Summary
Descrito aqui é um método para exclusão genética direcionada e sem marcadores em Chlamydia trachomatis usando mutgênese de troca de floxed, FLAEM.
Abstract
Clamídia trachomatis é um patógeno intracelular obrigatório que tem sido historicamente difícil de manipular geneticamente. O progresso definitivo na elucidação dos mecanismos que C. trachomatis usa para criar e manter um nicho intracelular privilegiado tem sido limitado devido à falta de ferramentas genéticas. Felizmente, recentemente houve vários novos avanços nas técnicas de manipulação genética. Entre elas está o desenvolvimento da mutagênese de troca acetélica relatada por fluorescência (FRAEM). Este método permite exclusão genética direcionada juntamente com a inserção de uma resistência a antibióticos de codificação de de seleção e proteína fluorescente verde (GFP). A dependência dessa estratégia pode ser complicada quando se mira genes dentro de operões policistronicos devido ao potencial de efeitos polares em genes a jusante. A troca de acetélica de floxed (FLAEM), o protocolo para o qual está descrito aqui, foi desenvolvido para aliviar os efeitos polares induzidos por. FlaEM utiliza edição de genoma Cre-loxP para remover o de seleção após exclusão direcionada por troca de algélico. As cepas resultantes contêm exclusões genéticas sem marcadores de uma ou mais sequências de codificação. Essa técnica facilita a avaliação direta da função genética e amplia o repertório de ferramentas para manipulação genética em C. trachomatis.
Introduction
A clamídia trachomatis é a principal causa de doenças sexualmente transmissíveis bacterianas e representa um fardo significativo para a saúde humana. Mais de 100 milhões de pessoas são infectadas todos os anos com C. trachomatis1. Aproximadamente 70% das infecções em mulheres são assintomáticas apesar dos efeitos prejudiciais à saúde reprodutiva, como doença inflamatória pélvica, gravidez ectópica e/ou infertilidade. As sequelas da doença estão diretamente relacionadas à imunopatologia iniciada pela infecção por C. trachomatis 2. Uma vacina eficaz ainda não foi desenvolvida; portanto, compreender a função de fatores de virulência bacteriana e outros produtos genéticos bacterianos é uma questão de pesquisa importante e urgente.
Como bactérias intracelulares, invasão celular hospedeira, replicação intracelular, liberação de descendência e evasão de respostas imunológicas hospedeiras são processos críticos. C. trachomatis forma uma membrana parasitophorous vinculada ao vacuole, denominada inclusão, para o desenvolvimento intracelular. O estabelecimento da inclusão e muitos outros processos críticos são alcançados por secreção de proteínas effectoras por meio de um sistema de secreção tipo III (T3SS)3. Elucidar as funções desses efetivadores secretos foi limitado por muitos anos devido à intração genética de C. trachomatis. Ao contrário de E. coli,muitas técnicas clássicas de clonagem não são aplicáveis à Clamídia. Algumas grandes limitações envolvem eficiência de transformação, falta de repórteres de contrasseleção, como sacb e manutenção plasmática. Enquanto os plasmídeos E. coli geralmente podem ser mantidos indefinidamente com origem de replicação e pressão seletiva adequada, os plasmídeos C. trachomatis exigem mais oito quadros de leitura abertos (pgp1-8) para manutenção que são encontrados no plasmídeo pL2 nativo dentro do L2 serovar4.
Nos últimos anos, foram geradas múltiplas ferramentas genéticas que acomodam a biologia única da Clamídia, mas ainda há limitações5,6,7. A mutação química pelo tratamento metanosulfona (EMS) pode introduzir mutações missenses, ou (menos frequentemente) pode resultar em transições de nucleotídeos introduzindo um codon parada prematuro para produzir uma mutação sem sentido8. A inserção transposon é eficiente para a interrupção genética, mas a tecnologia atual na pesquisa da Clamídia é trabalhosa edemorada 9. Tanto o tratamento ems quanto as técnicas de mutagênese transposon geram mutações aleatórias e exigem métodos rigorosos de triagem para isolar as cepas mutantes. Um método para interromper genes por inserção de intronas do grupo II (por exemplo, TargeTron) permite a mutação gênese dirigida; no entanto, este método é limitado pela eficiência, e o local de inserção nem sempre é devidamente previsto10.
A mutagênese de troca acetélica relatada pela fluorescência (FRAEM) é uma estratégia usada para exclusão genética direcionada, juntamente com a inserção de um de seleção que proporciona resistência a antibióticos e um repórter de fluorescência11. No entanto, o FRAEM é complicado pelo potencial de efeitos polares induzidos por em genes a jusante, especialmente quando visam genes dentro de operões policistronicos. A troca de acetélica de floxed (FLAEM) é uma nova abordagem genética desenvolvida para aliviar os efeitos polares induzidos por anteriormente observados com o de seleção FRAEM12. FlaEM utiliza edição de genoma Cre-loxP para remover o de seleção e restaurar a expressão de genes a jusante. O de seleção contendo resistência a antibióticos e proteína fluorescente verde (GFP) é reprojetado com locais de loxP flancos. Esses locais loxP podem se recombinar na presença de Cre recombinase e resultar em excisão do do genoma13. Esta estratégia tem sido demonstrada para aliviar os efeitos polares induzidos ao mirar tmeA para exclusão12,14.
