Summary
En metod för oriktad analys av vetekornmetaboliter och lipider presenteras. Protokollet innehåller en acetonittrile metabolit extraktionmetod och omvänd fas flytande kromatografi-massa spektrometri metodik, med förvärv i positiva och negativa elektrospray jonisering s.k.
Abstract
Att förstå samspelet mellan gener, miljö och förvaltning i jordbrukspraxis skulle kunna möjliggöra mer exakt förutsägelse och hantering av produktavkastning och kvalitet. Metabolomics data ger en avläsning av dessa interaktioner vid en viss tidpunkt och är informativ av en organism biokemiska status. Dessutom kan enskilda metaboliter eller paneler av metaboliter användas som exakta biomarkörer för avkastning och kvalitetsprognos och kvalitetsstyrning. Växtmetabolomen förutspås innehålla tusentals små molekyler med varierande fysicokemiska egenskaper som ger en möjlighet till en biokemisk inblick i fysiologiska egenskaper och biomarkörupptäckt. För att utnyttja detta är ett viktigt mål för metabolomikforskare att fånga så mycket av den fysikokemiska mångfalden som möjligt inom en enda analys. Här presenterar vi en flytande kromatografi-massa spektrometri-baserade oriktade metabolomics metod för analys av fältodlade vetekorn. Metoden använder vätskekromatografen kvartärlösningsmedelshanterare för att införa en tredje mobil fas och kombinerar en traditionell omvänd fasgradient med en lipid-mottaglig gradient. Spannmålsberedning, metabolitutvinning, instrumentell analys och databehandlingsarbetsflöden beskrivs i detalj. God massnoggrannhet och signalreproducerbarhet observerades, och metoden gav cirka 500 biologiskt relevanta funktioner per joniseringsläge. Vidare, betydligt olika metabolit och lipid funktionen signaler mellan vete sorter fastställdes.
Introduction
Att förstå samspelet mellan gener, miljö och förvaltningsmetoder inom jordbruket skulle kunna möjliggöra mer exakt förutsägelse och hantering av produktavkastning och kvalitet. Växtmetaboliter påverkas av faktorer som genom, miljö (klimat, nederbörd etc.), och i en jordbruksmiljö, hur grödor förvaltas (dvs. tillämpning av gödselmedel, fungicid etc.). Till skillnad från genomet påverkas metabolomen av alla dessa faktorer och därför ger metabolomikdata ett biokemiskt fingeravtryck av dessa interaktioner vid en viss tidpunkt. Det finns vanligtvis ett av två mål för en metabolomikbaserad studie: för det första att uppnå en djupare förståelse av organismens biokemi och bidra till att förklara mekanismen för svar på störning (abiotisk eller biotisk stress) i förhållande till fysiologin; för det andra att associera biomarkörer med den störning som är under studie. I båda fallen är resultatet av att ha denna kunskap en mer exakt förvaltningsstrategi för att uppnå målet om förbättrad avkastningsstorlek och kvalitet.
Växtmetabolomen förutspås innehålla tusentals1 av små molekyler med varierande fysicokemiska egenskaper. För närvarande kan inga metabolomics plattformar (främst massa spektrometri och nukleärmagnetisk resonansspektroskopi) fånga hela metabolomen i en enda analys. Att utveckla sådana tekniker (provberedning, metabolitextraktion och analys), som ger en så stor täckning av metabolomen som möjligt inom en enda analytisk körning, är ett viktigt mål för metabolomikforskare. Tidigare oriktade metabolomikanalyser av vetekorn har kombinerat data från flera kromatografiska separationer och förvärvspolariteter och/eller instrumentering för större metabolomtäckning. Detta har dock krävt att prover na bereds och förvärvas separat för varje modalitet. Till exempel, Beleggia et al.2 förberett ett härledda prov för GC-MS analys av polaranalyter utöver GC-MS analys av nonpolar analyter. Das et al.3 använde både GC- och LC-MS-metoder för att förbättra täckningen i sina analyser. Detta tillvägagångssätt skulle dock i allmänhet kräva separata provberedningar enligt beskrivningen ovan samt två oberoende analysplattformar. Tidigare analyser av vetekorn med GC-MS2,,3,,4 och LC-MS3,5 plattformar har gett 50 till 412 (55 identifierade) funktioner för GC-MS, 409 för kombinerade GC-MS och LC-MS och flera tusen för en LC-MS lipidomik analys5. Genom att kombinera minst två lägen till en enda analys kan utökad metabolomtäckning bibehållas, vilket ökar den biologiska tolkningens rikedom samtidigt som det erbjuds besparingar både i tid och kostnad.
För att möjliggöra en effektiv separation av ett brett spektrum av lipidarter genom omvänd fas kromatografi, moderna lipidomik metoder använder ofta en hög andel isopropanol i elutionlösningsmedel6, vilket ger amenability till lipid klasser som annars skulle kunna lösas av kromatografi. För en effektiv lipidseparation är den inledande mobila fasen också mycket högre i organisk sammansättning7 än de typiska omvända faskromatografiska metoderna, som tar hänsyn till andra klasser av molekyler. Den höga organiska sammansättningen i början av lutningen gör dessa metoder mindre lämpliga för många andra klasser av molekyler. Framför allt använder omvänd fas flytande kromatografi en binär lösningsmedelsgradient, som börjar med en mestadels vattenhaltig sammansättning och ökar i organiskt innehåll när kromatografins elutidsstyrka ökas. För detta ändamål försökte vi kombinera de två metoderna för att uppnå separation av både lipid och icke-lipid klasser av metaboliter inom en enda analys.
