Summary
פרוטוקול זה מציג שיטת המיקרו-ליתוגרפיה ללא הגבלה, פשוטה ונגישה לבעלי רקע ביוהנדסי מוגבל. שיטה זו משתמשת בסטנסילים מותאמים אישית לחתוך לייזר כדי מיקרו מטריצות חלבונים מטריצה בצורה של עניין עבור מודלדירוג תאים מורפולוגיות. ההליך עבור מיקרופנינג הוא הפגין באמצעות מושרה המושרה תא גזע המופק הקרדיוציטים.
Abstract
טכניקות מיקרופרינינג שימשו באופן נרחב בביולוגיה התא כדי ללמוד את ההשפעות של שליטה בצורה וגודל התא על קביעת הגורל התא ברזולוציה תא בודד. העדכנית ביותר של המדינה-של-art בודד טכניקות מיקרוגרפיה כרוכים לדפוס רך מיקרו מגע הדפסה, שהיא טכנולוגיה רבת עוצמה, אבל דורש מיומנויות הנדסה מוסמך ותמיכה מתקן מסוים במיקרו בייצור. מגבלות אלה דורשות טכניקה נגישה יותר. כאן, אנו מתארים שיטת ליתוגרפיה פשוטה וחופשית: שיטה מבוססת-סטנסיל של תא יחיד. אנו מספקים הליכים צעד-אחר-צעד, כולל עיצוב סטנסיל, ייצור פוליאקרילאמיד הידרוג'ל, התאגדות חלבון מבוססת-סטנסיל, ציפוי תאים ותרבות. שיטה פשוטה זו יכולה לשמש לתבנית מערך של רבים כמו 2,000 תאים. אנו מדגימים את הפנינג של הקרדיוציטים שמקורם באחד בתאי גזע המושרה האנושית pluripotent (היפנוטית) עם צורות תא ברורים, מ 1:1 מרובע כדי 7:1 מלבן מבוגר בצורת הקרדיוציט. זה תא בודד מבוסס סטנסיל מהתכנות הוא ללא ליתוגרפיה, טכנית חסון, נוח, זול, והכי חשוב נגיש לאלה עם רקע ביולוגי מוגבל.
Introduction
הופעתו של hiPSCs ואת הפיתוח הבאים של פרוטוקולים עבור הבידול שלהם בבימויו של סוגי תאים שונים הפכו את זה אפשרי ללמוד פיתוח ומחלות ברמה מולקולרית ומטופל ספציפי, במיוחד באמצעות החולה נגזר ipsc קרדיוציטים (ipsc-CMs) לדגם cardiomyopathies1,2. עם זאת, מגבלה מרכזית לחקר התפתחות ופיזיולוגיה באמצעות מערכת iPSC ואחרים במודלים חוץ גופית היא העדר מיקרוסביבה מובנית. באתרו, תאים חשופים האילוצים של מטריצה החילוץ (ECM), כמו גם תאים שכנים. ההרכב הביוכימי המסוים והקשיחות של מיקרוסביבות אלה מכתיבים את התפלגות המרחב של תאים, כמו גם גורמים זמינים לעוסקים הדבקה תא. זה, בתורו, משפיע תאיים מסלולים איתות, ביטוי גנים, ונחישות הגורל התא. לדוגמה, iPSC-CM מיקרותבנית בצורת מבוגר כמו מוט יש יכולת כושר טובה יותר באופן משמעותי, זרימת סידן, ארגון מיטוכונדריאלי, אלקטרופיזיולוגיה, ו-כדורית רוחבי היווצרות3. לפיכך, תכונות המיקרו-סביבה הן בלתי-מהותי בוויסות התפקודים הסלולאריים.
טכניקות המיקרו-מיקרוגרפיה הקודמות הסתמכות בכבדות על פוטוליטוגרפיה (איור 1A). בטכניקה זו, שכבה של פולימר לאור, או photoresist, הוא סובב על מצע שטוח מהפתרון כדי ליצור סרט דק על 1 יקרומטר עבה. הבא, אולטרה סגול (UV) האור מוחל על photoresist באמצעות מסכה המכילה את התבנית הרצויה. חשיפה לאולטרה סגול (UV) אור כימית משנה את הphotoresist על ידי שינוי מסיסות שלה בפתרון המפתחים בהתאמה שלה, העברת התבנית הרצויה מן המסכה על מצע. שיטות רבות למיקרו-מיקרוגרפיה משלבות פוטוליטוגרפיה, כפי שהיא משלבת ננו כדי לשלוט ברמת מיקרומטר על העיצוב של דפוסי התא. עם זאת, ספינינג של photoresist הוא רגיש מאוד זיהומים, כי חלקיקי האבק הקטן ביותר יהיה לשבש את התפשטות הפתרון לתוך סרט דק. הפוטוליתוגרפיה חייב להתבצע במתקנים לא מזוהמים, אשר יקרים לשמור ודורשים מומחיות מיוחדת כדי לנצל. בנוסף, הכימיקלים המשמשים בפוטוגרפיה הם לעתים קרובות רעילים לתאים והוא יכול לbiomolecules חשוב. לפיכך, פוטוליתוגרפיה מהווה מכשולים משמעותיים לייצור מיקרודפוסים עבור יישומים ביולוגיים נוחים.
