Summary
Bu protokol, sınırlı biyomühendislik geçmişi olanlar için basit ve erişilebilir bir litografi içermeyen mikrodesenleme yöntemini tanıtır. Bu yöntem, hücre morfolojilerini modüle etmek için ilgi çekici bir şekilde hücre dışı matris proteinleri mikrodesen için özelleştirilmiş lazer kesim şablonlar kullanır. Mikro desenleme prosedürü indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler kullanılarak gösterilmiştir.
Abstract
Mikro desenleme teknikleri hücre biyolojisinde hücre şekil ve boyutunu kontrol eden etkilerin tek hücre çözünürlüğünde hücre kader intibakları üzerine etkisini incelemek için yaygın olarak kullanılmıştır. Mevcut state-of-the-art tek hücreli mikrodesen teknikleri yumuşak litografi ve mikro temas baskı, güçlü bir teknolojidir içerir, ancak mikrofabrikasyon eğitimli mühendislik becerileri ve belirli tesis desteği gerektirir. Bu sınırlamalar daha erişilebilir bir teknik gerektirir. Burada basit bir alternatif litografisiz yöntemi tanımlıyoruz: şablon bazlı tek hücreli desenleme. Biz şablon tasarımı, poliakrilamid hidrojel imalatı, şablon bazlı protein birleşme ve hücre kaplama ve kültür dahil olmak üzere adım adım prosedürleri sağlar. Bu basit yöntem, 2.000 kadar hücreden oluşan bir diziyi desenlemek için kullanılabilir. 1:1 kareden 7:1 erişkin kardiyomiyosit benzeri dikdörtgeniçin farklı hücre şekillerine sahip tek bir insan kaynaklı pluripotent kök hücreden (hiPSC) elde edilen kardiyomiyositlerin desenlenmelerini gösteriyoruz. Bu şablon tabanlı tek hücre lisali, litografisiz, teknik olarak sağlam, kullanışlı, ucuz ve en önemlisi sınırlı biyomühendislik geçmişi olanlar için erişilebilir.
Introduction
HiPSCs gelişiyle ve farklı hücre tipleri içine yönlendirilmiş farklılaşma için protokollerin sonraki gelişimi mümkün moleküler ve hastaya özgü düzeyde, özellikle hasta kaynaklı iPSC kardiyomiyositler kullanarak (iPSC-CMs) modelleme kardiyomiyopatiler1,2yaptık . Ancak, iPSC sistemi ve diğer in vitro modelleri kullanarak geliştirme ve fizyoloji eğitimi için önemli bir sınırlama yapılandırılmış bir mikroortamın yokluğudur. Yerinde, hücreler hücre dışı matris (ECM) kısıtlamaları yanı sıra komşu hücrelere tabi tutulur. Bu mikroortamların belirli biyokimyasal bileşimi ve sertliği, hücrelerin mekansal dağılımını ve hücre yapışmasını için mevcut faktörleri belirler. Bu da hücre içi sinyal yollarını, gen ekspresyonunu ve hücre kaderinin belirlenmesini etkiler. Örneğin, yetişkin benzeri çubuk şeklinde mikro desenli iPSC-CM önemli ölçüde daha iyi kontraktil yeteneği vardır, kalsiyum akışı, mitokondriyal organizasyon, elektrofizyoloji, ve enine-tübül oluşumu3. Bu nedenle, mikroçevrenin özellikleri hücresel fonksiyonların düzenlenmesinde ayrılmaz bir parçasıdır.
Önceki mikrodesenleme teknikleri yoğun olarak fotolitografiye dayanıyordu (Şekil 1A). Bu teknikte, ışığa duyarlı polimer veya fotodirenç tabakası, çözeltiden düz bir substrat üzerinde yaklaşık 1 μm kalınlığında ince bir film oluşturmak için döndürüldü. Daha sonra, ultraviyole (UV) ışık istenilen desen içeren bir maske ile fotodirenç üzerine uygulanır. Ultraviyole (UV) ışığa maruz kalma, ilgili geliştirici çözümündeki çözünürlüğünü değiştirerek fotodirenç'i kimyasal olarak değiştirir ve maskeden istenilen deseni alt tabakaya aktarabilir. Birçok mikrodesenleme yöntemi fotolitografiiçerir, çünkü hücre desenlerinin tasarımı üzerinde mikrometre düzeyinde kontrol sağlar. Ancak, fotodirenç iplik kirleri son derece duyarlıdır, küçük toz parçacıkları ince bir film içine çözeltinin yayılmasını bozacak çünkü. Bu nedenle fotolitografi, bakımı maliyetli ve kullanımı özel uzmanlık gerektiren kirlenmemiş tesislerde yapılmalıdır. Buna ek olarak, fotolitografide kullanılan kimyasallar genellikle hücreler için toksiktir ve önemli biyomoleküllerden doğaartabilir. Bu nedenle fotolitografi, uygun biyolojik uygulamalar için mikro desenlerin üretilmesinde önemli engeller oluşturmaktadır.