Här presenterar vi en kromatografisk metod som använder en tredje mobil fas och möjliggör en kombinerad traditionell omvänd fas och lipidomik-lämplig kromatografi metod med hjälp av ett enda prov beredning och en analytisk kolumn. Vi har antagit många av de kvalitetskontrollåtgärder och datafiltreringssteg som tidigare har implementerats i övervägande kliniska metabolomikstudier. Dessa metoder är användbara för att fastställa robusta egenskaper med hög teknisk reproducerbarhet och biologisk relevans och utesluter sådana som inte uppfyller dessa kriterier. Till exempel beskriver vi upprepa analys av poolade QC prov8, QC korrigering9, datafiltrering9,,10 och imputation av saknade funktioner11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna metod är lämplig för 30 prover (cirka 150 frön per prov). Tre biologiska replikat av tio olika fältodlade vetesorter användes här.
1. Beredning av korn
- Hämta prover (fullkorn) från -80 °C lagring.
OBS: Frystorkning av frön rekommenderas strax efter skörden om prover samlas in från flera säsonger. Detta minimerar eventuella förändringar i metabolitkoncentrationen som kan uppstå efter olika lagringsperioder. För att göra detta, överföra frön till en 15 ml plast centrifugröret (cirka 300 frön kommer att fylla röret) och täcka med aluminiumfolie. Pierce folien två-tre gånger med hjälp av en stift och frysa torka fullkornen över natten (ca 24 h). Proverna kan antingen returneras till frysen -80 °C i detta skede eller så kan nästa steg utföras. - Mala fröna med hjälp av en laboratoriemixer för två körningar i högt läge i 20 s.
OBS: Den mixer som används för detta protokoll kräver minst cirka 150 frön för att fylla mixern till bladhöjd och ge ett relativt homogent köttkornsprov. - Ta bort mixern från basen och tryck på mixerns sida för att föra eventuellt grovt slipat korn till provets yta. Grovt material kan kasseras eller lagras.
- Överför pulverliknande finslipat material från mixern till ett 2 ml plastmikrocentrifugrör.
OBS: Tvätta mixern med avjoniserat vatten och skölj med LC-MS-grade MeOH mellan proverna. Se till att mixern är helt torr innan du fortsätter till nästa prov. - Återgå fint markkornprover till frysen eller gå vidare till nästa steg (metabolitextraktion).
2. Beredning av extraktionslösningsmedel
OBS: Förbered extraktionslösningpå samma dag som extraktionerna utförs.
- Förbered minst 2 ml av 1 mg/ml av varje standard. Använd acetonitril (ACN) för att förbereda 2-aminoantracene, miconazol och d6-transcinnamic syra. Använd vatten för att förbereda 13C6-sorbitol.
- Ta 2 ml av varje 1 mg/ml-standard och tillsätt en 100 mL-volymetrisk kolv.
- Fyll den volymetriska kolven till linjen med acetonitril. Se till att 100 ml acetonitril innehåller 20 μg/ml av var och en av de interna standarderna: 2-aminoantorisk, miconazol, 13C6-sorbitol, d6-transcinnamic syra.
3. Metabolitextraktion
- Väg 200 mg finmalen korn i ett 2 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt 500 μL extraktionslösningsmedel till 200 mg finskt köttkornsprov.
- Blanda med en homogenisator för 2 körningar på 20 s vid 6.500 rpm.
- Centrifugera vid 4 °C i 5 min vid 16 100 x g.
- Överför supernatanten till ett 2 ml plaströr.
- Upprepa proceduren från steg 3.1 till 3,5 två gånger mer för att ge en total supernatantvolym på cirka 1,5 ml.
- Vortex att blanda supernatanten.
- Överför en lika stor volym (55 μL) av varje extrakt till ett separat 2 ml-rör för att göra ett poolat kornextraktprov.
- Överför en 50 μL alikvot av extraktet till en glasflaska.
OBS: Extrakt kan frysas (-80 °C) vid denna punkt eller gå vidare till nästa steg och följa upp LC-MS-analysen.
4. Utarbetande av lösningar för LC-MS-analys
VARNING: För koncentrerad syra, tillsätt alltid syra till vatten/lösningsmedel.
- Förbered 50 ml 1 M ammoniumformate lagerlösning. Väg 3,153 g ammoniumformat och överför till en 50 mL volymetrisk kolv. Fyll volymetrisk kolv till linjen med LC-MS-klass H2O.
- Förbered 1 L av den mobila fasen A bestående av 10 mM ammoniumformat, 0,1% myrsyra. För att göra detta, tillsätt cirka 500 ml LC-MS-vatten i en 1 L-volymtrisk kolv. Tillsätt 10 ml 1 M ammoniumformat lager och 1 ml myrsyra. Fyll volymetrisk kolv till linjen med LC-MS-klass H2O. Överför till en 1 L flaska och sonicate i 15 min till degas.