Tanto os métodos FRAEM quanto flaem utilizam o mesmo vetor suicida, pSUmC 4.0, que pode ser mantido condicionalmente através da expressão induutível de pgp6. A expressão do pgp6 já se mostrou necessária para a retenção plasmática e, portanto, é aproveitada para controlar a manutenção plasmática11,15. Quando C. trachomatis é cultivado na mídia complementada com tetraciclina anidra (aTc) para induzir a expressão pgp6, o vetor é mantido. Na ausência de aTc, o vetor está perdido. A exclusão genética direcionada é alcançada através da troca alelica do gene para a de seleção. As regiões de 3 kb diretamente rio acima e rio abaixo do gene alvo servem como braços de homologia para recombinação. Estes braços são clonados no vetor pSUmC 4.0 flanqueando o de seleção. Eventos bem-sucedidos de transformação e recombinação de C. trachomatis são observados através de relatórios de fluorescência. Expressão de mCherry na espinha dorsal vetorial e gfp dentro do de seleção produz inclusões fluorescentes vermelhas e verdes. Uma vez que o ATc é removido da mídia cultural, as inclusões somente verdes indicam eventos de recombinação bem-sucedidos com a perda do vetor suicida e a integração do de seleção no genoma bacteriano.
FlaEM representa uma extensão do FRAEM através da transformação subsequente de um vetor crerecombinase expresso, pSU-Cre, na recém-criada cepa mutante. A recombinação cre facilita a recombinação entre sites loxP e excisão do de seleção. Eventos de recombinação são indicados através de relatórios de fluorescência. O vetor pSU-Cre codifica mCherry; assim, a transformação bem sucedida é indicada pela adição de fluorescência vermelha ao GFP-expressando inclusões. O cultivo na ausência de pressão seletiva para o resulta em recombinação mediada por Cre nos locais do loxP, e a perda do é indicada por inclusões somente vermelhas. Assim como no pSUmC-4.0, a expressão induutível do pgp6 é usada para manter condicionalmente o pSU-Cre. Uma vez que a seleção de aTc e antibióticos são removidos, o plasmídeo é curado, e a cepa de exclusão sem marcadores resultante é não fluorescente. Este método aborda a questão dos efeitos polares induzidos por.
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Protocol
1. Design e Montagem do pSUmC-4.0 com Homology Arms Específico para o Gene of Interest
- Identifique as regiões de ~3 kb diretamente rio acima e a jusante do gene destinado à exclusão para servir como os braços homologia de 5' e 3' para recombinação homologous (Figura 1).
- Design pcR primers to 1) amplificar o braço de homologia de 3 kb 5' do DNA genômico cromadial e 2) conter uma saliência específica de 15-30 bp específica para pSUmC-4.0 quando digerida no site da enzima de restrição Sall. Certifique-se de que as regiões de primer sobrepostas com pSUmC-4.0 tenham temperaturas de derretimento de 55 °C e que as temperaturas de derretimento do grampo de cabelo para toda a cartilha sejam <35 °C.
- Design pcR primers to 1) amplificar o braço de homologia de 3 kb 3' do DNA genômico cromadial e 2) conter uma saliência específica de 15-30 bp específica para pSUmC-4.0 quando digerida no site da enzima de restrição SbfI. Certifique-se de que as regiões de primer sobrepostas com pSUmC-4.0 tenham temperaturas de derretimento de 55 °C e que as temperaturas de derretimento do grampo de cabelo para toda a cartilha sejam <35 °C.
- Projete primers de triagem PCR que amplificarão a inserção de cada braço de homologia no vetor pSUmC-4.0 após uma reação de montagem de DNA16. Projete esses primers para anneal ~500 bp fora dos locais de restrição para permitir uma fácil visualização de um produto PCR mesmo que a inserção tenha sido mal sucedida(Figura 1).
- Amplificar os braços de homologia de 3 kb 5' e 3' do DNA genômico cromodial recém-extraído pela PCR em uma a duas reações para produzir fragmento suficiente para montagem de DNA posterior. Siga o protocolo do fabricante de polimerase de DNA para configuração específica de reação e condições de ciclismo.
- Verifique se ambos os produtos PCR são do tamanho correto e que as reações não contêm nenhuma faixa contaminante. Execute 5 μL de cada reação pcr em um gel de agarose de DNA de 1%.
- Purificar e concentrar os fragmentos de PCR por extração fenol/clorofórmio e precipitação de etanol.
- Pool todas as reações pcr de 3' juntos em um tubo de 1,5 mL e trazer para um volume final de 200 μL com H2O. Sem nuca Repetir este processo para as reações pcr de 5'.
- Adicione 200 μL de fenol a cada tubo e vórtice para 30-60 s. Gire cada tubo em um microcentrífuga a >21.000 x g por 20 min a temperatura ambiente (RT).