1994'te Whitesides ve meslektaşları4, yumuşak litografi adı verilen bir teknik koleksiyonuna öncülük ederek fotolitografi ile ilgili bazı zorlukların üstesinden geldiler. Yumuşak litografide, şeffaf, kauçuk benzeri bir malzeme olan polidimethylsiloxane (PDMS) ile yapılan mikroyapılı yüzey, ECM proteinlerinin bir deseni oluşturmak için kullanılır4. Yaygın yumuşak litografik teknikler mikrotemas baskı ve mikroakışkan deseniçerir. Şu anda en popüler yumuşak litografik yöntem olan mikrotemaslı baskıda, ECM proteinleri ile kaplanmış bir PDMS damgası, malzemeyi damganın temas ettiği alanlardaki bir yüzeye aktarır(Şekil 1B). Mikroakışkan desenlemede mikroyapılar, pul bir alt tabakaya basıldığında, sıvıların istenilen alanlara ulaştırılabildiği bir mikrokanal ağı oluşturulacak şekilde PDMS yüzeyinde tasarlanır (Şekil 1C)5. Yumuşak litografi fotolitografi üzerinde çeşitli faydalar sunar. Bir kez ana gofret mikrofabrikasyon, PDMS pulları kolayca temiz oda tesisleri daha fazla istihdam olmadan çoğaltılabilir. Buna ek olarak, yumuşak litografi sürecinde organik çözücülerin yokluğu genellikle hücre kültüründe kullanılan polistiren gibi polimerik malzemelerin kullanımına olanak sağlar. Son olarak, yumuşak litografik yöntemler kullanılarak mikrodesen düz yüzeyler ile sınırlı değildir. Böylece yumuşak litografi, mikrodesen üretiminin fotolitografi 6'ya göre6erişilebilirliğini ve işlevselliğini arttırmaktadır. Ancak, yumuşak litografi önemli dezavantajları vardır. Örneğin, fotolitografi kullanarak bir ilk gravür adımı, hala damga mikrofabrikasyon için gereklidir. Buna ek olarak, bir PDMS damgası kullanarak mikrodesen substrat üzerine protein transferi kalitesinde farklılıklar tabidir6. Bu tutarsızlıklardan kaçınmak, protein transferi sırasında PDMS damgasına uygulanan basınçta optimizasyon ve tutarlılık gerektirir, aksi takdirde PDMS kalıplarının özellik boyutlarının deformasyonu ve bozulması6. Küçük molekül emilimi nedeniyle tekrar tekrar PDMS kullanarak önemli bir endişe de vardır7.
Yumuşak fotolitografi ve PDMS pulları kullanmaktan kaçınmak için, fotolitografi ve yumuşak litografi ile ilişkili engellerin çoğunu aşan şablon tabanlı, litografiiçermeyen tek hücreli mikrodesenleme yöntemini tanımlıyoruz. Bu yöntemde, bir poliakrilamid hidrojel şablon bazlı ECM protein dahil için bir substrat olarak kullanılır, tek hiPSC-CMs seçici kaplama için izin. Bu teknik klasik hücre kültürü koşullarında kullanılan polimerik malzemeler ile son derece uyumludur. Ayrıca, uygun temizlik ve bakım ile, şablonlar yeniden kullanılabilir ve mikrofabrikasyon işlemi sırasında bozulma ve protein emilimine karşı dayanıklıdır. Son olarak, desenleme işlemi teknik olarak sağlam, ucuz, özelleştirilebilir ve özel biyomühendislik becerileri olmayanlar için erişilebilir. Bu şablon bazlı mikro desenleme tekniği, çeşitli kardiyomiyopatilerinmodelli8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Negatif desen poliimid bazlı şablonların imalatı
- Bilgisayar destekli tasarım yazılımı (örneğin, AutoCAD, SolidWorks, Onshape, Adobe Illustrator) kullanarak .dxf formatında bir desen(Şekil 2A)oluşturun.
- Şablonun kenarlığı nı genişletmek için bir daire (çap = 22 mm) oluşturun.
- Katı dolu bir şekil veya istenilen desen çizin.
- Şablonların ön tarafını işaretlemek için bir chiral harfi (örneğin, R) ekleyin.
NOT: Örnek olarak, iPSC-CM'leri tek hücreli ve hücre çifti düzeylerinde desenlemek için bir dizi kare ve dikdörtgen oluşturulur. Tasarım dosyaları mevcuttur (bkz. Ek Dosyalar). Mikro üretim çözünürlük sınırı ~10 μm'dir.
- Tasarımı lazer kesimli poliimid film ve kumaş şablonlarına bir mikrofabrikasyon şirketine gönderin (Şekil 2B,C).
2. Sulfo-SANPAH aliquots hazırlanması
NOT: Protokol Fischer ve ark.11'dendeğiştirilmiştir.
- Neme dayanıklı karton numune saklama kutusu kullanın (örn. 100 kuyu, santrifüj tüpler için 10 x 10 boşluk, boyutlar: 13,4 cm x 13,4 cm x 5,1 cm). "Ad/tarih/sulfo-SANPAH 40 μL/1.200 μL PBS ile yeniden oluşturulmuş" olarak etiketle.
- Etiket 50 mikrocentrifuge tüpleri (polipropilen, 1.5 mL) kapak üzerinde bir 'S' ile.