ב 1994, Whitesides ועמיתים4 התגברו על כמה אתגרים הקשורים בפוטוגרפיה על ידי החלוצי אוסף של טכניקות שנקרא ליתוגרפיה רכה. ב ליתוגרפיה רך, משטח מובנה שנעשה עם polydiמתיל siloxane (PDMS), חומר שקוף, כמו גומי, משמש להפקת דפוס של חלבונים ECM4. טכניקות ליטוגרפיה רכות נפוצות כוללות הדפסה במיקרומגע והדפס מיקרופלואידיג. בדפוס microcontact, כיום שיטת הליתוגרפיה הרכה הפופולרית ביותר, חותמת PDMS מצופה בחלבונים של ECM מעבירה את החומר על פני השטח באזורים שאליהם נוצר החותם (איור 1B). In מיקרופלואידיג, מיקרומבנים מתוכננים על פני משטח PDMS כגון, כאשר החותמת היא לחצה על מצע, רשת של מיקרוערוצים, שדרכו ניתן להעביר נוזלים לאזורים הרצויים, נוצר (איור 1C)5. ליתוגרפיה רכה מציעה מספר יתרונות על פני פוטוגרפיה. לאחר וופל מאסטר הוא מיקרופוברק, בולים PDMS ניתן בקלות לשכפל ללא תעסוקה נוספת של מתקני חדר נקי. בנוסף, העדר ממיסים אורגניים בתהליך של ליתוגרפיה רכה מאפשר ניצול של חומרים פולימריים כגון פוליסטירן, בדרך כלל בשימוש בתרבות התא. לבסוף, מיקרוגרף שימוש בשיטות ליטוגרפיה רכות אינו מוגבל למשטחים שטוחים. לכן, ליתוגרפיה רכה מגבירה את הנגישות והפונקציונליות של ייצור מיקרותבניות על גבי פוטוליתוגרפיה6. עם זאת, ליתוגרפיה רכה יש חסרונות משמעותיים. לדוגמה, שלב התחריט ההתחלתי, שימוש בפוטוגרפיה, עדיין נדרש למיקרו-הרכיבו את החותמת. בנוסף, מיקרופילנינג באמצעות חותמת PDMS כפוף וריאציות באיכות של העברת חלבון על מצע6. הימנעות מסתירות אלה דורשת אופטימיזציה ועקביות בלחץ המוחל על החותמת של PDMS במהלך העברת החלבון, הדפורמציה אחרת ועיוות של גודל התכונה של תבניות PDMS יכול להתרחש6. יש גם דאגה עיקרית של השימוש שוב ושוב PDMS בשל ספיגת מולקולה קטנה7.
כדי למנוע באמצעות פוטוגרפיה רך ו-PDMS בולים, אנו מתארים מבוססי סטנסיל, ליתוגרפיה בודדת תא השיטה מיקרודפוס הגוברת על רבים של המכשולים הקשורים בפוטוגרפיה וליתוגרפיה רך. בשיטה זו, משמש הידרואקרילאמיד בתור מצע עבור התאגדות חלבון ECM מבוסס סטנסיל, המאפשר ציפוי סלקטיבי של היפנוסק-CMs יחיד. טכניקה זו מתאימה מאוד לחומרים פולימריים המשמשים בתנאי תרבות תאים קלאסיים. יתר על כן, עם ניקוי ותחזוקה נאותים, הסטנסילים הם הניתנים לשימוש חוזר ועמידים בפני השפלה וספיגת החלבון במהלך תהליך המיקרוייצור. לבסוף, תהליך העיבוד הוא מבחינה טכנית יציב, זול, להתאמה אישית, ונגיש לאלה ללא כישורים bioהנדסאים מיוחדים. זו טכניקה מיקרומניפולציה מבוססי סטנסיל כבר מנוצל באופן כללי ב שלנו פרסומים האחרונים מידול מגוונת cardiomyopathies8,9,10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הייצור של שלילי דפוס polyimide מבוססי סטנסילים
- יצירת תבנית (איור 2 א) בתבנית. dxf באמצעות תוכנת עיצוב בעזרת מחשב (לדוגמה, AutoCAD, Solidworks, Onshape, Adobe Illustrator).
- צור עיגול (קוטר = 22 מ"מ) כדי להתוות את הגבול של הסטנסיל.
- צייר צורה מלאת מוצק או את התבנית הרצויה.
- כלול מכתב כיראאל (g., R) כדי לסמן את הצד הקדמי של הסטנסילים.
הערה: כדוגמה, מערך של ריבועים ומלבנים נוצר לתבנית iPSC-CMs ברמות תא יחיד ותא זוג תאים. קבצי העיצוב זמינים (ראה קבצים משלימים). מגבלת הרזולוציה של המיקרו-ייצור היא ~ 10 μm.
- לשלוח את העיצוב לחברה מיקרוייצור לייזר לגזור פוליאימיד הסרט והרכיבו סטנסילים (איור 2b,C).
2. הכנת משפחת סולפו-סאח
הערה: הפרוטוקול משתנה מפישר ואח '.
- השתמש עמיד לחות קרטון לדוגמה תיבת אחסון (g., 100 ובכן, 10 x 10 רווחים עבור צינורות צנטריפוגה, מידות: 13.4 ס"מ x 13.4 ס"מ x 5.1 ס"מ). תווית זה "שם/תאריך/sulfo-SANPAH 40 μL/מחדש עם 1,200 μL של PBS".
- תווית 50 מיקרוצנטריפוגה צינורות (פוליפרופילן, 1.5 mL) עם ' s ' על המכסה.