- Förbered 1 L mobil fas B bestående av 10 mM ammoniumformate i 79:20:1 acetonitril:isopropylalkohol:vatten, 0,1% myrsyraförhållande. Tillsätt 200 ml isopropanol till en 1 L-volymetrisk kolv. Tillsätt 10 ml 1 M ammoniumformat lager och 1 ml myrsyra. Fyll volymetrisk kolv till linjen med acetonitril. Överför till en 1 L flaska och sonicate i 15 min till degas.
OBS: Späd 1 M ammoniumformatitill i isopropylalkoholen (IPA) innan du lägger till ACN. Ammoniumformatär olösligt i CAN. - Förbered 1 L mobil fas C bestående av 10 mM ammoniumformat e i förhållandet 89:10:1 isopropylalkohol:acetonitrile:vatten. För att göra detta, tillsätt cirka 500 ml isopropanol, 10 ml 1 M ammoniumformate lager och 100 ml acetonitril till en 1 L volymetrisk kolv. Fyll till linjen med isopropanol. Överför till en 1 L flaska och sonicate i 15 min till degas.
- Beredning av LC-MS-systemtvättlösningsmedel
- Byt ut tvättlösningen med pumphuvud med ny lösning. Använd 50% metanol, 10% isopropylalkohol eller annat enligt tillverkarens rekommendationer.
- Förbered starka och svaga nåltvättlösningar för tvättning av injektionsfluidik före och efter provinjektion. För den starka tvätten, tillsätt lika volymer av ACN och IPA. För den svaga tvätten, förbered en lösning på 10% ACN (som kräver cirka 500 ml och 1 L av var och en av de starka respektive svaga tvättar för detta protokoll och antal prover) i separata flaskor.
- Ställ nåltvättvolymerna på 600 μL och 1800 μL för de starka respektive svaga tvättarna.
5. Beredning av prover för LC-MS-analys
- Enligt tillverkarens standardförfarande för beredning av 400 ng/μL leeucine enkephalin, pipett 7,5 ml vatten i 12 ml leucininjektionsflaska innehållande 3 mg leucin-enkephalin. Frys vid -80 °C i 50 μL alikvoter.
- Förbered 100 ml 5% ACN som innehåller 200 ng/mL leucin -enkephalin (50 μL 400 ng/μL leeucine enkephalin). Förbered samma dag som LC-MS-analys.
- Tillsätt 950 μL 5% acetonitril som innehåller injektionsstandarden leucin-enkephalin till 50 μL-provet alikvot en förberedd från steg 3.
- Vortex att blanda det förberedda provet.
6. LC-MS-installation
OBS: En detaljerad beskrivning av installation av instrument och anskaffningsmetod beskrivs i tillverkarens användarhandbok. En allmän vägledning och de detaljer som är specifika för detta protokoll beskrivs nedan. Följande steg kan slutföras när som helst innan data hämtas.
- Öppna en LC-MS-maskinvaruprofil.
- Ställ in den kromatografiska metoden enligt tabell 1. Se till att LC-systemet är utrustat med en kvartär lösningsmedelshanterare för att ställa in denna gradient.
OBS: IPA är ett visköslösningsmedel. Det bör införas med lågt flöde och en tillräcklig jämviktstid bör användas innan sammansättningen höjs till 98,0 %. Dessa steg förhindrar att LC-systemet övertrycker och stoppar. - Ställ in massaspektrometerförvärvsmetoderna för varoch en av de positiva och negativa ToF-MS-lägena över intervallet m/z 50-1 300.
OBS: Det instrument som används för det arbete som presenteras här kräver att positiva och negativa metoder kalibreras och körs individuellt (dvs. är polaritetsväxling inom en metod inte möjlig). - Om LC-kolumnen är ny, villkorkolumnen enligt tillverkarens rekommendation.
Följande steg bör slutföras direkt före datainsamlingen. - I en maskinvaruprofil för "endast MS" kalibrerar du massspektrometern enligt tillverkarens rekommendationer. Slutför detta steg före varje förvärvssätt, se till att systemet har stabiliserats i varje given modalitet före kalibrering.
- Rensa och spola LC fluidiksystemet med hjälp av LC-MS-klasslösningsmedel, inklusive mobila faser och tvättlösningsmedel.
- Balansera LC-systemet med hjälp av LC-metodens startförhållanden, vilket säkerställer att kolonntrycket har stabiliserats.
- Injicera natriumformat (0,5 mM i 90% IPA) i början av provsekvensen (beskrivs nedan) för att kontrollera instrumentkalibreringen.
- Ställ in instrumentsekvenstabellen så att lösningsmedel och preparativa (extraktion) ämnen analyseras först; följt av poolade QC-prover (6-10) för systemkonditionering. sedan den randomiserade urvalslistan med QC-prover körs med jämna mellanrum (t.ex. var femte injektion) som tekniska repliker. Kör två QC-exempel i slutet av sekvensen.
OBS: Det är bra att inkludera datum och insprutning/förvärvsorder i exempelfilnamnet samt exempel-ID. Till exempel: YYYY MMDD_Injection number_Variety_Biological replikera. Innan du trycker på start, se till att LC-kolonntrycket är stabilt och att LC är anslutet till MS.