- 4 mL susuz, ekstra kuru dimetil sülfoksit (DMSO) ve steril filtre çözeltisini bir membran filtre ünitesi (gözenek boyutu = 0,22 μm) kullanarak steril 15 mL konik tüpe alın.
- Sıvı azotbuharlaşmasını en aza indirmek için bir sıvı azot banyosu hazırlayın ve kapak ile kaplayın.
- Filtrelenmiş DMSO'nun 2 mL'sinde 50 mg sulfo-SANPAH çözün.
- Girdap iyi tamamen DMSO sulfo-SANPAH eritmek için.
- Sulfo-SANPAH çözeltisinin 40 μL aliquotlarını steril 1,5 mL tüplere dağıtın.
- Tüpleri kutuya aktarın.
- 5 dakika sıvı nitrojen tüpleri flash-freeze.
- Aliquots'u -80 °C'de saklayın.
NOT: Aliquots azalmış verimlilik olmadan 6 aya kadar kullanılabilir. Stok sulfo-SANPAH konsantrasyonu 25 mg/mL veya 50.77 mM'dir.
3. Aletlerin sterilizasyonu
- Otoklav iki bütül, 24 cam kapak (22 x 22 mm, No. 1 veya No. 1.5), bir jilet ve üç tüy bırakmayan emici mendil.
NOT: 12 hidrojel yapı yapmak için 24 cam kapak lı dudak gereklidir. Yapı başına iki kapak olmalıdır. Bazı yedek kapaklar hazırlanması tavsiye edilir. - Etanol geçirmez plastik bir kutuya (örn. 1.000°L pipet ucu kutusu) iki adet parafin film (4 x 4 inç) yerleştirin ve en az 15 dakika boyunca taze %70 etanol le sterilize edin.
4. Poliakrilamid hidrojel öncül çözeltisinin hazırlanması
NOT: Protokol Lee ve ark.12'dendeğiştirilmiştir.
- Girdap ile 50 mL polipropilen santrifüj tüp deiyonize su 36.25 mL aminoetil metakrilat (AEM) 125 mg çözünür.
- 50 mL 10 kPa poliakrilamid öncül çözeltisi (8-0.15-15 mM) hazırlamak için, 10 mL %40 akrilamid çözeltisi, %3.75 mL 2 bis-akrilamid çözeltisi ve yeni bir 50 mL polipropilen santrifüj tüpte 4.1 adımda hazırlanan AEM çözeltisinin 36,25 mL'ini karıştırın.
NOT: Öncül çözeltinin nihai konsantrasyonu atom kuvveti mikroskobu ile ~10 kPa sertliği ile ölçülen %8 akrilamid, %0.15 bis-akrilamid ve 15 mM AEM'dir. İlgi doku uygulamalarına göre hidrojelsertliği% 40 akrilamid oranı değiştirerek değiştirilebilir 2% bis-akrilamid çözeltisi. Örneğin, %8 akrilamid-%0.08 bis-akrilamid çözeltisi 3 kPa hidrojel verir; %8 akrilamid-%0.48 bis-akrilamid çözeltisi 38 kPa hidrojel verir; %8 akrilamid-%0.48 bis-akrilamid çözeltisi 60 kPa hidrojel verir. Bu değişmiş oranları ile öncül çözeltiler yapılan hidrojellerin sertliğini onaylamak için tavsiye edilir.
5. Fotoslüatör çözeltisinin hazırlanması
- 1 mL 5% fotoproprotektör çözeltisi için, ilk olarak 50 mg 2-hidroksi-4'-(2-hidroksetosoksi)-2-metilpropiophenone toz700 μL 100% etanol kapaklı 1.5 mL polipropilen santrifüj tüp.
NOT: 2-Hidroksi-4'-(2-hidroksitoksi)-2-metilpropiophenone suda çözünmez. Girdap ederek etanol tozu tamamen eritmek için emin olun. - Girdap yoluyla etanolde 2-hidroksi-4'-(2-hidroksitoksi)-2-metilpropiophenone tamamen eritildikten sonra, 1 mL'lik son hacim için 300 μL fosfat-tamponlu salin (PBS) ekleyin.
NOT: 2-hidroksi-4'-(2-hidroksitoksi)-2-metilpropiofenon çözeltisinin son konsantrasyonu %5'tir. Foiled 5% fotoiner çözeltisi 4 °C'de 4 hafta boyunca iyidir.
6. İnatsal membran matriks protein çözeltisinin hazırlanması
NOT: Bazal membran matrisi(Malzeme Tablosu)ısıya duyarlı bir malzemedir. Soğutulmuş pipet uçları ve tüplerin yanı sıra buz gibi çözeltiler ile buz üzerinde çalışmak için emin olun. Yeni bir bazal membran matris stoku bir gecede 4 °C'de buz üzerinde yavaşça çözülmelidir.
- Hidrojel yapı başına 200 μL bazal membran matris protein çözeltisi hazırlayın. 12 yapı için 2.4 mL bodrum membran matriks protein çözeltisi gereklidir. %10 ekstra çözelti (örn. 2,6 mL) hazırlayın.
