Summary
שיטה לניתוח בלתי ממוקד של מטבוליטים דגן חיטה ושומנים מוצג. הפרוטוקול כולל שיטת הפקת מטבוליט מטבוליזם והיפוך נוזל בשלב כרומטוגרפיה מתודולוגיה להמסת המסה, עם רכישת מצבי מגנטי חיובי ושלילי.
Abstract
הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה והניהול בפרקטיקה החקלאית עלולה לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. הנתונים הטבולומיקס מספקים הקראה מתוך האינטראקציות הללו ברגע נתון והיא אינפורמטיבית של הסטטוס הביוכימי של האורגניזם. עוד, מטבוליטים בודדים או פאנלים של מטבוליטים ניתן להשתמש כמו סמנים מדויקים עבור תשואה וחיזוי איכות וניהול. הצמח מטביו צפוי להכיל אלפי מולקולות קטנות עם תכונות פיזיקליות מגוונות המספקים הזדמנות התובנה הביוכימי לתוך תכונות פיסיולוגיים גילוי ביואריקר. כדי לנצל את זה, מטרת המפתח עבור החוקרים טבולומיקס היא ללכוד כמה שיותר מגוון פיזיקליים ככל האפשר בתוך ניתוח אחד. כאן אנו מציגים שיטה טבולומיקס מבוססת על בסיס כרומטוגרפיה, מבוסס על מטרה בלתי ממוקדת לניתוח דגן חיטה מצמח. השיטה משתמשת במנהל הממס של הנוזל chromatograph הנוזלי כדי להציג שלב נייד שלישי ומשלבת מעבר מסורתי שלב היפוך עם מעבר שומנים בהדרגה. הכנת תבואה, הפקת מטבוליזם, ניתוח אינסטרומנטלי וזרימות עבודה של עיבוד נתונים מתוארות בפרוטרוט. דיוק המוני והאותות הטובים נצפו והשיטה הניבה כ-500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל מצב יינון. יתר על כן, המטלוליט שונים באופן משמעותי ואותות תכונה שומנים בין זני חיטה נקבעו.
Introduction
הבנת האינטראקציות בין הגנים, הסביבה ונוהלי הניהול בחקלאות עלולים לאפשר חיזוי וניהול מדויקים יותר של תפוקת המוצר ואיכותם. מטבוליטים צמחיים מושפעים גורמים כגון הגנום, הסביבה (אקלים, כמות המשקעים וכו '), ובסביבה החקלאות, הדרך יבולים מנוהלים (כלומר, יישום של דשן, קוטלי פטריות וכו '). בניגוד הגנום, מטאבולזה מושפע כל הגורמים האלה ולכן טבולומיקס נתונים מספק טביעת אצבע ביוכימית של אינטראקציות אלה בזמן מסוים. יש בדרך כלל אחת משתי המטרות למחקר מבוסס טבולומיקס: ראשית, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של ביוכימיה של האורגניזם ולעזור להסביר את מנגנון התגובה הפרטורציה (abiotic או לחץ ביוטי) ביחס הפיזיולוגיה; ושנית, לחבר בסמנים עם הפרטורציה תחת לימוד. בשני המקרים, התוצאה של הידע הזה היא אסטרטגית ניהול מדויקת יותר כדי להשיג את המטרה של גודל תשואה משופרת ואיכות.
הצמח בתוך המפעל צפוי להכיל אלפי1 של מולקולות קטנות עם תכונות פיסיוכימיקלים מגוונים. כיום, אין פלטפורמות טבולומיקס (בעיקר ספקטרומטר מסה וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית) יכולים ללכוד את המטה כולו בניתוח אחד. פיתוח טכניקות כאלה (הכנה לדוגמה, הפקת מטבוליזם וניתוח), אשר מספקים כיסוי גדול של מטאמיטין ככל האפשר בתוך הפעלה אנליטית אחת, היא מטרה מרכזית עבור חוקרים טבולומיקס. ניתוח טבולומיקס הקודם לא ממוקד של דגנים חיטה יש נתונים משולבים הפרדות כרומטוגרפיות מרובות ומכשור הרכישה ו/או מיכשור עבור כיסוי מטאמיאלי גדול יותר. עם זאת, יש צורך בדוגמאות שניתן להכין ולרכוש בנפרד עבור כל מודאליות. לדוגמה, Beleggia ואח '2 הכין דוגמה ללעג עבור ניתוח GC-ms של אנליטים קוטביים בנוסף לניתוח GC-ms של האנליטים הלא קוטבי. Das et al.3 בשימוש הן GC-ו-LC-MS שיטות כדי לשפר את הכיסוי בניתוח שלהם; עם זאת, גישה זו דורשת בדרך כלל הכנות לדוגמה נפרדת כמתואר לעיל וכן שתי פלטפורמות אנליטיות עצמאיות. ניתוחים קודמים של דגנים חיטה באמצעות GC-ms2,3,4 ו-LC-ms3,5 פלטפורמות הניבו 50 כדי 412 (55 זיהה) תכונות עבור gc-ms, 409 עבור משולב gc-ms ו-LC-ms וכמה אלפי עבור ניתוח LC-ms lipidomics5. על-ידי שילוב לפחות שני מצבים לניתוח אחד, ניתן לשמור על הכיסוי המוארך באופן מתקדם, ולהגדיל את עושרה של פרשנות ביולוגית תוך הנחה גם חיסכון בזמן ובעלות.