7. Databehandling
Ett allmänt arbetsflöde för databehandling presenteras i figur 1.
- Kontrollera datakvaliteten (intern standardmassnoggrannhet (beräkning nedan) och signalreproducerbarhet) medan sekvensen körs. För att kontrollera signalreproducerbarhet bör okulärbesiktning av överlagrad spektra räcka.
ANMÄRKNING: Massfel (ppm) = ((Teoretisk massa – uppmätt massa) / teoretisk massa) x 106 - Generera en justerad matris med toppintensitet som innehåller exempel x interna standarder (justerade med kvarhållningstid och m/z-värden).
- Öppna databehandlingsprogrammet (se Tabell över material). Klicka på Dataunder Start > Öppna. Navigera till lämplig filplats och öppna alla datafiler.
- Under Start > Sekvens > Bearbetningstypväljer du Quantitation på den nedrullningsbara menyn.
- Klicka på Kalibreringskomponenterunder Start > Metod > Quan. Fyll i varje fält med hjälp av de uppgifter som anges i tabell 2. Klicka på OK.
- På den vänstra panelen i kolumnerna bredvid datafilerna fyller du i exempeltypen genom att högerklicka på cellen och välja Okänd. Fyll i nivån som n/a.
- Under Start > Bearbetningväljer du Sekvens. Välj en plats för att spara sekvensen och klicka sedan på Process.
- Under Start > Resultatväljer du Quan. Välj Exportera körningar till matrisanalysator från Quan-visningsprogrammet .
- Klicka på Exportera till csvfrån matrisanalysatorresultatvisaren. Spara filen som en kalkylbladsfil.
- I kalkylprogram beräknar du medelvärdet, standardavvikelsen och den relativa standardavvikelsen för intensiteten (toppområdet) för varje intern standard.
- Generera en justerad matris med toppintensitet som innehåller exempel x oriktade funktioner (justerade med kvarhållningstid och m/z-värden).
- Öppna programmet för analys av små molekyler (se Innehållsförteckning)och välj Arkiv > Nytt för att skapa ett nytt experiment. Namnge experimentet och välj plats för att spara och lagra experimentfiler. Klicka på Nästa.
- Välj vilken typ av instrument som används (högupplösningsmasspektrometer), dataformat (profil) och polariteten (positiv eller negativ). Klicka på Nästa. Markera alla adducts som är tillgängliga i biblioteket och redigera adduct-biblioteket efter behov. Klicka på Skapa experiment. En ny sida laddas där resten av databehandlingen fortsätter/inträffar.
- Importera datafiler. Markera filformatet och välj sedan importera. Bläddra till dataplatsen och välj de datafiler som ska importeras. Förloppet visas för varje fil på sidans vänstra panel.
- När datafiler har importerats väljer du Starta automatisk bearbetning. Välj en metod för att välja en justeringsreferens. Låt antingen programvaran bedöma alla körningar för lämplighet, ge en lista över lämpliga prover (dvs. QC-prover) eller välj den referens som passar bäst, dvs. Välj Ja, justera automatiskt mina körningar > Nästa.
- Välj Nästa på experimentdesignsidan (detta kan ställas in senare).
- Välj Utför toppplockning och ange sedan parametrar. Välj Absolut Jonintensitet under fliken Toppplockningsgränser och ange 100. Välj använd en minsta toppbredd och ange 0,01 min. Välj OK > Slutför. När bearbetningen är klar väljer du Stäng.
Toppplockgränser kan optimeras för andra datafiltyper efter behov. - Välj Avsnitt Färdigpåskärmen längst ned till höger på skärmen. Granska justerade körningar och kontrollera att varje exempel är anpassat till referensen. Justeringspoängen var >90% för de data som presenteras här. Välj Avsnitt Har slutförts.
- På nästa sida väljer du mellan ämnesdesign. Namnge designen. Välj Gruppera körningarna manuellt och skapa design. Lägg till villkor, klicka på Villkor 1 och namnge gruppen på rätt sätt. Klicka på Avsnittet Slutför.
Obs: Fortsätt att lägga till villkor som är lämpliga för att använda statistik i programvaran. Eftersom vi bara använde programvaran för att generera en oriktad matris, använde vi ett enda villkor märkt "alla". - På nästa sida väljer du Avsnitt Färdigt. Gör inte om toppplockningen.
- Granska deconvolution och klicka sedan på Avsnitt Slutför.
- Gå till Arkiv > Exportera sammansatta mått. Avmarkera alla egenskaper som inte önskas i utdata. Klicka på OK. Välj en plats där du vill spara CSV-filen. Klicka på Spara > Öppna arkiv > Öppna mapp eller Stäng.
- Filtrera data med hjälp av extraktionsämnen för att ta bort artefakter (kalkylprogram).
- För varje RT x m/z-funktion beräknar du det genomsnittliga svaret i extraheringsämnen i en ny kolumn.
- För varje RT x m/z-funktion beräknar du det genomsnittliga svaret i alla andra exempel (inklusive QC-samplingar).
- Beräkna % toppintensitet för ämnen i prover (genomsnittligt svar i blank/genomsnittligt svar i proverna x 100).
