Eenvoudige lithografie-vrije single cell micropatterning met behulp van Laser-Cut Stencils
Summary
Dit protocol introduceert een lithografievrije micropatroonmethode die eenvoudig en toegankelijk is voor mensen met een beperkte bio-engineeringachtergrond. Deze methode maakt gebruik van aangepaste laser-cut stencils om micropatroon extracellulaire matrix eiwitten in een vorm van belang voor het moduleren van cel morfologieën. De procedure voor micropatterning wordt aangetoond met behulp van geïnduceerde pluripotente stamcel afgeleide cardiomyocyten.
Abstract
Micropatroon technieken zijn op grote schaal gebruikt in de celbiologie om de effecten van het beheersen van celvorm en grootte op cel lot bepaling bij een enkele cel resolutie te bestuderen. De huidige state-of-the-art single cell micropatterning technieken omvatten zachte lithografie en micro-contact afdrukken, dat is een krachtige technologie, maar vereist getrainde technische vaardigheden en bepaalde faciliteit ondersteuning in microfabricage. Deze beperkingen vereisen een meer toegankelijke techniek. Hier beschrijven we een eenvoudige alternatieve lithografievrije methode: stencil-gebaseerde eencellige patronen. Wij bieden stapsgewijze procedures, waaronder stencilontwerp, polyacrylamidehydrogelfabricage, eiwitopname op basis van stencil en celbeplating en -cultuur. Deze eenvoudige methode kan worden gebruikt om een array van maar liefst 2.000 cellen patroon. We tonen de patronen van cardiomyocyten afgeleid van enkele door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC) met verschillende celvormen, van een 1:1 vierkant tot een 7:1 volwassen cardiomyocyte-achtige rechthoek. Deze stencil-gebaseerde eencellige patroonis lithografie-vrij, technisch robuust, handig, goedkoop, en vooral toegankelijk voor mensen met een beperkte bio-engineering achtergrond.
Introduction
De komst van hiPSC’s en de daaropvolgende ontwikkeling van protocollen voor hun gerichte differentiatie in verschillende celtypen hebben het mogelijk gemaakt om ontwikkeling en ziekte op moleculair en patiëntspecifiek niveau te bestuderen, met name met behulp van door patiënten afgeleide iPSC-cardiomyocyten (iPSC-CC’s) om cardiomyopathmieten te modelleren1,2. Echter, een belangrijke beperking tot het bestuderen van ontwikkeling en fysiologie met behulp van het iPSC-systeem en andere in vitro modellen is de afwezigheid van een gestructureerde micro-omgeving. In situ worden cellen onderworpen aan de beperkingen van de extracellulaire matrix (ECM), evenals naburige cellen. De bijzondere biochemische samenstelling en stijfheid van deze micro-omgevingen dicteren de ruimtelijke verdeling van cellen en factoren die beschikbaar zijn voor het aangaan van celhechting. Dit, op zijn beurt, beïnvloedt intracellulaire signalering trajecten, genexpressie, en cel lot bepaling. Bijvoorbeeld, micropatroon iPSC-CM in een volwassen-achtige staaf vorm heeft een aanzienlijk betere contractiele vermogen, calcium stroom, mitochondriale organisatie, elektrofysiologie, en dwars-tubule vorming3. Zo zijn de eigenschappen van de micro-omgeving integraal in de regulatie van cellulaire functies.
Eerdere micropatroontechnieken waren sterk afhankelijk van fotolithografie(figuur 1A). In deze techniek wordt een laag fotogevoelig polymeer, of fotoresist, gesponnen op een plat substraat van oplossing tot een dunne film van ongeveer 1 μm dik. Vervolgens wordt ultraviolet (UV) licht op de fotoresist aangebracht door middel van een masker met het gewenste patroon. Blootstelling aan ultraviolet (UV) licht verandert de fotoresist chemisch door de oplosbaarheid ervan in de respectievelijke ontwikkelaarsoplossing aan te passen, waardoor het gewenste patroon van het masker op het substraat wordt overgebracht. Veel micropatroonmethoden bevatten fotolithografie, omdat het nanometer-aan micrometer-niveau controle over het ontwerp van de celpatronen verleent. Het spinnen van de fotoresist is echter zeer gevoelig voor onzuiverheden, omdat de kleinste stofdeeltjes de verspreiding van de oplossing in een dunne film zullen verstoren. Fotolithografie moet daarom worden uitgevoerd in niet-verontreinigde faciliteiten, die kostbaar zijn om te onderhouden en speciale expertise vereisen om te gebruiken. Bovendien zijn de chemische stoffen die in de fotolithografie worden gebruikt vaak giftig voor cellen en kunnen ze belangrijke biomoleculen denatureren. Fotolithografie vormt dus aanzienlijke obstakels voor de fabricage van micropatronen voor handige biologische toepassingen.