כדי לאפשר את ההפרדה היעילה של מגוון רחב של מינים שומנים בדם על ידי כרומטוגרפיה בשלב הפוך, lipidomics המודרנית מתודולוגיות בדרך כלל להשתמש בחלק גבוה של איזופנול ממיסים6, מתן שיעורי השומנים לכיתות שעשויות להיות לא פתורות על ידי הכרומטוגרפיה. עבור הפרדה יעילה השומנים, השלב ההתחלתי הנייד הוא גם הרבה יותר גבוה בהרכב אורגני7 מאשר שיטות היפוך אופייני כרומטוגרפי שלב, אשר לשקול מחלקות אחרות של מולקולות. ההרכב האורגני הגבוה בתחילת מעבר הצבע הופך את השיטות הללו למתאימות פחות למחלקות רבות אחרות של מולקולות. בעיקר, בשלב הפוך כרומטוגרפיה נוזלי מעסיקה מעבר מומס בינארי, החל בהרכב מימית בעיקר והגדלת תוכן אורגני כמו חוזק הכרומטוקציה של הכרומטוגרפיה גדל. לשם כך, ביקשו לשלב את שתי הגישות כדי להשיג הפרדה של שיעורי השומנים וגם לא ליפיד של מטבוליטים בתוך ניתוח אחד.
כאן, אנו מציגים שיטת כרומטוגרפית המשתמשת בשלב הנייד השלישי ומאפשרת שלב היפוך מסורתי משולב וlipidomics-שיטת כרומטוגרפיה מתאימה באמצעות הכנה לדוגמה אחת וטור אנליטי אחד. אימצנו רבות מאמצעי בקרת איכות ושלבי סינון נתונים שיושמו בעבר במחקרים טבולומיקס קליניים בעיקר. גישות אלה שימושיות בקביעת תכונות איתנות עם שימוש ביכולות טכניות גבוהות ורלוונטיות ביולוגית וכוללת את אלה שאינם עומדים בקריטריונים אלה. לדוגמה, אנו מתארים ניתוח חוזר של מדגם qc במאגר8, תיקון QC9, סינון נתונים9,10 והשלכה של תכונות חסרות11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
שיטה זו מתאימה ל -30 דגימות (כ-150 זרעים לכל מדגם). במקום שימשו כאן שימוש בשלושה משכפל ביולוגי של עשרה סוגי חיטה שונים.
1. הכנת גרגירים
- לאחזר דגימות (דגנים מלאים) מ-80 ° c אחסון.
הערה: ייבוש זרעים מומלץ זמן קצר לאחר הקטיף אם מדגמים נאספים ממספר עונות. זה ממזער את כל השינויים בריכוז מטבוליזם שעלול להתרחש לאחר תקופות שונות של אחסון. כדי לעשות את זה, להעביר זרעים ל 15 מ ל שפופרת צנטריפוגה פלסטיק (כ 300 זרעים ימלא את הצינור) ולכסות עם רדיד אלומיניום. מחורר את רדיד האלומיניום פעמיים-שלוש בעזרת סיכה ומקפיאים את כל הדגנים בלילה (כ -24 שעות). ניתן להחזיר דגימות למקפיא של-80 ° c בשלב זה או לבצע את השלב הבא. - לטחון את הזרעים באמצעות בלנדר מעבדה עבור שני רץ במצב גבוה עבור 20 s.
הערה: הבלנדר המשמש לפרוטוקול זה מחייב מינימום של כ 150 זרעים כדי למלא את הבלנדר לגובה להב ולתת מדגם דגנים באופן יחסי הומוזה. - להסיר את הבלנדר מהבסיס ולהקיש על צד של בלנדר להביא כל גרגר הקרקע גס לפני השטח של המדגם. ניתן למחוק או לאחסן חומר גס.
- אבקת העברה כמו חומר קרקע דק מבלנדר לצינור מיקרוצנטריפוגה פלסטיק 2 mL.
הערה: לשטוף את הבלנדר עם מים המיוים ולשטוף עם מיים LC-MS-כיתה בין דגימות. ודא כי הבלנדר יבש לחלוטין לפני שתמשיך המדגם הבא. - החזר דגימות של דגנים בקרקע דק למקפיא או המשך לשלב הבא (חילוץ מטבוליט).
2. הכנת ממיס הוצאה
הערה: הכינו את החילוץ באותו יום שבו מבצעים את העקירה.
- הכן לפחות 2 מ ג של 1 מ"ג/mL של כל תקן. השתמש ב-acetonitrile (ACN) כדי להכין חומצת פחם 2-עמינח, miconazole ו d6-החוצה חומצה. להשתמש במים כדי להכין 13ג6-sorbitol.
- קח 2 מ ל של כל 1 מ"ג/mL תקן ולהוסיף 100 mL בקבוקון נפחי.
- מלא את הבקבוקון הנפחי. עם הצינור ודא כי 100 mL של acetonitrile מכיל 20 μg/mL של כל הסטנדרטים הפנימיים: 2-עמינח פחם, miconazole, 13ג6-sorbitol, d6-החוצה חומצה.