- Her yeni toplu/çok sayıda bodrum membran matris protein çözeltisi için seyreltme oranını optimize edin. İlk kez, hücre desenleme için en iyi nitelikleri veren seyreltme oranını bulmak için 1:10, 1:20, 1:40 seyreltme oranlarını test edin.
NOT: Eğer bazal membran matriks protein çözeltisi çok viskoz ise, şablonun üzerine bir jel oluşturur ve şablonu çıkarırken soyulması daha olasıdır. Protein çözeltisi çok akışkan sayılsa, şablonların desen deliklerine nüfuz eder ve bu da kalitenin düşük olmasına neden olur. - Buz gibi Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta/Besin Karışımı F-12 (DMEM/F12) ortam veya yukarıdaki optimize seyreltme seyreltme seyreltme seyreltme pBS ile buz üzerinde seyreltilmiş bazal membran matris protein stok çözeltisi. Örneğin, stok çözeltisinin 120 μL'ini 2,4 mL DMEM/F12 ortam (1:20) seyreltin ve daha sonra kullanmak üzere buzda tutun.
7. Hydrogel imalatı
- Uv tezgah lambası (365 nm, 4 mW/cm2)biyolojik bir güvenlik kaputuna yerleştirin.
- 3.2. basamaktaki steril parafin filmlerini steril koşullarda tamamen kurutun. Parafin filmleri tamamen kuru değilse, artık sıvıyı çıkarmak için bir vakum aspirasyon sistemi kullanın. Otoklavlı forceps kullanarak her parafin film üzerinde adım 3.1 altı otoklavlı kapakları yerleştirin.
- 50 mL polipropilen santrifüj tüpte %5 fotoprosetor solüsyonu (adım 5.2) poliakrilamid öncül çözeltisi (adım 4.2) ile seyrelterek UV-crosslinkable poliakrilamid öncül çözeltisini hazırlayın. 5 mL UV-crosslinkable poliakrilamid öncül çözeltisi için, 5 mL poliakrilamid öncül çözeltisine 5mL 50 μL fotoinatör çözeltisi ekleyin.
- Önkür çözeltiyi, sterilizasyon için 0,22 m gözenek boyutuna sahip 50 mL filtre ünitesi ni kullanarak 7.3 adımdan filtreleyin.
NOT: Her zaman taze öncül çözüm hazırlayın. - Parafin filme petri çanak her 22 x 22 mm cam kapak kayma adım 7.4 poliakrilamid öncül çözeltisi 200 μL dağıtın ve dikkatlice arasında çözüm sandviç üzerine başka bir 22 x 22 mm cam kapak ile kaplayın (Şekil 3A).
NOT: Parafin filmi dökülmeyi önlemek ve kapaklar arasındaki öncül çözeltiyi sınırlamak için kullanılır. - Uv tezgah lambası altında adım 7.5 coverslip içeren Petri çanak yerleştirin ve 5 dakika için poliakrilamid hidrojeller fotopolimerize(Şekil 3B).
NOT: Yüzey beyaz değilse, yüzeyin UV emilmesi fotocrosslinking verimliliğini azaltır. Beyaz olmayan yüzeyde beyaz kağıt kapsama UV yoğunluğu kaybını en aza indirmek için önemlidir. UV ışınlarından korunmak için lambayı alüminyum folyo ile kaplayın ve UV koruma gözlüğü takın. - Bir kapağı kaldıraç hareketi yle jilet kullanarak diğerinden dikkatlice ayırın(Şekil 3C).
NOT: Hidrojel genellikle üst kapak kayma sopa olacaktır. Kapak kaymasını yumuşak hidrojelden çıkarken ekstra dikkat edin, çünkü kırılma olasılığı yüksektir. - Tek kullanımlık polipropilen hazneyi PBS ile doldurun. PBS'deki hidrojelleri 5 dakika boyunca durulamak için PBS içeren rezervuardaki hidrojel-coverslip kompozitleri aktarın. Duruladıktan sonra, petri kabındaki parafin filminin üzerine hidrojel yapısını geri yerleştirin.
8. Protein çekimi
- Bir buz kovası hazırlayın ve PBS'yi hazırlayın.
NOT: Altı hidrojel için 1.200 μL soğuk PBS gereklidir. - Sulfo-SANPAH aliquot (1 şişe = 6 jel) alın.
NOT: Gerekirse, kullanılan sulfo-SANPAH miktarı optimizasyon dan sonra azaltılabilir. - Sulfo-SANPAH aliquot bir şişe içine soğuk PBS 1.200 μL ekleyin ve yukarı ve aşağı borulama tarafından karıştırın.
- Petri kabındaki parafin filmine 200 μL sulfo-SANPAH dağıtın ve sulfo-SANPAH ile temas eden hidrojel-coverslip kompozit ile kaplayın (Şekil 3D).
NOT: Sulfo-SANPAH hidroliz nedeniyle suya çok duyarlıdır. Kullanımdan hemen önce -80 °C'den yeni çözülür. Artıkları yeniden kullanmayın veya yeniden dondurmayın. - Sulfo-SANPAH'ı etkinleştirmek için hidrojeli 365 nm, 4 mW/cm2'de 5 dk UV lambasına maruz bırakın.