- Transfira a camada superior de fase aquosa de cada tubo para um novo tubo de 1,5 mL, adicione um décimo do volume de acetato de sódio de 3 M a cada tubo e, em seguida, passe para misturar.
- Adicione 3 volumes de 100% de etanol a cada tubo e filme para misturar. Incubar ambos os tubos a -80 °C por 20 min.
- Pellet o DNA girando cada tubo em >21.000 x g por 5 min na RT. Descarte o supernatante.
- Lave a pelota de DNA com 100 μL de 70 % de etanol. Gire cada tubo em >21.000 x g por 5 min na RT. Descarte o supernatante.
- Lave a pelota de DNA novamente com 100 μL de 100% de etanol. Gire cada tubo em >21.000 por 5 min na RT. Descarte o supernatante.
- Deixe a pelota totalmente seca, depois resuspenda suavemente o DNA em 12 μL de H2O sem nuclease, flicking para misturar.
- Digerir 500 ng de vetor pSUmC-4.0 em uma reação de 20 μL com 1 unidade de Sall e 1 unidade de SbfI de acordo com o protocolo da fabricação. Incubar a reação por aproximadamente 3 h ou durante a noite para garantir a digestão completa do vetor.
- Purificar e concentrar a espinha dorsal digerida por extração fenol/clorofórmio e precipitação de etanol como descrito anteriormente (passo 1.7.1-1.7.9).
- Combine o vetor pSUmC-4.0 digerido e os produtos PCR de braço de homologia de 5' e 3' juntos em uma proporção de 0,01 pmol pSUmC-4.0 a 0,09 pmol cada braço de homologia. Monte os fragmentos em uma reação de montagem de DNA de acordo com o protocolo da fabricação.
- Transforme 50 μL de E. coli eletrocompetente com 1 μL da reação de montagem de DNA. Plaquere a e. coli transformada em placas de agar LB contendo espectinomicina de 100 μg/mL, espalhando 150 μL por placa. Incubar as placas a 37 °C durante a noite.
- No dia seguinte, colônias de tela para fluorescência verde e vermelha usando um microscópio invertido de epifluorescência. Um total de 5-30 colônias por placa ágar é esperado.
- Escolha 5-10 colônias para inocular 4 mL de caldo LB complementado com 100 μg/mL spectinomicin. Incubar culturas a 37 °C durante a noite com tremor a 250 rpm.
- Usando as culturas E. coli durante a noite, realize a purificação de DNA em pequena escala. Elute o DNA com 50 μL de H2O sem nuplocação.
- Confirme a inserção de cada braço de homologia no vetor pSUmC-4.0 usando os primers de triagem PCR (projetados na etapa 1.4) para amplificar cada inserção. Se a montagem de DNA for bem sucedida, um produto PCR de ~4 kb deve ser observado em um gel de agarose de DNA de 1% para as regiões do braço de 5' e 3'. Um produto PCR de ~1 kb indica falta de inserção.
NOTA: Se a inserção dos braços de homologia não for bem sucedida em uma reação de montagem de fragmento duplo, realize duas reações de montagem para inserir o braço de 5', em seguida, 3', individualmente. Digerir o vetor apenas com Sall antes de montar com o braço de 5', em seguida, digerir o vetor com SbfI para montar o braço de 3'. - Transforme a barragem-/dcm- competente E. coli com 200 ng de pSUmc-4.0 montada com ambos os braços homologia. Coloque as bactérias transformadas em placas de agar LB contendo espectinomicina de 100 μg/mL espalhando 25 μL por placa. Incubar as placas a 37 °C durante a noite. Um total de 20-200 colônias são esperadas.
- Tela as placas para colônias fluorescentes vermelhas e verdes como descrito na etapa 1.13.
- Criar uma cultura para uma purificação de DNA em larga escala inoculando 100 mL de caldo LB contendo 100 μg/mL espectinomicina com colônias vermelhas e verdes. Incubar a cultura a 37 °C durante a noite com tremor a 250 rpm.
- Colher a cultura e purificar o DNA usando uma purificação de DNA em larga escala.
- Resuspender o DNA plasmídeo purificado em 100 μL de NF-H2O. Um rendimento total de DNA de pelo menos 2 μg/μL é ideal para a transformação de C. trachomatis.
- Sequencie as regiões do braço homologia de 5' e 3' para garantir o conjunto correto no pSUmC-4.0 antes de transformar C. trachomatis.
2. Transformação de C. trachomatis com pSUmC 4.0 + Homology Arms for Gene Deletion by Allelic Exchange
- Células McCoy de sementes, fibroblastos de camundongos normalmente usados para cultivar Clamídia,em duas 6 placas de poço (1 x 106 células/bem) com mídia de crescimento #1. Incubar as placas a 37 °C com 5% de CO2 até que o monocamada seja confluente (aproximadamente 24 h).
- Em um tubo de 1,5 mL, adicione um volume de corpos elementares C. trachomatis WT sorovar L2 (EBs) que é suficiente para infectar 12 poços de uma placa de 6 poços em um MOI de 2. Pelotas os EBs em >20.000 x g por 30 min, em seguida, descartar o supernatant.