- Sortera kolumnen procentbidrag från lägsta till högsta värden.
- Ta bort funktioner som har >5% intensitetbidrag från ämnen.
- Filtrera värden som saknas och korrigera funktionssignalerna till signaler i poolade QC-prover.
- Öppna databehandlingsprogrammet (Tabell över material). Klicka på knappen Visa MatrixAnalyzer. Klicka på knappen Öppna datafil.
- Navigera till CSV-filplatsen som innehåller toppintensiteten för RT x m/z-funktioner för varje exempel (oriktad matris). Välj Öppna.
- Fyll i varje parameter efter behov under fliken QC-exempel. För den datauppsättning som beskrivs här använder du QC category=QC, ignore categories=empty, impute type=none, coverage threshold=80, scale using=no scaling, uncheck log transform, correct using=smoothing spline, smoothing=0.25.
- Klicka på korrigeringen av uppspelningsknappen QClängst upp till höger på matrispanelen.
- När korrigeringen har utförts längst upp till höger på matrispanelen klickar du på Spara resultat. Navigera till en lämplig plats och spara CSV-resultatfilen.
- Filtrera data för att ta bort funktioner som har >20% RSD i QC-exempel.
- Ordna data så att exempel na finns i rader och funktioner finns i kolumner.
- Beräkna den genomsnittliga toppintensiteten för QC-prover i en ny kolumn.
- Beräkna standardavvikelsen för toppintensiteten för QC-prover i en ny kolumn.
- Beräkna den relativa standardavvikelsen för toppintensiteten för QC-prover: (QC standardavvikelse/QC genomsnitt) x 100.
- Sortera funktionerna från lägsta till högsta %RSD och ta bort funktioner som har en QC RSD >20%.
- Filtrera data för att ta bort funktioner med lågaRSD-exempel/RSDQC-förhållanden (t.ex. <1).
- Beräkna den genomsnittliga toppintensiteten för exempel i en ny kolumn.
- Beräkna standardavvikelsen för toppintensiteten för prover i en ny kolumn.
- Beräkna den relativa standardavvikelsen för provernas toppintensitet: (provstandardavvikelse/provmedelvärde) x 100.
- I en ny kolumn delar du upp exemplen RSD med QC RSD.
- Sortera värdena (RSD-exempel /RSDQC-förhållanden) från högsta till lägsta och ta bort funktioner med ett förhållande <1.sample
- Utsnärda saknade värden (flera tillgängliga metoder online).
- Formatera kalkylbladet så att exempel na finns i rader och funktioner finns i kolumner. Den första kolumnen ska vara exempelfilnamnet. Skapa ytterligare en kolumn bredvid filnamnen och ange exempelgrupperingarna. I det här fallet grupperades proverna efter sort.
- Spara kalkylbladet som en CSV-fil.
- Gå till hemsidan för den webbaserade analytiska pipelinen för högdataflödesmetabolomics (se Tabell över material)och klicka på Klicka här för att starta.
- Klicka på Statistisk analys. Under Ladda upp dataväljer du Datatyp: högintensitetstabell, Formatera: Exempel på rader (oparade) och välj sedan arkiv.
- Navigera till CSV-filen, välj Öppna och välj sedan Skicka.
- På nästa sida väljer du Uppskattning saknas. Avmarkera steg 1 (detta utfördes i AnalyzerPro XD). I steg 2 väljer du en metod för att uppskatta värden som saknas.
OBS: För de uppgifter som presenteras här - "uppskatta saknade värden" med KNN valdes. - I detta skede kan datamatrisen laddas ner (välj Hämta från webbsidans vänstra panel) eller fortsätta att utföra ytterligare statistiska analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Växtmetabolomen påverkas av en kombination av dess arvsmassa och miljö, och dessutom i en jordbruksmiljö, växtförvaltningssystemet. Vi visar att genetiska skillnader mellan vetesorter kan observeras på metabolitnivå, här, med över 500 uppmätta föreningar som visar signifikant olika koncentrationer mellan sorter enbart i säden. God massnoggrannhet (<10 ppm fel) och signal reproducerbarhet (<20% RSD) av interna standarder(figur 2) observerades för både negativa och positiva joniseringlägen(tabell 3). Den beskrivna provberedningen och den flytande kromatografi-masspektrometribaserad analys gav >900 deconvoluted funktioner i negativjoniseringsläge och >1300 deconvoluted funktioner i positivt joniseringsläge. Preparativa ämnen (figur 3) ingick för att avgöra om provberednings- och analysmetoderna introducerade artefaktfunktioner, och därmed alla icke-biologiska influenser som eliminerats från datamatrisen. Det konstaterades att 421 signaler i det negativa läget och 835 signaler i det positiva läget hade signalintensiteter som är lika med eller större än 5% av den genomsnittliga signalintensiteten i spannmålsprover. Dessa funktioner togs bort och efter ytterligare datafiltreringsteg (steg 7 och figur 1)returnerade det negativa läget 483-funktioner och det positiva läget returnerade 523 funktioner, vilket bildar den metaboliska ögonblicksbilden. Metoden lyckades upptäcka funktioner, som hade betydligt olika intensiteter mellan vetesorter (figur 4) med >500 viktiga funktioner i båda joniseringslägena. I negativjoniseringsläge var majoriteten av viktiga funktioner i den omvända fasgradienten och i positivt joniseringsläge, de flesta viktiga funktioner var i lipidgradienten (figur 4).