3. הוצאת מטבוליט
- שוקלים 200 מ ג של גרגר קרקע דק לתוך שפופרת מיקרוצנטריפוגה 2 mL.
- הוסף 500 μL של ממיס החילוץ ל 200 מ"ג של דגימה דק של דגנים.
- מערבבים באמצעות הומוגניצר עבור 2 רץ של 20 s ב 6,500 סל ד.
- צנטריפוגה ב 4 ° צ' עבור 5 דקות ב 16,100 x g.
- העבר את הסופרנאטנט. לצינור פלסטיק של 2 מ ל
- חזור על הליך זה משלבים 3.1 עד 3.5 פעמיים יותר כדי לתת נפח supernatant כולל של כ 1.5 mL.
- . מערבולת לערבב את הסופרנטאנט
- העברת אמצעי אחסון שווה (55 μL) של כל אחד מהחלקים לצינור שפופרת נפרד בנפח של 2 מ ל כדי ליצור מדגם של תמצית תבואה במאגר.
- העברת 50 μL ליטר של התמצית לבקבוקון זכוכית.
הערה: מחלץ יכול להיות קפוא (-80 ° c) בשלב זה או להמשיך לשלב הבא ולהמשיך בניתוח LC-MS.
4. הכנת פתרונות לניתוח LC-MS
התראה: עבור חומצה מרוכזת, תמיד להוסיף חומצה למים/ממס.
- להכין 50 mL של פתרון 1 M אמוניום מניות. שוקלים 3.153 g של אמוניום formate ו להעביר 50 mL בקבוקון נפחי. מילוי בקבוקון נפחי לקו עם LC-MS כיתה H2O.
- להכין 1 L של השלב הנייד A המורכב של 10 מ"מ מילימטר אמוניום, 0.1% החומצה formate. כדי לעשות זאת, להוסיף כ 500 mL של מים LC-MS בכיתה 1 L נפחי בקבוקון. הוסף 10 מ ל של 1 מ ' אמוניום formate מלאי 1 mL של חומצה formate. מילוי בקבוקון נפחי לקו עם LC-MS כיתה H2O. העברה לבקבוק 1 L ו sonicate עבור 15 דקות כדי דגה.
- להכין 1 L של השלב הנייד B המורכב 10 מילימטר אמוניום ב79:20:1 הכולל: אלכוהול איזופרופיל: מים, 0.1% היחס חומצה formate. הוסף 200 מ ל של איזופנול לבקבוקון מנפח 1 L. הוסף 10 מ ל של 1 מ ' אמוניום formate מלאי 1 mL של חומצה formate. ממלאים את הבקבוקון הנפחי. עם הצינור העבר לבקבוקון של 1 וsonicate. במשך 15 דקות לדגה
הערה: לדלל את האלכוהול 1 M לתוך משקאות חריפים (IPA) לפני הוספת ACN. . מיכל האמוניום אינו מסיסים באוכל - להכין 1 L של השלב הנייד C המורכב 10 מילימטר אמוניום ביחס לאלכוהול איזופרופילי 89:10:1: המים. כדי לעשות זאת, להוסיף כ 500 mL של איזופנול, 10 מ"ל של 1 M מלאי אמוניום ו 100 mL של acetonitrile ל 1 L נפחי בקבוקון. מלא את הקו עם איזופנול. העבר לבקבוקון של 1 וsonicate. במשך 15 דקות לדגה
- הכנת ממיסים מערכת LC-MS לשטוף
- החליפו את התמיסה של רחיצת ראש המשאבה בתמיסה טרייה. השתמש ב-50% מתנול, 10% אלכוהול איזופרופיל או אחר כמומלץ על ידי היצרן.
- להכין פתרונות חזקים וחלשים מחט שטיפת לשטוף את פלואידיקה ההזרקה לפני ובעקבות הזרקת המדגם. לשטיפה חזקה, להוסיף כמויות שוות של ACN ו-IPA. עבור שטיפת חלש, להכין פתרון של 10% ACN (דורש כ 500 mL ו-1 L של כל אחד שוטף חזק וחלש בהתאמה עבור פרוטוקול זה ומספר דגימות) בבקבוקים נפרדים.
- הגדר את אמצעי האחסון לשטיפת המחט ל-600 μL ו-1800 μL עבור השטיפה החזקה והחלשה, בהתאמה.
5. הכנת דגימות לניתוח LC-MS
- לפי הליך ההפעלה הסטנדרטי של היצרנים לקראת הכנת 400 ng/μL ליוצין אנקפלאין, פיפטה 7.5 מ ל של מים לתוך 12 מ ל לוצין-אנקפלאין בבקבוקון המכיל 3 מ ג של לוקיסין-אנקיצין. להקפיא ב-80 ° c ב 50 μL.
- להכין 100 mL של 5% ACN המכיל 200 ng/mL לאוצין-enkephalin (50 μL של 400 ng/μL ליוצין enkephalin). היכונו באותו היום כמו ניתוח LC-MS.
- הוסף 950 μL של 5% acetonמטריל המכיל את תקן ההזרקה ליוצין-enke, כדי 50 μL לדוגמה המוכן משלב 3.