- Inicie a transformação clamídia resuspendendo suavemente os EBs em 600 μL de tampão CaCl2 e, em seguida, adicione 24 μg de armas pSUmC-4.0 + homologia ao tubo. Misture suavemente a solução flicking. Incubar o tubo no RTpor 30 min e mexa para misturar a cada 10 min.
- Adicione a solução de transformação a 24 mL da solução de sal balanceada de Hanks (HBSS) e misture suavemente. Transfira 2 mL do inóculo para cada poço de células McCoy confluentes nas 6 placas de poço e infecte por centrífuga a 900 x g por 1 h a 20 °C.
- Remova o inóculo e substitua por 2 mL/well rpmI mídia de crescimento #2. Incubar as placas a 37 °C com 5% de CO2.
- Após um mínimo de 7h, mas não mais do que 12h, substitua a mídia por 2 mL/poço de mídia de seleção #1. Continue a incubação a 37 °C por 48 h a partir do momento da infecção.
- Colher e passar as bactérias para uma nova monocamada de células McCoy.
- Usando um raspador de celular, raspe suavemente a monocamada McCoy para levantar as células para a mídia. Transfira o material de cada poço para um tubo de 2 mL. Pelotas o material celular em >20.000 x g em um microcentrífuga por 30 min a 4 °C.
- Remova e descarte o supernatante. Resuspender a pelota de célula em 1 mL de HBSS, canalizando suavemente.
- Pelotas os detritos da célula a 200 x g por 5 min a 4 °C. Transfira o supernatante para um poço fresco de células McCoy confluentes. Adicione um 1 mL adicional de HBSS a cada poço para um volume total de 2 mL/well.
- Infecte por centrífuga ção a 900 x g por 1 h a 20 °C. Substitua o inóculo por mídia de seleção #1 imediatamente após a infecção.
- Continue repassando as bactérias para uma monocamada fresca de células McCoy (seção 2.7) a cada 48 h para três ou mais passagens até que as inclusões vermelhas e verdes sejam detectadas usando um microscópio invertido de epifluorescência 24 h pós-infecção (24 hpi).
- Uma vez detectadas inclusões vermelhas e verdes, continue passeando o monocamada (seção 2.7) usando #2 de mídia de seleção.
- Continue passeando o monocamada até que as inclusões somente verdes sejam detectadas 24 hpi (passagem #3 ou posterior), o que indica a perda do vetor pSUmC-4.0 e a incorporação do de seleção loxP no genoma.
- Escolha um poço de inclusões somente verdes para enriquecer passeando. Colher e congelar quaisquer outros poços que também contenham inclusões somente verdes no tampão de sucrose-fosfato-glutamato (SPG).
- Para enriquecer as inclusões somente verdes, passe a monocamada de um poço de 6 pratos de poço como feito na etapa 2.7, mas depois de pelotas os detritos celulares (passo 2.7.3), transfira o supernatant para um cônico com 12 mL de HBSS. Use este inóculo para infectar duas 6 placas de poço adicionando 2 mL por poço, em seguida, gire as placas a 900 x g por 60 min a 20 °C.
- Para congelar poços adicionais, colher o monocamada como na etapa 2.7.1, mas resuspender as pelotas em 1 mL de SPG em vez de HBSS. Desmonte os detritos celulares (passo 2.7.3) e transfira o supernatant para um criotubo de 1,5 mL. Congele o material a -80 °C.
- Depois de enriquecer as inclusões somente verdes para um MOI de 0,5-1.0 (uma a duas passagens após a detecção), colher as monocamadas em SPG como descrito na etapa 2.11.2. Obtenha alíquotas de 50 μL em tubos de 1,5 mL e congele a -80 °C.
- Bactérias somente verdes titer para determinar a inclusão, formando unidades/μL, de acordo com um protocolo padrão de titulação17.
3. Isolamento clonal do mutante de exclusão c. trachomatis somente verde contendo o de seleção ladeado loxP limitando diluição
- Sementes uma placa de cultura de tecido de 384 poços com 50 μL de células McCoy em ~2.000 células/bem em mídia de crescimento #1. Incuba-se a 37 °C com 5 % de CO2 para ~24h ou até confluente.
- Diluir uma alíquota de bactérias somente verdes no HBSS para alcançar ~50 EBs por 20 mL. Transfira o inóculo diluído para uma bandeja de reservatório.
- Remova a mídia da placa de poço 384, enfiando firmemente a placa inteira de cabeça para baixo em um recipiente de lixo. Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 μL de C. trachomatis inoculum a cada poço. Infecte por centrífuga ção a 900 x g por 1 h a 20 °C.
NOTA: Tenha cuidado para não mexer tão forte que o monocamada se desprende. Se as células forem sobre-confluentes, elas se desprenderão mais facilmente.
- Remova a mídia da placa de poço 384, enfiando firmemente a placa inteira de cabeça para baixo em um recipiente de lixo. Usando uma pipeta multicanal, adicione 50 μL de C. trachomatis inoculum a cada poço. Infecte por centrífuga ção a 900 x g por 1 h a 20 °C.
