | 30600-02 | |
| Veterinary anesthesia machine | Highland | HME109 | |
| Materials | |||
| 19-G BD PrecisionGlide needle | BD | 305186 | For immobilizing the Insyte Autoguard Winged needle and scratching the cortical bone |
| 4-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427411 | |
| 6-0 silk sutures | Keebomed-Hopemedical | 427401 | |
| Filter (0.2 µm) | ThermoFisher | 42225-CA | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Permanent marker | Staedtler | 342-9 | |
| Syringe (10 mL) | Fisher Scientific | 14-823-2E | |
| Syringe (60 mL) | BD | 309653 | Filter for 5% BSA-RINGER’S |
| Reagents | |||
| 1% Evans blue ( w/v ) in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.5) | Sigma | 314-13-6 | |
| 10% buffered formalin | velleyvet | 36692 | |
| BALB/c mice ( 8-10 weeks old ) | Charles River | ||
| Baxter Viaflex lactate Ringer's solution | EMRN Medical Supplies Inc. | JB2324 | |
| Bovine serum albumin | Thermo Fisher | 11021-037 | |
| Cyanoacrylate glue | Krazy Glue | ||
| DyLight-649-lectin | Vector Laboratories,Inc. | ZB1214 | |
| Ethanol (70% (vol/vol)) | Pharmco | 111000190 | |
| Hoechst33342 | Life Technologies | H3570 | |
| Isoflurane | Piramal Enterprises Limited | 66794-017-25 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 |
References
- Ghaidan, H., et al. Ten year follow-up of lung transplantations using initially rejected donor lungs after reconditioning using ex vivo lung perfusion. Journal of Cardiothoracic Surgery. 14 (1), 125 (2019).
- Kabagambe, S. K., et al. Combined Ex vivo Hypothermic and Normothermic Perfusion for Assessment of High-risk Deceased Donor Human Kidneys for Transplantation. Transplantation. 103 (2), 392-400 (2019).
- Knaak, J. M., et al. Technique of subnormothermic ex vivo liver perfusion for the storage, assessment, and repair of marginal liver grafts. Journal of Visualized Experiments. (90), e51419 (2014).
- Hems, R., Ross, B. D., Berry, M. N., Krebs, H. A.
- Nielsen, S., et al. Vasopressin increases water permeability of kidney collecting duct by inducing translocation of aquaporin-CD water channels to plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (4), 1013-1017 (1995).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacological Research. 41 (6), 613-627 (2000).
- Schreiter, T., et al. An ex vivo perfusion system emulating in vivo conditions in noncirrhotic and cirrhotic human liver. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (3), 730-741 (2012).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Viscous resistance to blood flow in solid tumors: effect of hematocrit on intratumor blood viscosity. Cancer Research. 49 (13), 3513-3519 (1989).
- Duyverman, A. M., et al. An isolated tumor perfusion model in mice. Nature Protocols. 7 (4), 749-755 (2012).
- Sears, H. F., et al. Ex vivo perfusion of a tumor-containing colon with monoclonal antibody. J Surg Res. 31 (2), 145-150 (1981).
- Duda, D. G., et al. Malignant cells facilitate lung metastasis by bringing their own soil. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21677-21682 (2010).
- Kristjansen, P. E., Boucher, Y., Jain, R. K. Dexamethasone reduces the interstitial fluid pressure in a human colon adenocarcinoma xenograft. Cancer Research. 53 (20), 4764-4766 (1993).
- Sevick, E. M., Jain, R. K. Geometric resistance to blood flow in solid tumors perfused ex vivo: effects of tumor size and perfusion pressure. Cancer Research. 49 (13), 3506-3512 (1989).
- Zhang, W. T., et al. Ex vivo Maintenance of Primary Human Multiple Myeloma Cells through the Optimization of the Osteoblastic Niche. PLoS One. 10 (5), (2015).
- Di Buduo, C. A., et al. Modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function. Biomaterials. 146, 60-71 (2017).
- Lokerse, W. J. M., Eggermont, A. M. M., Grull, H., Koning, G. A. Development and evaluation of an isolated limb infusion model for investigation of drug delivery kinetics to solid tumors by thermosensitive liposomes and hyperthermia. Journal of Controlled Release. 270, 282-289 (2018).
- Tietjen, G. T., et al. Nanoparticle targeting to the endothelium during normothermic machine perfusion of human kidneys. Science Translational Medicine. 9 (418), (2017).
- Ternullo, S., de Weerd, L., Flaten, G. E., Holsaeter, A. M., Skalko-Basnet, N. The isolated perfused human skin flap model: A missing link in skin penetration studies. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 96, 334-341 (2017).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, 4986 (2008).
- Hekman, M. C., et al. Targeted Dual-Modality Imaging in Renal Cell Carcinoma: An Ex vivo Kidney Perfusion Study. Clinical Cancer Research. 22 (18), 4634-4642 (2016).
- Graham, R. A., Brown, T. R., Meyer, R. A. An ex vivo model for the study of tumor metabolism by nuclear magnetic resonance: characterization of the phosphorus-31 spectrum of the isolated perfused Morris hepatoma 7777. Cancer Research. 51 (3), 841-849 (1991).