NOT: Maruz kaldıktan sonra sulfo-SANPAH turuncudan kahverengiye dönüşür (Şekil 3E). Hidrojel kahverengiye dönerse, sulfo-SANPAH fenil azit grubunun başarılı aktivasyonu ve sulfo-SANPAH'ın hidrojel üzerine dahil edilmesi anlamına geliyor. Sulfo-SANPAH aktivitesi azalacağı için, maksimum 10 dakika içinde 8.6−8.9 adımlarını doğrudan uygulayın. - Taze PBS ile tek kullanımlık polipropilen rezervuar ı yeniler. Sulfo-SANPAH aktivasyonundan sonra, aktif hidrojelleri aktarın ve bağlı olmayan sulfo-SANPAH'ı çıkarmak için hidrojelleri pbs rezervuarında hızlı bir şekilde durula.
NOT: Uzun bir yıkama düşük protein konjugasyon verimliliği neden olabilir. - Hızlı bir durulamadan sonra, petri tabaklarında parafin filmine hidrojel bağlı kapakları yerleştirin ve hidrojelleri steril tiftiksiz mendillerle dikkatlice damlayın.
NOT: Hidrojel in üstünde kalan PBS şablon yoluyla bodrum membran matris protein çözeltisi sızıntısı neden olur, ve çok kapsamlı kuruması şablon çok yüksek yapışma nedeniyle şablon çıkarılması üzerine hidrojel rüptürüne yol açacaktır. - Şablonu hidrojellerin üzerine yerleştirin ve otoklavsız mendil ile dab şablon ve hidrojel arasında sıkı sızdırmazlık sağlamak için(Şekil 3F).
- 6.3(Şekil 3G)adımından hazırlanan seyreltilmiş bazal membran matris protein çözeltisinin 200 μL'sini dikkatlice üzerine dağıtın. Geceyi kuvözde bırakın (37 °C).
NOT: Şablon-hidrojel teması sıkı olduğunda ve bazal membran matris protein çözeltisi konsantrasyonu optimal olduğunda, bazal membran matris protein çözeltisi tecrit edilecek ve şablonun üzerinde kalacaktır (Şekil 3H). Enfazla kuluçka süresi azaltılabilir. Teorik olarak, 30 dk-2 saat e indirilebilir. - Ertesi gün, hidrojelleri 6 kuyu plakasına aktarın ve tamamen PBS'ye batırın.
NOT: Hidrojelin kalıbın yırtılma ve yapışmasını önlemek için kapağın üzerine PBS daldırma ile şablonun soyulması önerilir. - Hidrojeli yırtmadan otoklavcı kullanarak şablonu dikkatlice çıkarın. DMEM ile iyi askıya alın, desenli hidrojelleri kuvöze geri verin ve herhangi bir kontaminasyon testi için bir gecede bırakın.
- Medya açık kalırsa, hidrojeller hücre kaplaması için kullanılmaya hazırdır. İlgili uygulamalar için hücrelerin yapışmasını sağlamak için hücre kaplama yoğunluğu nu ve kuluçka süresini optimize edin.
NOT: HiPSC-CM'lerin tek hücreli deseni için, tohum ve tüp gece. Tohumlama için aşağıdaki hücre numaraları önerilir: 30.000, 60.000 ve 90.000 hücre/kuyu. Çok fazla hücre tohumlama desen başına birden fazla hücre yol açar. Hücre tohumlamadan önce tek olmayan hücreleri gerinecek bir hücre süzgeci önerilir. - Ertesi gün, hücre ekini ve yayılmasını gözlemleyin ve ayrılmış hücrelerden kurtulmak için ortamı değiştirin.
9. Kullanılan şablonların temizlenmesi
- Kullanılan şablonlarda artık matris proteinlerini çıkarmak için, 37 °C'de 10 dakika boyunca enzim çözeltisindeki(Malzeme Tablosu)şablonları batırın.
NOT: Enzim kullanılan matris proteinlere bağlı olarak seçilmelidir. Kollajen açısından zengin matris protein çözeltisi için, kollajenaz kullanın. Enzim çözeltisinde 10-15 dk ultrasonication da tavsiye edilir. - Çözeltiyi aspire edin ve %10 çamaşır suyu ile yenilenin. Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka.
- PBS ile 3x durula.