- Remova o inóculo mexendo e substitua por 50 μL/well growth media #2. Placas incubadas a 37 °C com 5% de CO2.
NOTA: Nesta fase, a integração do de seleção ao genoma é estável, de modo que a seleção de antibióticos com espectinomicina não é mais necessária. - Depois de incubar a placa por 5 a 12 dias, identifique poços individuais com inclusões fluorescentes verdes usando um microscópio invertido de epifluorescência ou uma plataforma de triagem de alto conteúdo.
- Colher poços com inclusões somente verdes raspando a monocamada com uma ponta p-10 e transferindo todo o conteúdo do poço para um tubo contendo 2 mL de HBSS. Misture suavemente e aplique o 2 mL de inóculo a um monocamada McCoy de confluente fresco em uma placa de 6 poços para infecção.
NOTA: Ao identificar poços individuais com inclusões, as inclusões estarão em um cluster devido à expansão da inclusão inicial. Se um poço tem vários clusters, é provável que mais de um EB inicialmente infectou tão bem. Esses poços não devem ser colhidos, e em alguns casos, várias rodadas de isolamento clonal por diluição serial podem ser necessárias. - Infecte a placa de 6 poços por centrífuga a 900 x g por 1h a 20 °C. Substitua o inóculo por 2 mL/well growth media #2. Incubar a 37 °C com 5 % de CO2 para 48 h.
- Repita as etapas 2.11-2.13 para enriquecer, congelar e congelar populações clonais.
- Confirme a exclusão de genes direcionados de C. trachomatis clonamente isolados usando qPCR como descrito anteriormente12.
4. Transformação de C. trachomatis FRAEM Mutante com pSU-Cre para iniciar remoção de de seleção ladeada loxP
- Repita o processo de transformação em uma placa de 6 poços como descrito anteriormente (passos 2.1-2.8) usando o mutante C. trachomatis FRAEM isolado clonalmente, vetor pSU-Cre e mídia de seleção #3.
NOTA: Uma transformação bem sucedida é indicada por inclusões vermelhas e verdes fluorescentes.- Passagem do monocamada até que sejam detectadas inclusões somente vermelhas por meio de um microscópio invertido de epifluorescência, o que indica perda do de seleção (duas a três passagens). Continue passeando a monocamada até que as inclusões somente vermelhas sejam enriquecidas a um MOI de ~0,5.
- Isolam clonalmente as inclusões somente vermelhas limitando a diluição em uma placa de 384 poços, como descrito anteriormente (passos 3.1-3.8); no entanto, use a mídia de seleção #3 para todas as etapas.
- Enriqueça populações clonais passeando até um MOI de 0,1. Uma vez enriquecido, substitua a mídia de seção por mídia de crescimento #2 para iniciar a perda do vetor pSU-Cre (aproximadamente três a quatro passagens).
- Clonalmente isolar bactérias não fluorescentes (passos 3.1-3.8); no entanto, digitalizado manualmente a placa com um microscópio de campo brilhante para detectar inclusões. Enriquecer e congelar bactérias (passo 2.11-2,12).
- Tela para a cepa mutante usando PCR quantitativo em tempo real, manchas ocidentais e sequenciamento de DNA de genoma inteiro como descrito anteriormente12.
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Representative Results
O método de exclusão de genes sem marcadores em C. trachomatis usando FLAEM depende de técnicas cuidadosas de clonagem e transformação. A recombinação acetélica bem sucedida é um primeiro passo essencial e requer a identificação e inserção de braços de homologia no vetor de clonagem pSUmC-4.0(Figura 1). Um segundo passo essencial para a exclusão genética sem marcadores é a remoção do repórter de fluorescência e de seleção de antibióticos pela edição do genoma Cre-lox, representada na Figura 2. Os vetores utilizados para realizar cada um desses passos são anotados na Figura 3. A Figura 4 mostra uma representação esquemática da estratégia de transformação para gerar um mutante de exclusão sem marcadores quando começa com o tipo selvagem C. trachomatis.
Os dados representativos são mostrados na Figura 5 e Figura 6,em que o tmeA é direcionado para exclusão genética. A cepa de exclusão tmeA C. trachomatis é gerada usando FRAEM, e a cepa C. trachomatis tmeA-lx é gerada usando FLAEM. Ambas as cepas mutantes contêm uma exclusão do lócus tmea; no entanto, tmeA-lx não contém o de seleção, como indicado pela ausência de DNA gfp mostrado na Figura 5. A cepa mutante tmea diminuiu a expressão do tmeb,mostrado na Figura 6 por mRNA e níveis de proteína. Quando o FLAEM é utilizado para gerar a cepa mutante tmeA-lx, a Figura 6 mostra que a expressão do tmeB é restaurada.