- לקחת 4 מ ל של anסולפוקסיד, יבש במיוחד דימתיל תיל (dmso) וסטרילי לסנן את הפתרון באמצעות יחידת מסנן קרום (גודל הנקבוביות = 0.22 μm) לתוך צינור מעוקר 15 מ"ל.
- הכן אמבט חנקן נוזלי והתכסה במכסה כדי למזער את האידוי של החנקן הנוזלי.
- לפזר 50 מ"ג של sulfo-SANPAH תוך 2 מ ל של DMSO מסוננים.
- מערבולת היטב כדי לפזר לחלוטין את sulfo-SANPAH ב DMSO.
- הפץ 40 μL של הפתרון sulfo-SANPAH לצינורות 1.5 mL סטרילית.
- להעביר את הצינורות לתוך הקופסה.
- פלאש-להקפיא את צינורות בחנקן נוזלי עבור 5 דקות.
- אחסן את הליאביטים ב-80 ° c.
הערה: ניתן להשתמש ב-ali, עד 6 חודשים ללא יעילות מופחתת. מלאי הריכוז sulfo-SANPAH הוא 25 מ"ג/mL או 50.77 מ"מ.
3. עיקור כלים
- אוטוקלב שני מלקחיים, 24 שמיכות זכוכית (22 x 22 מ"מ, מס ' 1 או No. 1.5), להב תער אחד, ושלושה מגבונים סופג נטול סיבים.
הערה: כדי להפוך 12 בנייה של הידרוג'ל, יש צורך בכיסויים של 24 שמיכות זכוכית. צריך להיות שני. שמיכות לכל מבנה מומלץ להכין כמה כיסוי רזרבי. - מקום שני חתיכות של סרט פרפין (4 x 4 אינץ ') בתיבת פלסטיק עמידים בפני אתנול (g., a 1,000 μL בתיבת טיפ) ולעקר אותם טריים 70% אתנול לפחות 15 דקות.
4. הכנת תמיסת פוליאקרילאמיד הידרוג'ל
הערה: הפרוטוקול משתנה מ-Lee et al.12.
- התמוססות 125 מ ג של עמינח מתיונין (AEM) ב 36.25 מ ל של מים מאוהים בצינור שפופרת פוליפרופילן משנת 50 mL על ידי vortexing.
- כדי להכין 50 mL של 10 kPa פוליאקרילאמיד הפתרון הקודמי (8 – 0.15 – 15 מ"מ), מערבבים 10 מ ל של 40% אקרילאמיד פתרון, 3.75 mL של 2% bis-אקרילאמיד פתרון, ו36.25 mL של הפתרון AEM הכין בשלב 4.1 בתוך שפופרת חדש של הפוליפרופילן משנת-mL.
הערה: הריכוז הסופי של הפתרון המקודח הוא 8% אקרילאמיד, 0.15% bis-אקרילאמיד, ו-15 מ"מ AEM, שנמדד כ-10 הנוקשות של kPa באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. על פי בקשות הרקמה של עניין, הנוקשות של ההידרוג'ל ניתן לשנות על ידי שינוי היחס של 40% אקרילי לפתרון 2% bis-אקרילאמיד. לדוגמה, 8% אקרילאמיד – 0.08% bis-אקרילאמיד מניב 3 kPa הידרולים; 8% אקרילאמיד – 0.48% bis-אקרילאמיד מניב מ38 kPa הידרולים; 8% אקרילאמיד – 0.48% bis-אקרילאמיד מניב פתרונות 60 kPa. מומלץ לאשר את הנוקשות של הידרוג'לים העשויים מהפתרונות הקודמים ביחס משתנה.
5. הכנת פתרון ליוזם התמונה
- עבור 1 mL של 5% הפתרון ליוזם התמונה, הראשון לפזר 50 מ"ג של 2-הידרוxy-4-(2-הידרוידטורוקסי) -2-methylpropiophenone אבקה ב 700 μL של 100% אתנול בתוך שפופרת משנת פוליפרופילן עם 1.5 מכסה של mL.
הערה: 2-הידרוxy-4-(2-הידרוקסיטורוקסי) -2-methylpropiophenone אינו מסיס במים. הקפד לפזר במלואו את האבקה באתנול על ידי vortexing. - לאחר המסת לחלוטין 2-הידרוxy-4-(2-הידרוקסיטורוקסי) -2-methylpropiophenone באתנול על ידי vortexing, להוסיף 300 μL של מלוחים באגירה פוספט (PBS) עבור נפח סופי של 1 מ ל.
הערה: הריכוז הסופי של 2-הידרוxy-4-(2-הידרוקסרוקסי) -2-methylpropiophenone פתרון הוא 5%. הפתרון הטוב ביותר לצילום מאתחל 5% הוא 4 שבועות ב -4 ° c.
6. הכנת מטריצת המרתף ממברנה פתרון חלבון
הערה: מטריצת קרום המרתף (טבלת חומרים) היא חומר רגיש לטמפרטורה. הקפידו לעבוד על קרח עם טיפים וצינורות מצוננים, כמו גם פתרונות קר-קרח. מלאי חדש של מטריצת קרום המרתף יש להפשיר לאט על הקרח ב -4 ° c בלילה.
- הכינו 200 μL של תמיסת מטריקס ממברנה של מטריצת חלבון לכל מבנה הידרוג'ל. עבור 12 בנייה, 2.4 מ ל של המרתף ממברנה הפתרון חלבון מטריצה נדרשים. הכינו 10% פתרון נוסף (לדוגמה, 2.6 mL).