Bild 1: Arbetsflödet som används i den här analysen för datakontroll, bearbetning och filtrering. Steg 1 utförs med hjälp av dataanskaffnings-/visningsprogramvaran på instrumentet så att "on-the-fly"-bedömningar kan utföras. Detta inkluderar beräkning av massfel (ppm) av interna standarder och överliggande interna standardtoppar för visuell bedömning av datareproducerbarhet. Steg 2-7 beskriver databehandlingsproceduren som beskrivs i protokollet, steg 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Extraherade jonkromattogram. Extraherade jonkromatitogram av 13C6-sorbitol (mörkblå), leucin-enkephalin (rosa), d6-trans-cinnamic syra (orange), 2-aminoantracene (grön) och miconazol (ljusblå) interna standarder i positiva (övre) och negativa (botten) elektrosprayjonisering (ESI) lägen. De interna standardretentionstiderna och intensiteterna visas. ESI + och ESI - Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Totalt jonkromattogram (TIC) överlagring av preparativa ämnen som visar negativt läge (rosa) och positivt läge (blå) förvärv. En intern standard, miconazol, visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Totalt jonkromattogram (TIC) överlägg, som visar negativt läge (rosa) och positivt läge (blå) förvärv och antal funktioner som skiljer sig avsevärt mellan vete sort över kromatografiska gradienten. I negativt läge hittades det största antalet signifikanta funktioner när den mobila fas B-sammansättningen var hög. I positivt läge hittades det största antalet viktiga funktioner när den mobila fas C-sammansättningen var hög. En intern standard, miconazol, visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Segment | Tid | Flöde | %A | %B | %C | Kurva |
| Jag är inte så här. | (mL/min) | |||||
| 1 | Inledande | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 2 | 1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 3 | 7 | 0.8 | 2 | 98 | 0 | 6 |
| 4 | 7.1 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 5 | 10 | 0.8 | 0 | 100 | 0 | 6 |
| 6 | 18 | 0.4 | 0 | 10 | 90 | 6 |
| 7 | 21 | 0.4 | 0 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 21.1 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 9 | 24 | 0.4 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 10 | 24.1 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
| 11 | 25 | 0.6 | 98 | 2 | 0 | 6 |
Tabell 1: Flytande kromatografi tidsbelagt program för mobila faskompositioner.
| Parametern | Intern standard | ||||
| 13 (på) C6-sorbitol | Leucine-enkephalin | d6-transcinnamic syra | 2-amino-antracen | Miconazol | |
| Quan m/z | 211.09 (187.09) | 556.28 (554.26) | 155.097 (153.08) | 194.1 | 414.99 |
| Masstolerans (amu) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 (0.05) | 0.01 | 0.01 |
| Kvarhållningstid | 1.2 | 4.6 | 5.1 | 6.5 | 7 |
| Fönstret Kvarhållningstid | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 (0.5) | 0.1 | 0.1 |
| Identifieringstyp | Högsta | Högsta | Högsta | Högsta | Högsta |
| Svarstyp | Området | Området | Området | Området | Området |
| Tröskelvärde för område | 10 | 10 (50) | 10 (50) | 10 | 10 |
| Tröskelvärde för bredd | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 | 0.01 |
| Tröskelvärde för höjd | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Signal-brusförhållande | 5 | 5 | 3 (5) | 5 | 5 |
| Utjämning | 5 | 5 (3) | 5 (3) | 5 | 5 |
Tabell 2: Parametrar för toppdetektering för interna standarder i positiva (och negativa) förvärvslägen.
| Massnoggrannhet (ppm) | %RSD före QC-korrigering | %RSD efter QC-korrigering | ||
| Negativt läge | 13 (på) C6-sorbitol | 4.59 | 6.12 | 7.08 |
| D6-transcinnamic syra | 7.94 | 3.93 | 5.99 | |
| Leucine-enkephalin | 0.91 | 1.8 | 1.96 | |
| Positivt läge | 13 (på) C6-sorbitol | 5.65 | 14.1 | 15.3 |
| Leucine-enkephalin | 3 | 3.24 | 5 | |
| D6-transcinnamic syra | 8.03 | 5.41 | 9.81 | |
| 2-aminoantracene | 3.99 | 7.97 | 5.45 | |
| Miconazol | 1.8 | 3.01 | 5.72 | |
Tabell 3: Prov(n=30) intern standardmassnoggrannhet (ppm) och signalreproducerbarhet före och efter QC-korrigering uttryckt som relativ standardavvikelse (%).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en LC-MS-baserad oriktad metabolomics metod för analys av vetekorn. Metoden kombinerar fyra förvärvslägen (omvänd fas och lipid-mottaglig omvänd fas med positiv och negativ jonisering) i två lägen genom att införa en tredje mobil fas i den omvända fasgradienten. Den kombinerade metoden gav cirka 500 biologiskt relevanta egenskaper per jonpolaritet med ungefär hälften av dessa signifikant olika i intensitet mellan vetesorter. Betydande förändringar i metabolitkoncentrationen i kornet av olika vetesorter indikerar förändrad biokemi, som kan kopplas till sjukdomsresistens, stresstolerans och andra fenotypiska egenskaper som är viktiga för kornkvalitet och avkastning. Till exempel har metabolomik metoder använts för att beskriva nya försvarsmekanismer12 och föreslå rollen av metaboliter i torka tolerans13. Framtida tillämpningar av detta protokoll kan ytterligare koppla biokemiska profiler av särskilda sorter till genetiska egenskaper som är önskvärda för vissa miljöer och förvaltningsmetoder. I sin tur skulle detta möjliggöra produktion av optimal kornkvalitet och avkastning för utvalda genotyper.