Figura 1: Representação esquemática para identificar braços de homologia de 5' e 3' do DNA genômico e triagem pcr para sua inserção no pSUmC-4.0. (A)Um gene destinado à exclusão do genoma C. trachomatis é representado pela seta azul. As regiões de 3 kb identificadas como os braços homologia de 5' e 3' para recombinação acetélica estão em roxo e vermelho, respectivamente. (B,C) A inserção dos braços de homologia de 5' e 3' no pSUmC-4.0 é determinada pela triagem do PCR. Os locais de enzimas de restrição Sall e Sbfl são mostrados flanqueando o de seleção aadA (seta preta) e gfp (seta verde) que é flanqueado por locais loxP (quadrados amarelos) no vetor pSUmC-4.0. (B) Nenhuma inserção é determinada por um produto PCR de 1 kb quando os primers de triagem de 5' (cabeças de seta roxa) são usados para amplificar pcr através do site Sall, ou 3' primers de triagem (cabeças de seta vermelha) são usados para amplificar através do site SbfI. (C) A inserção bem-sucedida é determinada por produtos PCR de 3 kb nas mesmas condições. 5' e 3' braços homologia são representados pelos suportes roxo e vermelho, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 2: Representação esquemática da recombinação mediada cre-lox para remover o de seleção gfp-aadA. Na presença de Cre recombinase, os sítios loxP (amarelo) se recombinam, resultando em excisão do cassetede seleçãoaadA (quadrados verdes e pretos). O lócus resultante é mostrado contendo uma sequência de cicatriz p loxrestante. As regiões a montante (EUA) e a jusante (DS) são mostradas em cinza. Este número foi modificado de Keb et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 3: Organização genética do pSUmC-4.0 e pSU-CRE. Para manutenção controlável dos vetores em C. trachomatis, o pgp6 é projetado rio abaixo de um promotor tetraciclina-indutor. Os genes pgp restantes são a jusante de seus promotores nativos de Clamídia, e mCherry é constitutivamente expresso em ambos os vetores. (A) pSUmC-4.0 contém uma codificação de constitutivamente expressa aadA e genes gfp para capacidade de seleção de antibióticos e fluorescência, respectivamente. Sites loxp para recombinação mediada Cre, bem como locais de enzima de restrição para a inserção de braços de homologia específicos de genes flanqueiam o de seleção. (B) o pSU-CRE contém uma espinha dorsal semelhante ao pSUmC-4.0; no entanto, em vez do recombinação, blaM e cre são constitutivamente expressos para seletividade de antibióticos e geração cre recombinase, respectivamente. Esses números foram modificados de Keb et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 4: Representação esquemática da estratégia de transformação flaem usada para criar um mutante de exclusão sem marcadores. O método geral FLAEM é representado aqui onde o tipo Selvagem C. trachomatis é seqüentemente transformado e serialmente passageed para gerar um mutante de exclusão sem marcadores. Os passos de transformação são representados pela adição de pequenas flechas, e a perda de elementos genéticos é representada pela subtração de pequenas flechas. C. trachomatis intermediates (circles) are represented with antibiotic sensitivities (penicillin-resistant or penicillin-sensitive = PenGr or PenGs; spectinomycin-resistant or spectinomycin-sensitive = Specr or Specs) and fluorescence-reporting qualities (green = gfp +, red = mCherry +, gray = no fluorescence). Representações esquemáticas do lócus genético em cada passo são mostradas abaixo. Este número foi modificado de Keb et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 5: FRAEM e FLAEM são usados para gerar exclusões genéticas tmeA. (A) FRAEM foi usado para gerar tmeA, e flaem foi usado para gerar tmeA-lx. Números relativos de cópia de DNA de tmeA e tmeB a jusante; gfp contido no de seleção pSUmC-4.0; e cre contido no vetor pSU-CRE são todos mostrados. As células McCoy infectadas com igual inclusão formando unidades de WT, L2 tmeAou L2RiftmeA-lx C. trachomatis foram colhidas a 24 cvi, e dna foi extraído para qPCR. Os números relativos de cópia foram avaliados pela normalização do sinal para o cromildial 16sRNA. ND = nenhum detectado. (B) O lócus tmeAB sequenciado da L2RiftmeA-lx é mostrado com uma única sequência de cicatriz loxP restante (sublinhada). As regiões flanqueadoras do DNA são mostradas em azul, os codons de partida são mostrados em verde, e o codon de parada TmeA é mostrado em vermelho. O codon de início não canônico para TmeB também é retratado. Esses números foram modificados de Keb et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
Figura 6: Excisão do de seleção usando FLAEM restaura expressão de tmeB ao mirar tmeA e não interrompe genes a jusante. (A)Nível relativo mRNA de Cepas mutantes C. trachomatis tmeA e tmeB. A presença de transcrições a jusante de tmea foi determinada pela PCR quantitativa de transcrição reversa (RT). A região imediatamente a jusante do tmea/B codifica ct696. O RNA total foi isolado a 24 cvi de células McCoy infectadas em um MOI de 1 com WT, L2 tmeA, L2 tmeB,ou L2RiftmeA-lx. As transcrições para tmeA, tmeBe ct696 foram detectadas pelo qRT-PCR. Os sinais são apresentados após a normalização ao rpoD. ND = nenhum detectado. (B)Mancha ocidental para presença de TmeA e TmeB em Cepas mutantes c. trachomatis. Quantidades iguais de material de cultura integral de 24 culturas hpi infectadas com igual inclusão formando unidades de WT, L2 tmeA, L2RiftmeA-lx ou L2RiftmeA-lx ptmeA foram sondadas em imunoblots para TmeA e TmeB. O Hsp60 foi usado como controle de carga, e as proteínas foram visualizadas pela quimiocência. A figura foi modificada a partir de Keb et al.12. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.