- Kullanıma kadar 4 °C'de %70 etanolde saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir dizi kare veya dikdörtgen içeren şablonların imalatı gösterilmiştir (Şekil 4A). Bu protokolü takiben, desenli matris protein adaları (Şekil 4B ve Şekil 5A) ve hücreler (Şekil 4C)elde ettik. Suboptimal matris protein çözeltisi konsantrasyonu suboptimal desenleme yol açtı(Şekil 5B). Şablonun ön tarafını kullanmak çok önemlidir. Şablonun arka yüzü kullanılırsa, matris protein adalarının büyüklüğü lazer kesim in yönüne bağlı olarak artar (Şekil 6A,B). Dikdörtgen desenlerin genişliği önemli ölçüde değişmese de(Şekil 6C),şablonun arka yüzü kullanılarak yükseklik önemli ölçüde artarak amaçlanan enboy oranında bir azalmaya yol açtı (Şekil 6D,E). Silikon elastomer substratlarına şablon bazlı desenleme uyguladık (Şekil 7). Silikon elastomer substratlar üzerindeki desenli kardiyomiyositler düşük büyütmede kardiyak troponin T'nin immünositokimyası ile(Şekil 7A)ve yüksek büyütmede sarkoerik protein α-aktinin(Şekil 7B)görselleştirildi. Şablon bazlı desenleme de farklı sertlikleri ile hidrojeller üzerinde desen iki kardiyomiyosit yan yana uygulanabilir. Bir gösteri olarak, fizyolojik olarak ilgili sertlik(Şekil 8A)ve patolojik olarak ilgili sertlik(Şekil 8B)üzerinde kardiyomiyosit desenleme gösterir.
Şekil 1: Üç altın standart mikro desenleme stratejilerinin şeması. (A) Fotolitografi. (B) Mikrotemas baskı. (C) Mikroakışkan desenleme. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Şablon tasarımının iş akışı. (A) Şablonun bilgisayar destekli tasarımı. (B) Lazer kesimli poliimid şablonunun temsili bir fotoğrafı. (C) Bir şablonun temsili mikroskobik görüntüsü. Sarı alan poliimid şablonu temsil ederken, açık mavi alan lazer kesim delikbir dizi temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Hidrojel üretim adımlarının fotoğrafları. (A) Poliakrilamid hidrojel imalatı iki kapak arasında öncül çözelti sandviç tarafından. (B) UV tezgah lambası altında poliakrilamid hidrojellerin UV foto-crosslinking. UV lambası kullanıcı koruması için alüminyum folyo ile kaplıdır. (C) Foto-crosslinked hydrogel bir tarafta bir coverslip çıkarılarak alınır. (D) Hidrojel yapı, ECM protein incorporation için hidrojel değiştirmek için sulfo-SANPAH çözeltisi ile temas halindedir. UV aktivasyonundan önce sulfo-SANPAH turuncudur. (E) UV aktivasyonundan sonra sulfo-SANPAH kahverengiye döner ve hidrojel yüzeyine aktif hale getirildiğini gösterir. (F) Fazla suyu gidermek için hidrojeli steril tiftiksiz mendillerle dıktan sonra, şablon hidrojelin üzerine yerleştirilir. (G) Bazal membran matris protein çözeltisi şablon-hidrojel yapılar üzerine pipetlenir. (H) Şablon-hidrojel teması başarıyla sıkıysa, bodrum membran matris protein çözeltisi üstte kalır ve sızmaz. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Farklı dikdörtgen şekilli bazal membran matris proteinleri ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositlerin (hiPSC-CMs) mikro desenlemesi. (A) Farklı en boy oranlarına sahip lazer kesim dikdörtgenler içeren şablonların mikroskobik görüntüleri (1:1, 4:1, 11:1). (B) Hidrojel yüzeylerde immünosüllenmiş matriks protein adalarının temsili görüntüleri. (C) HiPSC-CM'lerin çekirdekler (camgöbeği) ve kardiyak troponin T (macenta) için boyanmış temsili görüntüleri. Ölçek çubuğu = B ve C panelleri için 20 m. Lütfen bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 5: ECM protein konsantrasyonu uygun desenlerin oluşmasında önemli bir rol oynar. (A) Tek desenlerde bodrum membran matris proteinlerinin çok homojen dağılımı ile optimal konsantrasyonun temsili görüntüsü. (B) Düşük konsantrasyonnedeniyle suboptimal matris protein desenleri, hangi desenler dışında matris protein sızıntısı ve buğday tohumu agglutinin boyama tarafından belirlenen desenler içinde düşük miktarda matris protein. Ölçek çubuğu = A ve B panelleri için 20 m. Lütfen bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için buraya tıklayın.