Införandet av interna standarder är avgörande för detta protokoll så att användaren kan bestämma förändringar i signal, lagring tidskift och som indikatorer på massnoggrannhet. Förändringar i signalen kan till exempel indikera suboptimal extraktion, insprutning (inklusive vätskesystemblockeringar) eller detektorns prestanda. Kvarhållningstidsskiften kan tyda på dålig pumpprestanda, olämplig mobil fasgradientekvilibation eller att LC-kolonnens stationära fas har försämrats. Dålig massnoggrannhet kan tyda på en drivande kalibrering och att systemet kräver omkalibrering. I alla ovanstående fall bör systemet stoppas och lämpligt underhåll/utbyte av delar som utförs. Vi inkluderade fyra standarder i extraktionslösningen som används för att förbereda spannmål och en standard i det slutliga provet som tillsattes före injektion. Man var noga med att se till att standarder var mottagliga för varje joniseringsläge och täckte en rad lagringstider. Vi erkänner dock att denna samling av standarder skulle kunna förbättras med införandet av en märkt lipidstandard. Det har visat sig att vetekorn innehåller hundratals triacylglycerols (TAGs)5, varav något skulle vara ett lämpligt komplement till detta protokoll. Införandet av preparativa ämnen och poolade QC-prover8 är också viktiga steg i detta protokoll. Tusentals jonfunktioner upptäcks i oriktade masspektrometrimetoder och det är viktigt att utesluta sådana som endast förekommer i tomma prover och även sådana som inte reproducerbart upptäcks (dvs. hög %RSD) under hela analysen.
Även om den nuvarande metoden sparar avsevärd tid och resurser, om en kvartär lösningsmedelshanterare inte är tillgänglig, kan standardomvänd fas och lipidmetoder användas för att uppnå samma resultat. Den utvinningsvolym som används i detta protokoll skulle räcka för analys av ytterligare förvärvslägen. Detta protokoll beskriver en acetonitril extraktion. Även om det är framgångsrikt, en alternativ extraktion lösningsmedel, eller kombination av lösningsmedel, kommer att ge en annan metabolit täckning, som i sin tur kan leverera fler funktioner och / eller ge bättre (eller en mindre) extraktioneffektivitet av vissa föreningar. Vi har inte försökt fastställa metabolitidentiteten hos de statistiskt signifikanta mätningar som lösts i detta protokoll. Massspektrala databaser för växtmetaboliter och lipider finns dock tillgängliga och utvecklar5,,14,15. För att identifiera metaboliterna skulle tandemmassspektra (MS/MS) behöva samlas in utöver fullständiga skanningsdata. Dessa kan samlas in under den första körningen med hjälp av poolade prover och en lämplig MS/MS-metod eller på reserverat extrakt (lagras vid -80 °C) när metaboliter av intresse har fastställts. Vi observerade stora vikförändringar av föreningar mellan sorter så vi skulle rekommendera att göra både och i andra hand, med hjälp av en sort som är känd för att innehålla en hög koncentration av intresseföreningen för att få högsta kvalitet MS / MS spektrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill erkänna West Australian Premier's Agriculture and Food Fellowship program (Institutionen för jobb, turism, vetenskap och innovation, regeringen i västra Australien) och Premier's Fellow, Professor Simon Cook (Centre for Digitalt jordbruk, Curtin University och Murdoch University). Fältförsök och spannmål urval samling stöddes av regeringen i västra Australiens Royalties for Regions program. Vi erkänner Grantley Stainer och Robert French för deras bidrag till fältförsök. Den NCRIS-finansierade Bioplatforms Australien är erkänd för utrustning finansiering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 13C6-sorbitol | Merck Sigma-Aldrich | 605514 | |
| 2-aminoanthracene | Merck Sigma-Aldrich | A38800-1 g | |
| Acetonitrile | ThermoFisher Scientific | FSBA955-4 | Optima LC-MS grade |
| Ammonium formate | Merck Sigma-Aldrich | 516961-100 mL | >99.995% |
| Analyst TF | Sciex | Version 1.7 | |
| AnalyzerPro software | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.2. Version 5.7 | |
| AnalyzerPro XD sortware | SpectralWorks Ltd. | Data processing software used for step 7.5. Version 1.4 | |
| Balance | Sartorius. Precision Balances Pty. Ltd. | ||
| d6-transcinnamic acid | Isotec | 513962-250 mg | |
| Formic acid | Ajax Finechem Pty. Ltd. | A2471-500 mL | 99% |
| Freeze dryer (Freezone 2.5 Plus) | Labconco | 7670031 | |
| Glass Schott bottles (100 mL, 500 mL, 1 L) | |||