- מערבולת לערבב את המדגם מוכן.
6. התקנה LC-MS
הערה: תיאור מפורט של כיוונון שיטות המכשיר והרכישה מתואר במדריך למשתמש של היצרן. מדריך כללי והפרטים הספציפיים לפרוטוקול זה מפורטים להלן. ניתן להשלים את השלבים הבאים בכל עת לפני רכישת הנתונים.
- פתח פרופיל חומרה של LC-MS.
- הגדר את שיטת ה-כרומטוגרפי כמתואר בטבלה 1. ודא שמערכת ה-LC מצוידת במנהל הממס הרבעוני כדי להגדיר מעבר צבע זה.
הערה: IPA הוא ממיס צמיגה. יש להציג אותה בקצב זרימה נמוך ובזמן מספיק מספק יש להשתמש לפני הגדלת הקומפוזיציה ל-98.0%. שלבים אלה ימנעו ממערכת LC ללחוץ ולעצור. - הגדר את שיטות הרכישה של ספקטרומטר המסה עבור כל אחד מהמצבים החיוביים והשליליים של תוף-MS בטווח m/z של 50-1300.
הערה: הכלי המשמש לעבודה המוצגת כאן דורש שיטות חיוביות ושליליות לכייל ולפעול בנפרד (כלומר, החלפת קוטביות בתוך שיטה אינה אפשרית). - אם עמודת ה-LC חדשה, הגדר את העמודה בהתאם להמלצה של היצרן.
הערה: יש להשלים את השלבים הבאים ישירות לפני רכישת הנתונים. - בפרופיל חומרה ' MS בלבד ', כיול את ספקטרומטר המסה בהתאם להמלצות היצרן. השלם שלב זה לפני כל מצב של רכישה, וודא שהמערכת התייצב בכל מודאליות נתונה לפני הכיול.
- לטהר ולשטוף את מערכת lc פלואידיקה באמצעות ממיסים lc-MS כיתה, כולל שלב נייד ולשטוף ממיסים.
- באמצעות שיטה מערכת LC באמצעות שיטת LC הפעלת תנאי, להבטיח כי לחץ הטור התייצב.
- הכנס את הנתרן formate (0.5 mM ב 90% IPA) בתחילת רצף לדוגמה (המתואר להלן) כדי לבדוק את כיול המכשיר.
- הגדר את טבלת רצף המכשירים כך שהממס והממיסים (החילוץ) יהיו מנותח תחילה; ואחריו דגימות QC במאגר (6-10) עבור מיזוג מערכת; לאחר מכן הרשימה לדוגמה אקראי עם דגימות QC לרוץ במרווחי זמן קבועים (למשל, כל הזרקה חמישית) כשכפל טכני. הפעל שתי דגימות QC בסוף הרצף.
הערה: מומלץ לכלול את התאריך ואת סדר ההזרקה/הרכישה בקובץ המדגם, כמו גם את מזהה המדגם. לדוגמה: YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological שכפול. לפני לחיצה על התחל, לוודא את הלחץ הטור LC יציב וכי LC מחובר MS.
7. עיבוד נתונים
הערה: זרימת עבודה כללית בעיבוד נתונים מוצגת באיור 1.
- בדוק את איכות הנתונים (דיוק ברמת המסה הפנימית (חישוב להלן) ומתן האותות בזמן שהרצף פועל. כדי לבדוק את האותות, הבדיקה החזותית של ספקטרום השכבות צריכה להספיק.
הערה: שגיאת המסה (ppm) = ((המסה התיאורטית)/המסה התיאורטית) x 106 - יצירת מטריצה מיושרת בעוצמת שיא המכילה דגימות x סטנדרטים פנימיים (מיושר לפי זמן שמירה וערכי m/z ).
- פתח את תוכנת עיבוד הנתונים (ראה טבלת חומרים). תחת דף הבית ≫ פתיחה, לחץ על נתונים. נווט למיקום הקובץ המתאים ופתח את כל קבצי הנתונים.
- תחת ≫ רצף ≫ סוג עיבוד, בחר באפשרות כימות מהתפריט הנפתח.
- תחת ה> שיטה ≫ קוואן, לחץ על רכיבי כיול. מלא את כל השדות באמצעות הפרטים המסופקים בטבלה 2. לחץ על אישור.
- בלוח השמאלי בעמודות ליד קבצי הנתונים, למלא את סוג המדגם על ידי לחיצה ימנית על התא ובחירה לא ידוע. מלאו את הרמה כ- n/a.
- תחת הבית ≫ עיבוד, בחר רצף. בחר מיקום לשמירת הרצף ולאחר מכן לחץ על תהליך.
- תחת הבית ≫ תוצאות, בחר קוואן. ממציג קוואן , בחר ייצוא רץ למנתח מטריקס.
- מתוך מציג תוצאות מנתח מטריקס, לחץ על ייצוא ל-csv. שמור את הקובץ כקובץ גיליון אלקטרוני.
- בתוכנת גיליון אלקטרוני, חשב את הממוצע, סטיית התקן וסטיית התקן היחסית של העוצמה (אזור השיא) של כל תקן פנימי.