Şekil 6: Şablon yan etkisi. (A) Şablonun ön tarafı kullanıldığında bazal membran matris protein desenleri kullanılır. (B) Şablonun arka tarafı kullanıldığında bazal membran matris protein desenleri kullanılır. (C) genişliğinin nicelleştirilmesi, (D) yüksekliği, (E) dikdörtgen bazal membran matris protein adalarının en boy oranı. Grafik ortalama ± SEM çizilir. İstatistikler eşleşmemiş öğrenci T testi ile hesaplanır. n.s. = önemli değil. = p < 0.0001. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Silikon elastomer substrat üzerinde şablon bazlı desenleme. (A) Silikon elastomer substratlar üzerinde tek hücreli desenli kardiyomiyosittemsili bir görüntü kardiyak marker ile boyanmış, kardiyak troponin T (cTnT), düşük büyütme. Ölçek çubuğu = 300 μm. (B) Yüksek büyütmede sarkoerik protein α-aktinin ile boyanmış tek hücreli kardiyomiyosit. Ölçek çubuğu = 10 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Farklı sertliklerde poliakrilamid hidrojellerde hiPSC-CM'lerin mikrodesenlemesi. (A) 10 kPa, (B) 60 kPa. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Adım | Sorun gözlendi | Olası neden | Çözüm |
| 1.1 | Desen boyutu beklenenden daha büyük | Şablon çevrilmiş | Şablonların ön ve arka tarafını belirtmek için şablon tasarımına bir chiral harfi/şekli ekleme |
| 8.1 | Şablonları soyulurken hidrojel kırıkları | Hydrogel şablonlara yapışır | Şablonların temizlenmesi |
| Şablon koymadan önce hidrojeli çok fazla kurutmayın | |||
| 8.13 | Hücre eki suboptimal | Bozulmuş sulfo-SANPAH | Yeni sulfo-SANPAH kullanın |
| Verimsiz protein birleşme | Yeni ECM protein çözeltisi hazırlayın | ||
| Eski ECM protein çözeltisi | |||
| 8.13 | Hücre deseni suboptimal olduğunu | Bazal membran matris protein çözeltisi üzerine dökülür | Hidrojel üzerinde bazal membran matris protein çözeltisi dağılımını incelemek için florofor konjuge anti fare IgG antikor veya Buğday mikrop agglutinine kullanarak immünboyama gerçekleştirin |
| 8.13 | Bir yuvada birden fazla hücre | Tek hücreli süspansiyonda değil | Tek hücreli süspansiyon için 40−70 μm hücresüz |
| Tohumlama yoğunluğu uygun değil | Tohumlama yoğunluğunu mL başına 30 k ile 90 k arasında optimize edin |
Tablo 1: Sorun giderme yönergeleri. Sık karşılaşılan sorunlar, olası nedenler ve olası çözümler tartışılır.
Ek Dosyalar. Dosyaları indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yapışık hücrelerin etkili desenlemesini sağlayan litografiiçermeyen şablon bazlı mikro desenleme yöntemini tanımlıyoruz. Bu protokolde, fizyolojik veya patolojik olarak ilgili doku sertlikleri veya silikon bazlı elastomer substratları ile poliakrilamid hidrojeller üzerinde mikrodesenli bazal membran matris protein adaları mikrodesenleme tarafından farklı uzunluk-genişlik oranlarında hiPSC-CMs desenleme göstermektedir. Bu yöntem, fotolitografi ve mikrofabrikasyon teknikleri konusunda çok az geçmişe sahip olanlar da dahil olmak üzere, herhangi bir araştırmacı için nispeten basit ve son derece erişilebilir. Açıklanan yöntem, yumuşak litografi kullanarak pul üretme ve proteinlerin pul kalıplarından mikrotemas baskı tekniğinde yer alan ilgi nin substratlarına aktarılmasıyla ilgili önemli zorlukları aşmaktadır. Bu protokol 1) maliyet-etkin bir şekilde ilgi alanı ve şekli ile özel olarak tasarlanmış şablonlar oluşturmak için bir iş akışı sağlar; 2) ilgi sertliği ile bir hidrojel substrat imal; ve 3) hidrojel substrat üzerinde verimli Bir ECM proteinleri eşleşin.
Geleneksel yumuşak litografi yöntemleri silikon bazlı malzemeler ve cam kapakları13,,14gibi farklı malzemelerin yüzeylerüzerinde üçgen ler ve yıldızlar da dahil olmak üzere ECM proteinlerin çeşitli şekillerde desenleme için kullanılmıştır. Bu çalışmada sadece kardiyomiyositlerin fizyolojik ve patolojik olarak ilgili şekli göz önüne alındığında dikdörtgen desenler gösterilmiştir. Şeklin en küçük özelliği çözünürlüğün ötesine geçmediği sürece diğer karmaşık şekillerin şablon tabanlı desenlenmesinin işe yadabileceğine inanıyoruz (~10 μm). Substrat malzemeleri ile ilgili olarak, şablon bazlı desenlemenin hidrojel üzerine uygulanabileceğini gösterilmektedir (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6 ve Şekil 8) veya silikon bazlı elastomer substrat (Şekil 7). Sunulan yöntem, doku kültürü plastikleri ve cam kapaklar gibi poliimid-malzemelere en az yapışkanlık la substratlarda çalışmaz, çünkü poliimid bazlı şablon ve bu yüzeyler arasındaki sıkı sızdırmazlık sağlanamamaktadır. Sıkı sızdırmazlık sağlamak için daha fazla yüzey modifikasyonu gereklidir. Son olarak, bu yöntemin farklı sertliklere sahip hidrojellerde (yani 10 kPa, 60 kPa) güvenilir hücre çifti desenleri üretmek için kullanılabileceğini gösteriyoruz (Şekil 8).