- עבור כל אצווה חדשה/הרבה של מטריקס ממברנה פתרון חלבון מטריצה, למטב את יחס הדילול. בפעם הראשונה, לבדוק את יחסי הדילול של 1:10, 1:20, 1:40 כדי למצוא את יחס הדילול התשואות את האיכויות הטובות ביותר לתא המ,.
הערה: אם פתרון החלבון של מטריצת הממברנה במרתף הוא מוגזם, הוא יצור ג'ל על גבי הסטנסיל, וסביר יותר שהוא יקלף בעת הסרת הסטנסיל. אם פתרון החלבון הוא נוזלי מדי, הוא חודר דרך החורים בתבנית של הסטנסילים, אשר יגרמו לדפוס באיכות ירודה. - לדלל מרתף ממברנה קרום חלבון מטריצה פתרון מלאי בקרח עם הקרח קר מאוד בינוני של הנשר/מזינים תערובת F-12 (DMEM/F12) מדיה או 1x PBS ליחס דילול ממוטב מעל. לדוגמה, לדלל 120 μL של פתרון המניה ב 2.4 mL של DMEM/F12 מדיה (1:20) ולשמור על קרח לשימוש מאוחר יותר.
7. ייצור הידרוג'ל
- מניחים מנורת ספסל UV (365 nm, 4 mW/cm2) במכסה בטיחות ביולוגית.
- מניחים את הסרטים פרפין מעוקר משלב 3.2 ויבש לחלוטין בתנאים סטרילי. אם הסרטים הפרפין אינם יבשים לחלוטין, השתמשו במערכת שאיפה ואקום כדי להסיר כל נוזל שרידי. במקום שישה שמיכות אוטוקלשים משלב 3.1 על כל סרט פרפין באמצעות מלקחיים אוטוקלבד.
- 50 הכינו את הפתרון המקודעי UV-crosslinkable על ידי דילול 5% הפתרון פוטומאתחל (שלב 5.2) עם הפתרון הקודמי polyאקרילי (שלב 4.2) בצינור הצנטריפוגה של פוליפרופילן. עבור 5 מ ל של UV-crossלייייייייייייייייייייאת הפתרון המקודמי, להוסיף 50 μl של 5% מאתחל הפתרון ל 5 מ ל של הפתרון הקודמי אלקטרופורזה.
- לסנן את הפתרון הקודמן משלב 7.3 באמצעות יחידת מסנן 50 mL עם גודל הנקבובית 0.22 יקרומטר עבור עיקור.
הערה: תמיד להכין פתרון מקודמן טרי. - לחלק 200 μL של הפתרון הקודמי polyאקרילי משלב 7.4 על כל 22 x 22 מ"מ מכסה זכוכית להחליק בתוך פרפין צלחת פטרי ולכסות בזהירות עם עוד 22 x 22 מ"מ שמיכות זכוכית על גבי סנדוויץ ' בין (איור 3A).
הערה: סרט הפרפין משמש כדי להימנע מלשפוך ולהגביל את התמיסה הקודמת בין הכיסויים. - מניחים את הכיסויים המכילים את צלחת פטרי משלב 7.5 מתחת למנורת הספסל UV ו פוטופוליל הידרואקרילאמיד הידרו במשך 5 דקות (איור 3B).
הערה: אם המשטח אינו לבן, ספיגת הUV של פני השטח מפחיתה את היעילות של הפוטוקרוקישור. הכיסוי של הנייר הלבן על פני השטח הלא לבן חשוב כדי למזער את אובדן עוצמת UV. כדי להגן מפני קרינת UV, לכסות את המנורה עם רדיד אלומיניום ללבוש משקפי הגנה UV. - נתק בזהירות כיסוי אחד מהשני באמצעות להב תער באמצעות מינוף פעולה (איור 3C).
הערה: ההידרוג'ל נצמד בדרך כלל לכיסויים הראשיים. שימו לב נוספת בעת ניתוק ההידרוג'ל הרך, משום שהוא עשוי להישבר. - ממלאים מאגר פוליפרופילן חד פעמי עם PBS. העבר את ההידרוג'ל הקומפוזיטורית במאגר המכיל pbs לשטוף את ההידרוג'לים ב-pbs עבור 5 דקות. לאחר השטיפה, מניחים את ההידרוג'ל בחזרה על סרט הפרפין בצלחת פטרי.
8. הקוניוגציה
- הכינו דלי קרח ומצננים ערוץ.
הערה: עבור שישה הידרוג'לים, 1,200 μL של הערוץ הקר יש צורך. - להוציא את sulfo-sanpah סדרת מחלקים (1 בקבוקון = 6 ג ' לים).
הערה: אם יש צורך, את כמות sulfo-SANPAH השתמשו ניתן לצמצם לאחר האופטימיזציה. - הוסף 1,200 μl של PBS קר לתוך בקבוקון של sulfo-sanpah סדרת מחלקים ו לערבב על ידי ליטוף למעלה ולמטה.
- לחלק 200 μL של sulfo-SANPAH על הסרט פרפין בצלחת פטרי וכיסוי עם הידרוג'ל-coverslip מרוכב עם הידרוג'ל יצירת קשר עם sulfo-SANPAHאיור 3D.