- צור מטריצה מיושרת בעוצמת שיא המכילה דוגמאות של תכונות שאינן ממוקדות (מיושרות באמצעות זמן שמירה וערכי m/z ).
- פתח את תוכנת ניתוח גילוי המולקולה הקטנה (ראה טבלת חומרים) ובחר קובץ > חדש כדי ליצור ניסוי חדש. ציין את שם הניסוי ובחר את המיקום כדי לשמור ולאחסן קבצי ניסוי. לחץ על הבא.
- בחר את סוג הכלי המשמש (ספקטרומטר מסה ברזולוציה גבוהה), תבנית נתונים (פרופיל) והקוטביות (חיובית או שלילית). לחץ על הבא. בחר את כל העדתעלות הזמינות בספריה וערוך ספריית adducts כנדרש. לחץ על יצירת ניסוי. דף חדש ייטען במקום שבו שאר עיבוד הנתונים ימשיך/יתרחש.
- יבא קבצי נתונים. בחר את תבנית הקובץ ולאחר מכן בחר ייבוא. דפדף אל מיקום הנתונים ובחר את קבצי הנתונים שייובאו. ההתקדמות תוצג עבור כל קובץ בלוח השמאלי של העמוד.
- לאחר ייבוא קבצי נתונים, בחר באפשרות ' הפעל עיבוד אוטומטי'. בחרו שיטה לבחירת הפניה ליישור. או לתת לתוכנה להעריך את כל הרצפים עבור התאמה, לתת רשימה של דגימות מתאימות (כלומר, בדיקות QC) או לבחור את ההפניה המתאימה ביותר i.e. מדגם QC באמצע הרצף. בחר כן, יישר אוטומטית את הרצפים שלי > הבא.
- בחר באפשרות הבא בדף עיצוב הניסוי (ניתן להגדיר זאת מאוחר יותר).
- בחר באפשרות ' בצע מרב איסוף ' ולאחר מכן הגדר פרמטרים. תחת הכרטיסייה ' מרב מגבלות איסוף ', בחרו ' עוצמת יון מוחלטת ' והזינו 100. בחר באפשרות החל רוחב שיא מינימלי והזן 0.01 דקות. בחר אישור ≫ סיום. בסיום העיבוד, בחרו ' סגור'.
הערה: ניתן למטב את המרב ממגבלות איסוף עבור סוגי קבצי נתונים אחרים לפי הצורך. - בחלק הימני התחתון של המסך, בחר במקטע הושלם. הפעלת סקירה מיושרת וודא שכל דוגמה מיושרת להפניה. תוצאות היישור היו > 90% עבור הנתונים המוצגים כאן. בחר מקטע שהושלם.
- בעמוד הבא, בחר בין עיצוב הנושא. . שם העיצוב בחר באפשרות קבץ את הרצפים באופן ידני וצור עיצוב. הוסף תנאי, לחץ על תנאי 1 ושנה את שם הקבוצה בהתאם. לחץ על המקטע הושלם.
הערה: המשך להוסיף תנאים בהתאם לשימוש בסטטיסטיקה בתוך התוכנה. מכיוון שאנחנו רק השתמשנו בתוכנה כדי ליצור מטריצה בלתי ממוקדת, השתמשנו בתנאי אחד ' כל '. - בעמוד הבא, בחר במקטע הושלם. אל תעשה מחדש. את איסוף השיא
- סקור את הפירוק ולאחר מכן לחץ על המקטע הושלם.
- עבור אל קובץ ≫ מדידות מורכבות ייצוא. בטל את הבחירה במאפיינים שאינם מבוקשים בפלט. לחץ על אישור. בחר מיקום לשמירת קובץ ה-csv. לחץ על שמור ≫ פתח קובץ ≫ פתח תיקיה או סגור.
- סנן את הנתונים באמצעות החילוץ ריקים כדי להסיר חפצי אמנות (תוכנת גיליון אלקטרוני).
- עבור כל תכונה של RT x m/z , בעמודה חדשה, חשב את התגובה הממוצעת בכדורי סרק.
- עבור כל תכונה של RT x m/z , חשב את התגובה הממוצעת בכל הדגימות האחרות (כולל דגימות QC).
- חישוב העוצמה% שיא של ריקים בדגימות (תגובה ממוצעת בתגובה ריקה/ממוצעת בדגימות x 100).
- מיין את עמודת התרומה של אחוז מהערכים הנמוכים ביותר לערכים הגבוהים ביותר.
- הסר תכונות אשר יש > 5% התרומה בעוצמה מפני כדורי סרק.
- סנן ערכים חסרים ותקן את אותות התכונות לאותות בדגימות QC במאגר.
- פתח את תוכנת עיבוד הנתונים (טבלת חומרים). לחץ על לחצן הצג מטריצות מטריקסx. לחצו על הלחצן ' פתח קובץ נתונים '.
- נווט למיקום הקובץ. csv המכיל את עוצמת השיא של תכונות RT x m/z עבור כל מדגם (מטריצה לא ממוקדת). בחר באפשרות ' פתח'.