Protokolde en kritik adım ECM protein konsantrasyonunun optimizasyonudur (protokol bölüm 6). Bu adımın amacı, protein çözeltisini şablonun deliklerinden sızmak için yeterli olan viskoz ecm proteininin optimal konsantrasyonunu bulmaktır, ancak çok konsantre olmamak, jelleşmeyi önlemektir(Şekil 5). Bu şablon bazlı yöntem ECM proteininin türünü kısıtlamaz. Viskoz ECM protein çözeltisi şablonun üstünde kalma olasılığı daha yüksek olmasına rağmen, daha az viskoz protein de kullanılabilir. Bir gereklilik şablon ve PA hidrojel yüzeyleri göreceli bir kararlı hidrofobik arayüz oluşturmak için yeterince kuru olduğundan emin olmaktır. Bu gösteride, bazal membran matriks proteinviskoz ve hiPSC-CMs kültür için uygun olduğu için kullanılmıştır. Ancak, diğer ECM proteinleri büyük olasılıkla kullanılabilir (örneğin, fibronectin, jelatin, kollajen, laminin).
Verilen her uygulama için ECM protein çözeltisinin optimizasyonuna ek olarak, şablon ve hidrojel yüzeyi arasında uygun bir sızdırmazlık oluşturmak, ECM proteini ile kesin bir örüntü elde etmek için çok önemlidir. Aşırı kuruma hidrojel inrültüneden yol açabilir çünkü, şablon overdry değil esastır. Bu adımlar (örneğin, hidrojel üzerine şablon yerleştirerek yanı sıra yavaşça daha sonra kapalı pealing) bazı uygulama gerektirir. Verilen her durum için en uygun kullanım prosedürünün oluşturulması da hidrojel in şablonlara yapışmasını önleyecektir. Bu optimizasyon ile, lazer kesim kusurları nedeniyle submicron ölçekli lazer yanıkları önemli ölçüde hidrojel hasarı açısından tekniği etkilemez.
Bir diğer önemli adım da, şablonu hidrojel substratına yerleştirirken şablonun ön kısmını kullanmaktır. Her iki tarafın kullanımının muhtemelen lazer kesimine bağlı olarak substrat üzerinde bir etkisi olduğunu bulduk (Şekil 6). Belirli bir boyut veya şekil hücreleri ilk kez desenleme bir öneri bir optimizasyon şablonu oluşturmaktır. Şablon tasarımı özellikleri, son desenli hücre boyutlarıyla eşleşmez. Özellik boyutlarının degradesini içeren bir optimizasyon şablonu oluşturmanızı öneririz. Sorun giderme de yardımcı olmak için olası sorunları ve olası çözümleri listeleyen bir tablo hazırladık (Tablo 1).
Bu el yazmasında belirtilen aynı mikroüretim şirketinin kullanılması na gerek yoktur. Şablonun hassas oluşumunun anahtarları lazerin ışın çapı ve şablon filminin kalınlığıdır, bizim durumumuzda poliimid (50 μm). Uygun bir lazerle donatılmış bir lazer laboratuvarının şablonu birkaç adımla üretebileceğine inanıyoruz, lazer yoğunluğunu, hizalamayı ve diğer değişkenleri optimize edin. Biz sadece bir şirket ile çalışmış olmasına rağmen, hassas lazer kesim gerçekleştirmek birçok mevcut şirketler vardır.
Bu yöntemiçin bir sınırlama çözümdür. Fotolitografi nanoölçekli çözünürlük elde ederken, şablon tabanlı desenleme çözünürlüğü, poliimid şablonlarının lazer kesim çözünürlüğü ile sınırlıdır ve bu çözünürlüğü genellikle birkaç mikron (~10 μm) ölçeğindedir. Bununla birlikte, ortalama hücre boyutunun 10 μm'nin üzerinde olduğu göz önüne alındığında, çözünürlük genellikle herhangi bir tek hücre deseni için geçerlidir.
Özetle, bu yöntem hücre-ECM etkileşimlerini incelemek, hücre yapısı-işlev korelasyonunu incelemek ve diğer birçok uygulama için çok yönlü platformlar sağlar. Bu protokolün birçok biyomedikal araştırmacıya fayda sağlayacağına ve tek hücreli çalışmaları kolaylaştıracağına inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Stanford Çocuk Sağlığı Araştırma Enstitüsü (CHRI) ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden (1F32HL142205-01) S.L.'ye doktora sonrası burs ile desteklenmiştir. NIH Direktör Öncü Ödülü Ofisi (LM012179-03), Amerikan Kalp Derneği Araştırmacı Ödülü (17EIA33410923), Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü, Hoffmann ve Schroepfer Vakfı ve Stanford Kardiyovasküler Tıp Bölümü, S.M.W. Tıp Bölümü , Ulusal Sağlık Enstitüsü'nden ödüller (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) ve Tütünle ilgili Hastalık Araştırma Programı (TRDRP 27IR-0012) J.C.W,Amerikan Kalp Derneği (AHA) Doktora Sonrası Burs Ödülü (18POST34030106) H.Y ve Henbergergstgst bursu.T.T.'ye. Stanford Nörobilim Mikroskopi Servisi'nden Dr. Andrew Olsen'e mikrodesenli hiPSC-CM konfokal görüntüleme desteği için teşekkür ederiz. H.Y.'ye ilk şablon tasarımı, imalatı, poliakrilamid hidrojel kaplı kapak üzerinde iPSC-CM'nin tek hücreli mikrodesenlenmesi ve tek hücreli mikrodesenli iPSC-CM'lerin sarcomere yapısının ön konfokal görüntülemesi için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