הערה: Sulfo-SANPAH הוא רגיש מאוד למים עקב הידרוליזה. הפשרה טרייה מ-80 ° c ימינה לפני השימוש. אל תעשה שימוש חוזר או הקפא שאריות מחדש. - לחשוף את ההידרוג'ל למנורה UV ב 365 ננומטר, 4 mW/cm2 עבור 5 דקות כדי להפעיל SULFO-sanpah.
הערה: לאחר החשיפה, sulfo-SANPAH ישתנה מכתום לחום (איור 3E). אם ההידרוג'ל הופך לחום, הוא מצביע על הפעלה מוצלחת של קבוצת הפניפו-סאנפה ושילוב של sulfo-SANPAH על ההידרוג'ל. המשיכו ישירות בצעדים 8.6-8.9 בתוך מקסימום של 10 דקות, מכיוון שהפעילות של sulfo-SANPAH תדחה. - לחדש מאגר פוליפרופילן חד פעמי עם PBS טרי. לאחר sulfo-SANPAH הפעלה, להעביר את ההידרוג המופעל ובמהירות לשטוף את ההידרוג במאגר PBS להסרת מאוגד sulfo-sanpah.
הערה: כביסה ארוכה עלולה לגרום ליעילות נמוכה ביותר באמצעות חלבון. - לאחר שטיפה מהירה, הניחו את שמיכות ההידרוג'ל בסרט הפרפין בצלחות פטרי והתבוננו בזהירות את ההידרוג עם מגבונים נקיים.
הערה: ה-PBS הנותרת על גבי ההידרוג'ל תגרום לדליפה של תמיסת החלבון של מטריצת המרתף דרך הסטנסיל, וייבוש נרחב יוביל לקרע של ההידרוג'ל בעת הסרת הסטנסיל בשל הדבקות גבוהה מדי לסטנסיל. - מניחים את הסטנסיל על גבי ההידרוג ומטליות עם מגבונים נטול סיבים אוטומטיים כדי להבטיח איטום הדוק בין הסטנסיל לבין ההידרוג'ל (איור 3F).
- בזהירות לוותר 200 μL של המרתף מדולל קרום חלבון מטריקס הכין משלב 6.3 (איור 3G) על גבי. השאירו את הלילה בחממה (37 ° c).
הערה: כאשר הקשר סטנסיל-הידרוג'ל הוא הדוק את המרתף קרום החלבון מטריקס הריכוז הפתרון הוא אופטימלי, המרתף ממברנה התמיסה חלבון הפתרון יהיה מהודק ולהישאר על גבי הסטנסיל (איור 3H). זמן דגירה ניתן לצמצם על ידי אופטימיזציה. תיאורטית, זה יכול להצטמצם עד 30 דקות – 2 h. - למחרת, להעביר את ההידרוג'לים לצלחת 6 היטב לטבול אותם במלואו ב-PBS.
הערה: מומלץ לקלף את הסטנסיל עם שקיעה PBS על שמיכות כדי למנוע קריעה והדבקה של הידרוג'ל לסטנסיל. - הסר בזהירות את הסטנסיל באמצעות מלקחיים אוטוקלמים מבלי לקרוע את ההידרוג'ל. להשהות היטב עם DMEM להחזיר את ההידרוג'לים בדוגמת החממה, ולהשאיר אותם לילה לבדוק כל זיהום.
- אם התקשורת נשארת ברורה, ההידרוג'לים מוכנים לשימוש לציפוי תאים. מטב את צפיפות הציפוי התא ואת זמן הדגירה כדי לאפשר הדבקה של תאים עבור יישומים המתאימים.
הערה: עבור תא בודד של היפנוסק-CMs, זרעים ו-דגירה לילה. מספרי התאים הבאים מומלצים לזריעה: 30,000, 60,000 ו-90,000 תאים/גם. זריעת תאים רבים מדי מוביל ליותר מתא אחד לכל תבנית. מסננת תאים מומלץ למתח את התאים שאינם בודדים לפני זריעת התאים. - למחרת, לראות תא מצורף ומתפשטת, ולשנות את המדיה כדי להיפטר תאים מנותקים.
9. ניקוי הסטנסילים המשמשים
- כדי להסיר חלבונים שיורית מטריקס על הסטנסילים המשמשים, להטביע את הסטנסילים בתמיסה אנזים (לוח חומרים) עבור 10 דקות ב 37 ° c.
הערה: יש לבחור את האנזים בהתאם לחלבוני המטריצה שבשימוש. לפתרון חלבון מטריצה עשיר בקולגן, השתמש בקוליגנאז. מומלץ גם לultrasonication בפתרון אנזים של 10 עד 15 דקות. - מרוב את התמיסה ומחדש. עם 10% אקונומיקה מודטה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
- לשטוף 3x עם PBS.