- תחת הכרטיסיה דגימות QC, מלא כל פרמטר כנדרש. עבור ערכת הנתונים המתוארים כאן, השתמש ב-QC category = QC, התעלם מקטגוריות = ריק, סוג השלכה = none, סף כיסוי = 80, קנה מידה באמצעות = ללא שינוי קנה מידה, בטלו את ההמרה של יומן הרישום, נכון באמצעות החלקת spline, החלקה = 0.25.
- בחלק הימני העליון של החלונית ' מטריצה ', לחץ על תיקון QCלחצן הפעלה.
- לאחר שהתיקון התבצע בחלק הימני העליון של החלונית ' מטריצה ', לחץ על ' שמור תוצאות'. נווט למיקום מתאים ושמור את קובץ תוצאות ה-csv.
- סנן את הנתונים כדי להסיר תכונות שיש להן > 20% RSD בדגימות QC.
- סדר את הנתונים כך שהדגימות נמצאות בשורות ובתכונות נמצאות בעמודות.
- בעמודה חדשה, חשב את עוצמת השיא הממוצעת עבור דגימות QC.
- בעמודה חדשה, חשב את סטיית התקן של עוצמת השיא עבור דגימות QC.
- חשב את סטיית התקן היחסית של עוצמת השיא עבור דגימות QC: (סטיית תקן של QC/QC) x 100.
- מיין את התכונות מהנמוכה ביותר לגבוהה ביותר% RSD ולהסיר תכונות שיש להם QC RSD > 20%.
- לסנן את הנתונים כדי להסיר תכונות עםלדוגמהrsd נמוכה/rsd יחסQC (למשל, < 1).
- בעמודה חדשה, חשב את עוצמת השיא הממוצעת עבור דגימות.
- בעמודה חדשה, חשב את סטיית התקן של עוצמת השיא עבור דגימות.
- חשב את סטיית התקן היחסית של עוצמת השיא של הדגימות: (סטיית תקן לדוגמה/ממוצע לדוגמה) x 100.
- בעמודה חדשה, חלק את הדגימות RSD על-ידי ה-QC RSD.
- מיין את הערכים (RSDלדוגמה/יחסQC rsd) מהגבוה ביותר לנמוך ביותר ולהסיר תכונות עם יחס < 1.
- להשמיץ ערכים חסרים (מספר שיטות זמין באינטרנט).
- עצב את הגיליון האלקטרוני כך שהדגימות נמצאות בשורות ובתכונות נמצאות בעמודות. על העמודה הראשונה להיות שם הקובץ של הדגימות. צור עמודה נוספת ליד שמות הקבצים והזן את הקיבוצים לדוגמה. במקרה זה, הדגימות קובצו לפי מגוון.
- שמור את הגיליון האלקטרוני כקובץ csv.
- עבור לדף הבית של צינור אנליטי מבוסס אינטרנט עבור טבולומיקס תפוקה גבוהה (ראה טבלת חומרים) ולחץ על לחץ כאן כדי להתחיל.
- לחץ על ניתוח סטטיסטי. תחת העלאת הנתונים שלך, בחר סוג נתונים: טבלת עוצמת שיא, תבנית: דוגמאות בשורות (לא משויכים) ולאחר מכן בחרו ' קובץ '.
- נווט לקובץ. csv, בחר באפשרות פתיחה ולאחר מכן בחר בשלח.
- בעמוד הבא, בחר באפשרות שערוך ערך חסר. בטל סימון שלב 1 (זה בוצע ב-אנליזרפרו XD). בשלב 2, בחר שיטה להערכת הערכים החסרים.
הערה: עבור הנתונים שהוצגו כאן-' הערכת ערכים חסרים ' ב-' KNN ' נבחרה. - בשלב זה, ניתן להוריד את מטריצת הנתונים (לבחור הורדה מהחלונית השמאלית של דף האינטרנט) או להמשיך לבצע ניתוחים סטטיסטיים נוספים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המפעל מושפע משילוב של הגנום והסביבה שלה, ובנוסף בסביבה חקלאית, משטר ניהול יבול. אנו מדגימים כי הבדלים גנטיים בין זני חיטה ניתן לצפות ברמת מטבוליט, כאן, עם מעל 500 תרכובות נמדד מראה ריכוזים שונים באופן משמעותי בין זנים בלבד בדגן. דיוק המוני טוב (< 10 דפים לדקה שגיאה) ו האות מובחנות (< 20% RSD) של תקנים פנימיים (איור 2) נצפו הן עבור מצבי אינון שלילי וחיובי (שולחן 3). ההכנה לדוגמה המתוארת והניתוח המבוסס על מבוססי כרומטוגרפיה נוזלית הניב > 900 מאפיינים לפירוק במצב אינון שלילי ו> התכונות 1300 לפירוק במצב אינון חיובי. ההכנות הכנה (איור 3) נכללו כדי לקבוע אם ההכנה לדוגמה ושיטות ניתוח הציגו תכונות החפץ, ולכן כל ההשפעות הלא ביולוגיות סולקו ממטריצת הנתונים. נמצא כי 421 אותות במצב שלילי ו 835 אותות במצב חיובי היו עוצמות אות שווה או יותר 5% מעוצמת האות הממוצעת בדגימות דגן. תכונות אלה הוסרו ולאחר שלבי סינון נתונים נוספים (שלב 7 ואיור 1), המצב השלילי החזיר 483 תכונות והמצב החיובי החזיר 523 תכונות, ויצרו את תמונת חילוף החומרים. השיטה הצליחה בגילוי תכונות שונות באופן משמעותי בין זני חיטה (איור 4) עם > 500 תכונות משמעותיות לאורך שני מצבי יינון. במצב אינון שלילי, רוב התכונות המשמעותיות היו במעבר הדרגתי בשלב הפוך ובמצב יינון חיובי, רוב התכונות המשמעותיות היו במעבר השומנים (איור 4).