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Discussion
O protocolo descrito aqui para a geração de exclusões genéticas sem marcadores em C. trachomatis pela FLAEM permite a exclusão direcionada de genes não essenciais e elimina efeitos polares induzidos por. O protocolo conta com um design cuidadoso de braços homologia de 5' e 3' inseridos no vetor suicida pSUmC 4.0, transformação eficiente de C. trachomatis e triagem cuidadosa de cepas mutantes isoladas. A engenharia de genomas bem sucedida através deste método resulta em bactérias que não são fluorescentes e contêm uma única sequência de cicatriz loxP no local de exclusão genética direcionada. Além disso, este método tem o potencial de ser adaptado para segmentação sequencial de genes dentro da mesma cepa C. trachomatis.
O design cuidadoso dos braços homologia de 5' e 3' e a inserção no vetor suicida é o primeiro e mais crítico passo do processo de clonagem. Descobriu-se que 3 kb homologia braços fornecem a recombinação allélica mais eficiente. Embora a inserção desses braços gere um vetor que é grande e às vezes difícil de trabalhar, houve menos sucesso com braços mais curtos, com ~2 kb representando um mínimo para o sucesso. A utilização dos locais de restrição Sall e Sbfl fornece uma reação conveniente de construção de um passo ao realizar montagem de DNA.
Outros métodos de clonagem, como o PCR de inserção, também têm sido eficazes na inserção de braços de homologia, mas introduzem maior possibilidade de erros baseados em PCR. Curiosamente, tem sido observado que a clonagem do braço de 5'' é relativamente mais eficiente que o braço de 3'. Se a questão surgir, recomenda-se dividir o conjunto de DNA em duas reações e construir o vetor de forma stepwise. Em seguida, é aconselhável digerir a espinha dorsal vetorial com SbfI, inserir o braço de 3'' primeiro, depois digerir o vetor com Sall e inserir o braço de 5'em uma segunda reação de montagem de DNA.
Ao amplificar fragmentos de PCR para os braços de homologia, também é recomendado usar DNA genômico C. trachomatis recém-purificado que não foi previamente congelado. Isso limita a possibilidade de cisalhamento de DNA e aumenta a eficiência para gerar amplicons maiores. Se amplificar os braços de homologia de outro vetor, o produto PCR purificado precisará ser enzima de restrição DpnI tratada antes de prosseguir para a montagem de DNA para reduzir colônias de fundo durante a transformação de E. coli.
A transformação é mais um passo crítico desse protocolo em que as questões podem surgir. Se a transformação com o pSUmC 4.0 for bem sucedida, as inclusões verdes e vermelhas devem ser visíveis por passagem #3; no entanto, pode levar várias passagens mais antes que os transformantes se enriqueçam. Como outras abordagens mutgêneses, este método limita-se a direcionar genes não essenciais, mas a transformação ainda deve ser prontamente realizada. A passagem de longo prazo dos transformantes na ausência de troca de alelic, indicada pela retenção da fluorescência vermelha, pode indicar que a exclusão do gene alvo é um evento letal.
Como os vetores de transformação de C. trachomatis contêm a mesma origem de replicação que o pL2 nativo, não é incomum que o plasmídeo nativo seja curado após várias passagens (>5). Os genes pgp nos vetores pSUmC estão em uma ordem diferente em comparação com o pL2 nativo; portanto, pcR pode ser usado para detectar a presença de pL2 em uma cepa isolada, amplificando a região que abrange pgp7–pgp8. Se o plasmídeo nativo for perdido no mutante de exclusão final, ele precisará ser reintroduzido antes de realizar estudos de desenvolvimento. A transferência de genes laterais (LGT) pode ser utilizada para reintroduzir o plasmídeo pL219.
Em muitos casos, mutantes de exclusão precoce com o de seleção ainda contêm o plasmídeo pL2. Utilizamos essas cepas para LGT com sucesso para reintroduzir pL2 e evitar a reparação do gene excluído. O LGT também pode ser utilizado como um método secundário de transformação ao introduzir o pSU-Cre. Em alguns casos, a LGT foi mais eficiente do que a transformação clássica do CaCl2. Em casos em que a LGT é utilizada para introduzir o pSU-Cre, é importante começar com C. trachomatis que expressam uma alelo rpoB, que confere resistência à rifampina antes da troca algélica e inserção da de seleção de espectinomicina12,19. Começar com bactérias resistentes à rifampina permite seleção após co-cultura.