| Glass vials (2 mL) and screw cap lids (pre-slit) | Velocity Scientific Solutions | VSS-913 (vials), VSS-SC91191 (lids) | |
| Installation kit for Sciex TripleToF | Sciex | p/n 4456736 | |
| Isopropanol | ThermoFisher Scientific | FSBA464-4 | Optima LC-MS grade |
| Laboratory blender | Waring commercial | Model HGBTWTS3 | |
| Leucine-enkephalin | Waters | p/n 700008842 | Tuning solution |
| Metaboanalyst | https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml | Web-based analytical pipeline for high-throughput metabolomics. Free, web-based tool. Version 4.0. | |
| Methanol | ThermoFisher Scientific | FSBA456-4 | Optima LC-MS grade |
| Miconazole | Merck Sigma-Aldrich | M3512-1 g | |
| Microcentrifuge (Eppendorf 5415R) | Eppendorf (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 5426 No. 0021716 | |
| Microcentrifuge tubes (2 mL) | SSIbio | 1310-S0 | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | ||
| Peak View software | Sciex | Version 1.2 (64-bit) | |
| Pipette tips (200 uL, 100 uL) | ThermoFisher Scientific | MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL) | |
| Pipettes (200 uL, 1000 uL) | ThermoFisher Scientific | ||
| Plastic centrifuge tubes (15 mL) | ThermoFisher Scientific | NUN339650 | |
| Progenesis QI | Nonlinear Dynamics | Samll molecule discovery analysis software. Version 2.3 (64-bit) | |
| Sciex 5600 triple ToF mass spectrometer | Sciex | ||
| Screw-cap lysis tubes (2 mL) with ceramic beads | Bertin Technologies | ||
| Sodium formate | Merck Sigma-Aldrich | 456020-25 g | |
| Tissue lyser/homogeniser | Bertin Technologies | Serial 0001620 | |
| Volumetric flasks (10 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 1 L) | |||
| Vortex mixer | IKA Works Inc. (Distributed by Crown Scientific Pty. Ltd.) | 001722 | |
| Water | ThermoFisher Scientific | FSBW6-4 | Optima LC-MS grade |
| Water's Acquity LC system equipped with quaternary pumps | Waters | ||
| Water's Aquity UPLC 100mm HSST3 C18 column | Waters | p/n 186005614 |
References
- Hall, R., et al. Plant metabolomics: the missing link between genotype and phenotype. Plant Cell. 14, (2002).
- Beleggia, R., et al. Effect of genotype, environment and genotype-by-environment interaction on metabolite profiling in durum wheat (Triticum durum Desf.) grain. Journal of Cereal Science. 57 (2), 183-192 (2013).
- Das, A., Kim, D. -W., Khadka, P., Rakwal, R., Rohila, J. S. Unraveling Key Metabolomic Alterations in Wheat Embryos Derived from Freshly Harvested and Water-Imbibed Seeds of Two Wheat Cultivars with Contrasting Dormancy Status. Frontiers in Plant Science. 8 (1203), (2017).
- Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain. Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).
- Riewe, D., Wiebach, J., Altmann, T. Structure Annotation and Quantification of Wheat Seed Oxidized Lipids by High-Resolution LC-MS/MS. Plant Physiology. 175 (2), 600-618 (2017).
- Blazenovic, I., et al. Structure Annotation of All Mass Spectra in Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2155-2162 (2019).
- Castro-Perez, J. M., et al. Comprehensive LC-MSE Lipidomic Analysis using a Shotgun Approach and Its Application to Biomarker Detection and Identification in Osteoarthritis Patients. Journal of Proteome Research. 9 (5), 2377-2389 (2010).
- Sangster, T., Major, H., Plumb, R., Wilson, A. J., Wilson, I. D. A pragmatic and readily implemented quality control strategy for HPLC-MS and GC-MS-based metabonomic analysis. Analyst. 131 (10), 1075-1078 (2006).
- Dunn, W. B., et al. Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Nature Protocols. 6 (7), 1060-1083 (2011).
- Broadhurst, D., et al. Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies. Metabolomics. 14 (6), 72 (2018).
- Chong, J., et al. MetaboAnalyst 4.0: towards more transparent and integrative metabolomics analysis. Nucleic Acids Research. 46 (1), 486-494 (2018).
- Du Fall, L. A., Solomon, P. S. The necrotrophic effector SnToxA induces the synthesis of a novel phytoalexin in wheat. New Phytologist. 200 (1), 185-200 (2013).
- Bowne, J. B., et al. Drought Responses of Leaf Tissues from Wheat Cultivars of Differing Drought Tolerance at the Metabolite Level. Molecular Plant. 5 (2), 418-429 (2012).
- Wang, M., et al. Sharing and community curation of mass spectrometry data with Global Natural Products Social Molecular Networking. Nature Biotechnology. 34 (8), 828-837 (2016).
- Shahaf, N., et al. The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification. Nature Communications. 7 (1), 12423 (2016).