- אחסן ב-70% אתנול ב -4 ° צ' עד השימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ייצור של סטנסילים המכילים מערך של ריבועים או מלבנים הפגינו (איור 4A). בעקבות פרוטוקול זה, הצלחנו להשיג בדוגמת איי חלבון מטריצות (איור 4B ואיור 5a) ותאים (איור 4b). הריכוז הפתרון האופטימלי של חלבון מטריצה תת-אופטימלית (איור 5B). קריטי להשתמש בצד הקדמי של הסטנסיל. אם נעשה שימוש בצד האחורי של הסטנסיל, גודל איי החלבון של המטריצה גדל בשל הכיוון של חיתוך הלייזר (איור 6A,B). בעוד שרוחב התבניות המלבני לא השתנה באופן משמעותי (איור 6C), הגובה גדל באופן משמעותי בעת שימוש בצד האחורי של הסטנסיל, המוביל להפחתה ביחס הגובה-רוחב המיועד (איור 6c,E). התחלנו מיון מבוסס סטנסיל כדי מצעים אלסטומר סיליקון (איור 7). הקרדיוציטים בדוגמת מצעים אלסטומרים סיליקון הודמיינו על-ידי האנטי-כימיה של תסמונת לב טרופונאט ב-T בהגדלה נמוכה (איור 7A) ובחלבון sarcomeric-אקונין בהגדלה גבוהה (איור 7a). הדפוס מבוסס סטנסיל יכול להיות גם להחיל על תבנית שני הקרדיוציטים זה לצד זה על הידרוג'לים עם מחלות שונות. כהדגמה, אנו מראים את מכונת הקרדיוציט על קשיות מבחינה פיזיולוגית (איור 8 a), הנוקשות הרלוונטית באופן פתולוגי (איור 8a).
איור 1: סכמטית של שלוש אסטרטגיות מיקרוסטטיות בתקן זהב. (א) פוטוליגרפיה. (ב) מיקרומגע הדפסה. (ג) המיקרופלואידיק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: זרימת העבודה של עיצוב סטנסילים. (א) העיצוב בעזרת המחשב של הסטנסיל. (ב) תמונה ייצוגית של סטנסיל שנחתך לייזר מפולמיד. (ג) דימוי מיקרוסקופי מייצג של סטנסיל. האזור הצהוב מייצג את הסטנסיל פוליאימיד בעוד האזור הכחול האור מייצג מערך של חורים לחתוך לייזר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות של צעדי ייצור הידרוג'ל. (א) פוליאקרילאמיד, ייצור הידרוג'ל על ידי sandwiching הפתרון המקודמן בין שתי שמיכות. (ב) אולטרה-סגול צילום של הידרואקרילאמיד מתחת למנורת הספסל uv. מנורת UV מכוסה רדיד אלומיניום עבור הגנה על המשתמש. (ג) ההידרוג'ל לצילום מחובר מאוחזר על ידי ניתוק שמיכות בצד אחד. (ד) בניית הידרוג'ל היא במגע עם פתרון sulfo-sanpah לשנות את ההידרוג'ל עבור התאגדות חלבון ecm. לפני הפעלת UV, sulfo-SANPAH הוא תפוז. (ה) לאחר הפעלת UV, SULFO-sanpah הופך חום, המציין כי הוא מופעל ושולבו על פני המים הידרוג'ל. (ו) לאחר דבינג ההידרוג'ל עם מגבונים נקיים לסילוק המים העודפים, הסטנסיל מונח על ההידרוג'ל. (G) מרתף ממברנה תמיסת חלבון מטריצה מפומסת על מבנים סטנסיל הידרוג'ל. (H) אם הסטנסיל-מגע הידרוג'ל הוא הדוק בהצלחה, הפתרון המרתף ממברנה חלבון מטריצה יישאר למעלה ולא לחלחל דרך. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מיקרופנינג של מטריצות קרום המרתף חלבונים האדם המושרה pluripotent תא גזע הנגזר (היפנוטית-CMs) עם צורות מלבניות שונות. (א) תמונות מיקרוסקופיים של סטנסילים המכילים לייזר לחתוך מלבנים עם יחסי גודל שונים (1:1, 4:1, 11:1). (ב) דמויות מייצגות של איי חלבון מטריצות של מטריצה חיסונית על הידרוג'ל מצעים. (ג) דמויות מייצגות של היפראס-CMs המוכתמת לגרעינים (ציאן) וללב טרופונב T (מגנטה). סרגל בקנה מידה = 20 יקרומטר עבור לוחות B ו-C. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הריכוז בחלבון ECM ממלא תפקיד חיוני ביצירת דפוסים נאותים. (א) דמות ייצוגית של ריכוז אופטימלי עם התפלגות הומוגנית מאוד של חלבונים במרתף הממברנה של מטריצות בדפוסים היחידים. (ב) מטריצה אופטימלית דפוסי חלבון בגלל ריכוז נמוך, אשר גרם לדליפת חלבון של מטריקס מחוץ לדפוסים וכמויות נמוכות של חלבונים מטריקס בתוך הדפוסים כפי שנקבע על ידי חיידק נבט החיטה מכתים. סרגל קנה מידה = 20 יקרומטר עבור חלוניות A ו-B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תופעת לוואי של סטנסיל. (A) מרתף קרום חלבוןמטריצהתבניות כאשר הצד הקדמי של הסטנסיל נעשה שימוש. (ב) מרתפים ממברנה מטריצות חלבון תבניות כאשר הצד האחורי של הסטנסיל נעשה שימוש. בדיקת קוונפיקציה של (C) רוחב, (ד) גובה, (ה) יחס הגובה של מלבני קרום המרתף מטריקס איי החלבון. הגרף מותווה כממוצע ± SEM. סטטיסטיקה מחושבת על-ידי בדיקת T מזווג סטודנט. נ = לא משמעותי. = p < 0.0001. סרגל קנה מידה = 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: מיון מבוסס סטנסיל על מצע אלסטומר סיליקון. (א) דמות מייצגת של תא בודד בתבנית הקרדיוציטים על אלסטומר סיליקון מוכתם על ידי סמן לב, הטרופונב T (ctnt), בהגדלה נמוכה. סרגל בקנה מידה = 300 μm. (ב) נציג תא בודד בדוגמת הקרדיוגרף מוכתם על-ידי החלבון sarcomeric-אקב בהגדלה גבוהה. סרגל בקנה מידה = 10 μm. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 8: מיקרופתונים של היפנוסי-CMs על הידרו-אקרילאמיד עם שונות. (א) 10 kpa, (ב) 60 kPa. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| צעד | הבעיה נצפתה | הסיבה האפשרית | פתרון |
| 1.1 | גודל התבנית גדול מהצפוי | היפוך סטנסיל | כלול אות/צורה של כיראאל בעיצוב הסטנסיל כדי לציין את הצד הקדמי והאחורי של סטנסילים |
| 8.1 | שברי הידרוג'ל לפילינג בסטנסילים | הידרוג'ל מקלות לסטנסילים | ניקוי של סטנסילים |
| אל תייבש הידרוג'ל יותר מדי לפני הצבת סטנסילים | |||
| 8.13 | הקובץ המצורף לתא הוא אופטימלי משנה | מפורק סולפו-סאח | השתמש ב-sulfo-SANPAH חדש |
| התאגדות חלבונים לא יעילה | הכנת תמיסת חלבון ECM חדשה | ||
| תמיסת חלבון ECM ישנה | |||
| 8.13 | הקוד של התא הוא אופטימלי | מרתף ממברנה הפתרון חלבון מטריצה נשפך מעל | ביצוע מכתים חיסוני באמצעות fluorophore-מעלה אנטי העכבר נוגדן IgG או נבט החיטה ציצינין כדי לבחון את התפלגות של פתרון מרתף ממברנה חלבון מטריצות על הידרוג'ל |
| 8.13 | יותר מתא אחד בחריץ אחד | לא בהשעיה של תא אחד | השתמש 40 מסננת תא ל-70 מטרים כדי לקבל השעיה תא יחיד |
| בצפיפות הזריעה אינה אופטימלית | למטב את צפיפות הזריעה מ 30 k עד 90 k לכל mL |
טבלה 1: הנחיות לפתרון בעיות. בעיות תכופות, הסיבות האפשריות והפתרונות הפוטנציאליים נדונים.
קבצים משלימים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קבצים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים שיטת המיקרו-מיקרוגרפיה המבוססת על סטנסיל, המאפשרת בחירה יעילה של תאים חסיד. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים הפנינג של היסק-CMs ביחס אורך-לרוחב שונים על ידי מיקרופתנינג מטריקס קרום הממברנה איי החלבון על הידרואקרילאמיד הידרו עם מבחינה פיזיולוגית או פתולוגית הרלוונטיות רקמות או הסיליקון מבוססי מצעים אלסטומר. שיטה זו היא פשוטה יחסית ונגישה מאוד לכל החוקרים, כולל אלה שיש להם מעט רקע בפוטוליטוגרפיה וטכניקות מיקרוליגרפיה. השיטה המתוארת מציבה אתגרים משמעותיים הקשורים ליצירת חותמות תוך שימוש בליטוגרפיה רכים והעברת חלבונים מתבניות חותמות ועד לסובלי הריבית הכרוכה בטכניקת ההדפסה של microcontact. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה ל-1) יצירת סטנסילים מעוצבים בהתאמה אישית עם אזור וצורה של עניין באופן חסכוני; 2) הרכיבו מצע הידרוג'ל בנוקשות של עניין; ו-3) המשלים ביעילות חלבונים ECM על מצע הידרוג'ל.
שיטות ליטוגרפיה רכות מסורתיות שימשו לפרינינג צורות שונות של חלבונים ecm כולל משולשים וכוכבים על מצעים של חומרים שונים כגון חומרים מבוססי סיליקון וכיסוי זכוכית שוברי13,14. במחקר זה, אנו רק להדגים דפוסים מלבניים בהתחשב הצורה הפיזיולוגית והפתולוגית הרלוונטית של קרדיוומיציטים. אנו מאמינים בעיצוב מבוסס סטנסיל של צורות מורכבות אחרות יכול לעבוד כל עוד התכונה הקטנה ביותר של הצורה לא ללכת מעבר לרזולוציה (~ 10 μm). בנוגע לחומרים מצע, אנו מדגימים את הפרינינג מבוסס סטנסיל ניתן להחיל על הידרוג'ל (איור 2, איור 3, איור 4, איור 5, איור 6 ו- איור 8) או בסיס הסיליקון מבוסס אלסטורר (איור 7). השיטה המוצגת לא עובד על מצעים עם לכידות מינימלית כדי polyimide חומרים כגון פלסטיק תרבות רקמה ושמיכות זכוכית משום איטום צר בין הסטנסיל מבוסס polyimide ומצעים אלה לא מושגת. כדי לאפשר איטום צר, נדרש שינוי משטח נוסף. לבסוף, אנו מראים כי ניתן להשתמש בשיטה כדי לייצר בצורה מהימנה דפוסים של זוג תאים על הידרו-ג'לים עם הסטילים שונים (כלומר, 10 kPa, 60 kPa) (איור 8).