O FLAEM permite abordagens genéticas reversas com exclusão direcionada de sequências de codificação inteiras, em comparação com outros métodos genéticos que dependem de mutagênese aleatória ou inserção de sequências de nucleotídeos para alcançar a interrupção genética. FlaEM é essencialmente uma extensão do FRAEM, pois permite a remoção do de seleção e elimina efeitos polares previamente observados induzidos por. Este método também cria a oportunidade de gerar múltiplas exclusões genéticas em uma única cepa C. trachomatis.
Múltiplas mutações podem ser geradas através de dois mecanismos diferentes. No primeiro, o FLAEM pode ser usado para gerar uma mutação genética sem marcadores e sequentalmente usado para atingir outro gene na mesma cepa. O primeiro mutante de supressão pode ser retransformado com o vetor pSUmC 4.0 contendo braços de homologia específicos para o gene secundário de interesse. Neste caso, o protocolo deve ser repetido da mesma forma que a primeira exclusão e repetido várias vezes para atingir genes sequencialmente. No segundo mecanismo, o mutante de exclusão sem marcadores isolado após o FLAEM pode ser co-infectado com um mutante de exclusão que ainda contém um de seleção. Através da LGT, a segunda supressão é adquirida e pode ser selecionada para. Ao usar essa abordagem, mutações adicionais são limitadas pelo número de fitas de seleção exclusivas deixadas no genoma. Antibióticos comumente usados como pressão seletiva durante a transformação são limitados para C. trachomatis, mas incluem penicilina, clororampenicol e espectinomicina. Remover o de seleção pela edição do genoma Cre-loxP reduz a necessidade de usar vários antibióticos para pressão seletiva. A exclusão de múltiplas sequências genéticas ao mesmo tempo é benéfica ao estudar proteínas com funções relacionadas ou processos biológicos que podem ter vários atores-chave.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho contou com o apoio de bolsas do Serviço Público de Saúde do Instituto Nacional de Saúde, NIAID (subsídios A1065530 e Al124649), para campos k.a.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose | KSE Scientific | BMK-A1705 | Molecular Biology Grade |
| Anhydrotetracycline hydrochloride | ACROS Organics | 233131000 | |
| CaCl2 Buffer | 10 mM Tris pH 7.4, 50 mM Calcium Chloride Dihydrate | ||
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | C7902-500G | Suitable for cell culture |
| Cycloheximide | Sigma | 7698-1G | |
| dam-/dcm- Competent E. coli | New England BioLabs | C2925H | |
| DMSO | ATCC | 4-X | Sterile filtered cell culture tested |
| Glutamic acid | Sigma | G8415-100G | L-Glutamic acid |
| Growth Media #1 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS). | ||
| Growth Media #2 | RPMI 1640 media supplemented with 10 % (vol/vol) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS) and 1 µg/mL cycloheximide | ||
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1x) | Gibco | 24020-117 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Qualified One Shot (FBS) | Gibco | A38402-02 | |
| McCoy Cells | ATCC | CRL-1696 | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England BioLabs | T1010S | Small scale DNA purification |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139-250G | Sodium phosphate monobasic |
| Na2HPO4 | Sigma | S5136-500G | Sodium phosphate dibasic |
| NEB 10-beta Electrocompetent E. coli Cells | New England BioLabs | C3020K | |
| NEBuilder HiFi DNA assembly Cloning Kit | New England BioLabs | E5520S | Gibson Assembly Kit |
| Penicillin G sodium salt | Sigma | P3032-10MU | Bioreagent suitable for cell culture |
| QIAGEN Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | Large scale DNA purification |
| Q5 Hot Start High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0515 | Fragment PCR Polymerase |
| RPMI 1640 Medium (1x) | Gibco | 11875-093 | Containing 2mM L-glutamine |
| Sall-HF | New England BioLabs | R3138S | |
| Sbfl-HF | New England BioLabs | R3642S | |
| Selection Media #1 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin, and 50 ng/mL anhydrous tetracycline dissolved in DMSO | ||
| Selection Media #2 | RMPI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 500 µg/mL spectinomycin | ||
| Selection Media #3 | RPMI 10 % FBS, 1 µg/mL cycloheximide, 50 ng/mL aTc, and 0.6 µg/mL penicillin | ||
| Sodium Acetate Buffer Solution | Sigma | S7899-100ML | 3M |
| SOC Outgrowth Medium | New England BioLabs | B9020SVIAL | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate, Cell Culture Grade | Alfa Aesar | J61820 | |
| Sucrose | Sigma | S1888-1KG | Bioreagent suitable for cell culture |
| Sucrose-Phosphate-Glutamate Buffer (SPG) | 37.5g sucrose, 1.25 g Na2HPO4, 0.18 g NaH2PO4, 0.36 glutamic acid for 500 ml tissue culture grade water | ||
| Tris | AMRESCO | 0497-5KG | Ultrapure grade |
| Trypsin-EDTA (1x) | Gibco | 25200-056 | 0.25% |
| Water | Sigma | W3500-500ML | Sterile-filtered, BioReagent, Suitable for cell culture |
References
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