איור 1: זרימת העבודה המשמשת בניתוח זה לבדיקת נתונים, עיבוד וסינון. שלב 1 מבוצע תוך שימוש בתוכנת רכישת הנתונים/צפייה בכלי, כדי שניתן יהיה לנהל את ההערכות "על-גבי-הזבוב". הדבר כולל חישוב של שגיאת המסה (ppm) של תקנים פנימיים והנחת פסגות סטנדרטיות להערכה חזותית של משיכת נתונים. שלבים 2-7 מתארים את תהליך עיבוד הנתונים המתואר בפרוטוקול, שלב 7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: כרומטוגרם יון מחולץ. שחולצו כרומטוגרמות של 13C6-sorbitol (כחול כהה), לאוצין-enke, (ורוד), d6-טרנס-חומצת קינמון חומצה (כתום), 2-עמינח פחם (ירוק) ו miconazole (כחול בהיר) סטנדרטים פנימיים חיובי (למעלה) ושלילי (למטה) אלקטרונון (ESI) מצבי ( שעות ההחזקה ועוצמות השמירה של התקן הפנימיים מוצגים. ESI + ו-ESI- אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: כולל יון כרומוטוגרמה (TIC) כיסוי של מקומות ריקים הכוללת מראה מצב שלילי (ורוד) ובמצב חיובי (כחול) רכישות. מוצג תקן פנימי אחד, miconazole. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: כולל יון כרומוטוגרמה (TIC) כיסוי, מראה מצב שלילי (ורוד) ובמצב חיובי (כחול) רכישות ומספר תכונות שונות באופן משמעותי בין מגוון חיטה על פני מעבר צבע כרומטוגרפי. במצב שלילי, המספר הגדול ביותר של תכונות משמעותיות נמצא כאשר הרכב שלב B הנייד היה גבוה. במצב חיובי, המספר הגדול ביותר של תכונות משמעותיות נמצא כאשר הרכב השלב C הנייד היה גבוה. מוצג תקן פנימי אחד, miconazole. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| קטע | זמן | שיעור זרימה | % A | % B | % C | עקומה |
| דקות | (mL/min) | |||||
| 1 | ראשונית | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| מיכל 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
טבלה 1: כרומטוגרפיה נוזלית מתוזמן תוכנית של קומפוזיציות השלב הנייד.
| פרמטר | תקן פנימי | ||||
| מיכל בן 13 ג6-סורבייול | לאוצין-אנקיפצין | ד6-חומצה מניימית | 2-אמינית-פחם | Miconazole | |
| קוואן ז/ז | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| עמידות המונית (אמו) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| זמן שמירה | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| חלון זמן שמירה | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| סוג זיהוי | גבוהה ביותר | גבוהה ביותר | גבוהה ביותר | גבוהה ביותר | גבוהה ביותר |
| סוג תגובה | אזור | אזור | אזור | אזור | אזור |
| סף שטח | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| סף רוחב | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| סף גובה | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| יחס אות לרעש | מיכל 5 | מיכל 5 | 3 (5) | מיכל 5 | מיכל 5 |
| חלקת | מיכל 5 | 5 (3) | 5 (3) | מיכל 5 | מיכל 5 |
טבלה 2: פרמטרי זיהוי שיא עבור תקנים פנימיים במצבי רכישה חיוביים (ושליליים).
| דיוק המוני (ppm) | % RSD לפני תיקון QC | % RSD לאחר תיקון QC | ||
| מצב שלילי | מיכל בן 13 ג6-סורבייול | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| ד6-חומצה האיננמית | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| לאוצין-אנקיפצין | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| מצב חיובי | מיכל בן 13 ג6-סורבייול | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| לאוצין-אנקיפצין | 3 | 3.24 | מיכל 5 | |
| ד6-חומצה האיננמית | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| שני עמינח | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Miconazole | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
טבלה 3: מדגם (n= 30) דיוק פנימי ברמת המסה (ppm) ושגיאות מסוג האות לפני ואחרי הביטוי QC-תיקון מבוטא כסטיית תקן יחסית (%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן, אנו מציגים שיטת LC-MS מבוסס טבולומיקס שאינה ממוקדת ניתוח של דגן חיטה. השיטה משלבת ארבעה מצבי רכישה (שלב הפוך ושלב הפוך לשומנים עם אינון חיובי ושלילי) לשני מצבים על ידי החדרת שלב נייד שלישי לתוך הדרגתי שלב היפוך. הגישה המשולבת הניבה כ 500 תכונות רלוונטיות ביולוגית לכל קוטביות יון עם כמחצית כאלה שונים באופן משמעותי באינטנסיביות בין זני חיטה. שינויים משמעותיים בריכוז המטמטוליט בדגן של זנים שונים של חיטה מעיד על ביוכימיה שונה, אשר עשוי להיות מקושר להתנגדות למחלות, עמידות במתח ותכונות פנופאיות אחרות החשובות לאיכות הדגנים ולתשואה. לדוגמה, גישות טבולומיקס השתמשו כדי לתאר את מנגנוני ההגנה הרומן12 ולהציע את התפקיד של מטבוליטים ב סובלנות הבצורת13. יישומים עתידיים של פרוטוקול זה עשויים להיות מסוגלים לקשר באופן נוסף פרופילים ביוכימיים של זנים מסוימים לתכונות גנטיות הרצוי עבור סביבות מסוימות ונוהלי ניהול. בתורו, זה יאפשר ייצור של איכות הדגנים האופטימלי ותשואה עבור גנוטיפים נבחרים.