In 1994, Whitesides en collega’s4 overwon een aantal van de uitdagingen in verband met fotolithografie door baanbrekende een verzameling van technieken genaamd zachte lithografie. In zachte lithografie wordt een microgestructureerd oppervlak gemaakt met polydimethylsiloxaan (PDMS), een transparant, rubberachtig materiaal, gebruikt om een patroon van ECM-eiwitten te genereren4. Veelvoorkomende zachte lithografische technieken omvatten microcontactafdrukken en microfluïdische patronen. Bij het printen van microcontact, momenteel de meest populaire zachte lithografische methode, brengt een PDMS-stempel bekleed met ECM-eiwitten het materiaal over op een oppervlak op de gebieden die door de stempel worden gecontacteerd (figuur 1B). In microfluïdische patronen worden microstructuren zodanig ontworpen op een PDMS-oppervlak, zodat wanneer de stempel op een substraat wordt gedrukt, een netwerk van microkanalen ontstaat, waardoor vloeistoffen aan gewenste gebieden kunnen worden geleverd , wordt gecreëerd (Figuur 1C)5. Zachte lithografie biedt verschillende voordelen ten opzichte van fotolithografie. Zodra een master wafer is gemicrofabriceerd, de PDMS stempels kunnen gemakkelijk worden gerepliceerd zonder verdere werkgelegenheid van clean-room faciliteiten. Bovendien maakt de afwezigheid van organische oplosmiddelen in het proces van zachte lithografie het gebruik van polymere materialen zoals polystyreen mogelijk, meestal gebruikt in de celkweek. Ten slotte is micropatroon met behulp van zachte lithografische methoden niet beperkt tot vlakke oppervlakken. Zo verhoogt zachte lithografie de toegankelijkheid en functionaliteit van micropatroonfabricage via fotolithografie6. Zachte lithografie heeft echter belangrijke nadelen. Een eerste etsstap, met behulp van fotolithografie, is bijvoorbeeld nog steeds nodig om de stempel te microfabriceren. Bovendien is micropatroon met behulp van een PDMS-stempel onderhevig aan variaties in de kwaliteit van eiwitoverdracht op het substraat6. Het vermijden van deze discrepanties vereist optimalisatie en consistentie in de druk die wordt uitgeoefend op de PDMS-stempel tijdens eiwitoverdracht, anders kunnen vervorming en vervorming van de functiegrootte van de PDMS-mallen optreden6. Er is ook een grote zorg van herhaaldelijk gebruik van de PDMS als gevolg van kleine molecuul absorptie7.
Om te voorkomen dat het gebruik van zachte fotolithografie en PDMS-stempels, beschrijven we een stencil-gebaseerde, lithografie-vrije single cell micropatterning methode die veel van de obstakels in verband met fotolithografie en zachte lithografie overwint. Bij deze methode wordt een polyacrylamidehydrogel gebruikt als substraat voor de integratie van ECM-eiwit op basis van stencil, waardoor selectieve beplating van enkele hiPSC-CC’s mogelijk is. Deze techniek is zeer compatibel met polymere materialen die worden gebruikt in klassieke celkweekomstandigheden. Bovendien zijn de stencils met de juiste reiniging en onderhoud herbruikbaar en bestand tegen afbraak en eiwitabsorptie tijdens het microfabricageproces. Ten slotte is het patroonproces technisch robuust, goedkoop, aanpasbaar en toegankelijk voor mensen zonder gespecialiseerde bio-engineeringvaardigheden. Deze stencil-gebaseerde micropatterning techniek is breed gebruikt in onze recente publicaties modellering gevarieerde cardiomyopathies8,9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
We beschrijven een lithografievrije op stencil gebaseerde micropatroonmethode die effectieve patronen van aanhangende cellen mogelijk maakt. In dit protocol tonen we patronen van hiPSC-CMs in verschillende lengte-breedte verhoudingen door micropatterning kelder membraan matrix eiwiteilanden op polyacrylamide hydrogels met fysiologisch- of pathologisch relevante weefselstijfheid of siliciumgebaseerde elastomeersubstraten. Deze methode is relatief eenvoudig en zeer toegankelijk voor alle onderzoekers, met inbegrip van dege…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door postdoctorale fellowship van Stanford Child Health Research Institute (CHRI) en het National Institute of Health (1F32HL142205-01) aan S.L. de NIH Office of Director’s Pioneer Award (LM012179-03), de American Heart Association Established Investigator Award (17EIA33410923), het Stanford Cardiovascular Institute, de Hoffmannroep en Schfer Foundation, en de Stanford Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine aan S.M.W , awards van het National Institute of Health (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) en Tobacco-related Disease Research Program (TRDRP 27IR-0012) aan J.C.W, de American Heart Association (AHA Postdoctoral) Fellowship Award (18POST34030106) aan H.Y. We danken Dr Andrew Olsen van Stanford Neuroscience Microscopy Service op de ondersteuning van confocale beeldvorming van de micropatroon hiPSC-CM. Wij danken H.Y. voor het eerste stencilontwerp, de fabricage, de micropatterning van iPSC-CM op de polyacrylamidehydrogel gecoate coverslip, en voorlopige confocale beeldvorming van de sarcomerestructuur van enkelcellige micropatroon iPSC-CMs.
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