הכללת התקנים הפנימיים היא קריטית לפרוטוקול זה כדי לאפשר למשתמש לקבוע שינויים באותות, במשמרות זמן שמירה וכמחוונים לדיוק המוני. שינויים באות עשויים להצביע, לדוגמה, הפקת משנה אופטימלית, הזרקה (כולל חסימות של מערכת flu,) או ביצועי הגלאי. שמירה זמן המשמרות עשוי להצביע על ביצועי המשאבה עניים, בלתי הולמים בשלב המעבר הנייד הדרגתי או ששלב LC העמודה הנייח הידרדר. דיוק המוני מסכן יכול להיות מעיד על כיול נסחף וכי המערכת דורשת כיול מחדש. בכל המקרים הנ ל, יש לעצור את המערכת, ואת התחזוקה/החלפה המתאימות של חלקים שבוצעו. כללנו ארבעה סטנדרטים בפתרון החילוץ המשמש להכנת תבואה ותקן במדגם הסופי הוסיף לפני ההזרקה. הטיפול נלקח כדי להבטיח כי התקנים היו מתאימים לכל מצב יינון וכיסו מגוון של זמני שמירה; עם זאת, אנו מכירים כי מערך זה של סטנדרטים יכול להיות משופר עם הכללת תקן שומנים בתווית. זה הוכח כי דגנים חיטה מכיל מאות triacylglycerols (תגי)5, כל אחד מהם יהיה תוספת מתאימה לפרוטוקול זה. הכללת כדורי סרק וכלי במאגר של מספר8 הם גם צעדים קריטיים בפרוטוקול זה. אלפי תכונות יון מזוהים בשיטות ממוקדות המסה המוני וחשוב להוציא את אלה אשר נמצאים רק בדגימות ריקות וגם אלה אשר אינם מזוהים באופן מיוחד (כלומר, גבוהה% RSD) במהלך הניתוח.
למרות שהשיטה הנוכחית חוסכת זמן ומשאבים משמעותיים, אם מנהל הממס הרבעוני אינו זמין, ניתן להשתמש בשיטות הפוכות ושיטות השומנים הסטנדרטיות כדי להשיג את אותן תוצאות. נפח החילוץ המשמש בפרוטוקול זה יספיק לניתוח של מצבי רכישה נוספים. פרוטוקול זה מתאר את החילוץ. בעוד מוצלח, מממס החילוץ חלופה, או שילוב של ממיסים, תספק כיסוי מטבוליזם שונים, אשר עשוי בתורו לספק יותר תכונות ו/או לתת יותר (או פחות) מיצוי היעילות של כמה תרכובות. לא ניסינו לבסס את זהות המטטבוליט של המידות המשמעותיות סטטיסטית שנפתרו בפרוטוקול זה; עם זאת, מסדי נתונים ספקטרלי המוניים עבור צמח מטבוליטים ושומנים זמינים ופיתוח5,14,15. כדי לזהות את מטבוליטים, ספקטרום מסה (MS/MS) צריך להיות נאסף בנוסף נתונים סריקה מלאה. אלה ניתן לאסוף במהלך ההפעלה הראשונית באמצעות דגימות במאגר ושיטת MS/MS המתאים או על תמצית שמורה (מאוחסן ב-80 ° c) פעם אחת מטבוליטים של עניין נקבעו. הבחנו שינויים מקפלים גדול של תרכובות בין זנים כך היינו ממליצים לעשות גם במקרה השני, באמצעות מגוון הידוע להכיל ריכוז גבוה של המתחם של עניין כדי להשיג את האיכות הגבוהה ביותר MS/MS ספקטרום.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר בתוכנית החקלאות ומלגת המזון של מערב אוסטרליה (המחלקה למשרות, תיירות, מדע וחדשנות, ממשלת אוסטרליה המערבית) וברנש של ראש הממשלה, פרופסור סיימון קוק (המרכז ל החקלאות הדיגיטלית, אוניברסיטת קורטין ואוניברסיטת מרדוק). ניסויים שדה ואוסף לדוגמה דגנים תמכו על ידי הממשלה של התוכנית תמלוגים של אוסטרליה מערב האזורים. אנו מכירים בגראנטלי סטיינר ורוברט פרנץ ' בגין תרומתם לניסויי שדה. הביו-טפסים של אוסטרליה. מודה במימון הציוד
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