בפרוטוקול, הצעד הקריטי ביותר הוא אופטימיזציה של ריכוז חלבון ECM (פרוטוקול סעיף 6). המטרה של שלב זה היא למצוא את הריכוז האופטימלי של חלבון ECM כי הוא צמיגי מספיק כדי לעכב את פתרון החלבון לחלחל דרך החורים של הסטנסיל, אבל לא מרוכז מדי, כדי למנוע הגלציה (איור 5). שיטה מבוססת סטנסיל זו אינה מגבילה את סוג חלבון ה-ECM. למרות הפתרון של חלבון ECM הצמיג סביר יותר להישאר על החלק העליון של הסטנסיל, חלבון צמיגי פחות יכול לשמש גם. דרישה אחת היא לוודא כי משטחי הסטנסיל ו הידרוג'ל הרשות הפלשתינית יבשים מספיק כדי ליצור ממשק הידרופובי יציב יחסית. בהפגנה זו, חלבון המרתף מטריצת חלבונים שימש כי הוא צמיגי ומתאים עבור culturing היפנואס-CMs. עם זאת, חלבונים ECM אחרים עשויים לשמש (למשל, fibronectin, ג'לטין, קולגן, למינציה).
בנוסף אופטימיזציה של הפתרון חלבון ECM עבור כל יישום נתון, יצירת חותם נאות בין הסטנסיל ומשטח הידרוג'ל הוא חיוני כדי לקבל דפוס מדויק עם חלבון ECM. מכיוון שייבוש מופרז עלול לגרום לניקור ההידרוג'ל, זה חיוני לא לייבש את הסטנסיל. צעדים אלה (כלומר, הצבת הסטנסיל על ההידרוג'ל, כמו גם להדוף אותו בעדינות לאחר מכן) דורשים קצת תרגול. הקמת הליך טיפול אופטימלי עבור כל תנאי נתון גם להימנע מהצורך הידרוג'ל מקל על סטנסילים. עם זה אופטימיזציה, יקרונים יקרון לייזר כוויות בקנה מידה הנגרמת על ידי פגמים בחיתוך לייזר לא ישפיע באופן משמעותי על הטכניקה לגבי נזק הידרוג'ל.
שלב חשוב נוסף הוא להשתמש בחזית הסטנסיל בעת הצבת הסטנסיל על מצע הידרוג'ל. מצאנו כי השימוש בכל צד יש השפעה על המצע, ככל הנראה בשל חיתוך לייזר (איור 6). המלצה אחת בעת הפעלת תאים בגודל או צורה מסוימים בפעם הראשונה היא יצירת סטנסיל מיטוב. תכונות עיצוב סטנסיל אינן תואמות בהכרח לגודלי התאים הסופיים בתבנית. מומלץ ליצור סטנסיל מיטוב המכיל הדרגה של גדלים של תכונות. הכנו שולחן המפרט בעיות פוטנציאליות ופתרונות אפשריים כדי לסייע בפתרון בעיות (שולחן 1).
הוא אינו נדרש להשתמש באותה חברת מיקרוייצור שהוזכרה בכתב יד זה. המפתחות לדור מדויק של הסטנסיל הם קוטר הקרן של הלייזר ואת העובי של הסרט הסטנסיל, במקרה שלנו, פוליאימיד (50 μm). אנו מאמינים מעבדה לייזר מצויד בלייזר מתאים יכול ליצור את הסטנסיל עם כמה צעדים, אופטימיזציה של עוצמת לייזר, יישור, ומשתנים אחרים. למרות שעבדנו רק עם חברה אחת, ישנן חברות זמינות רבות המבצעות חיתוך לייזר מדויק.
הגבלה לשיטה זו היא פתרון. בעוד פוטוליטוגרפיה יכול להשיג ברזולוציה ננו בקנה מידה, מבוססי סטנסיל החלטה מוגבלת ברזולוציה של חיתוך לייזר של סטנסילים פוליאימיד אשר עד כה הוא בדרך כלל בקנה מידה של כמה מיקרון (~ 10 μm). עם זאת, בהתחשב בעובדה שגודל התא הממוצע הוא מעל 10 μm, הרזולוציה ישימה בדרך כלל לכל מעבר תא בודד.
לסיכום, שיטה זו מספקת פלטפורמות מגוונות ללימוד אינטראקציות cell-ECM, בחינת מיתאם של מבנה תאים ויישומים רבים אחרים. אנו מאמינים שפרוטוקול זה יועיל להרבה חוקרים ביו-רפואיים ויקל על מחקרי תאים בודדים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מלגת פוסט דוקטורט מאוניברסיטת סטנפורד מחקר הבריאות המכון (חג המולד) והמכון הלאומי לבריאות (1F32HL142205-01) ל-S. L, משרד NIH של פרס פיוניר של הבמאי (LM012179-03), איגוד הלב האמריקאי הוקמה פרס החוקר (17EIA33410923), המכון לרפואת לב וכלי דם של סטנפורד, קרן הופמן ושרדינגר, ואת החטיבה סטנפורד של תרופות לב וכלי דם, המחלקה לרפואה של ס. מ. W , פרסים מן המכון הלאומי לבריאות (UG3 TR002588, P01 HL141084, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) ו-טבק הקשורים מחקר תוכנית (TRDRP 27IR-0012) ל-J. C. W, איגוד הלב האמריקני (AHA) פרס פוסט דוקטורט (18POST34030106) ל H. Y, ואת המענק Hengstberger ל ט אנו מודים ד ר אנדרו אולסן שירות מיקרוסקופ מדעי המוח על התמיכה של הדמיה קונפוקלית וקד של היפנוגרף-CM. אנו מודים לח על עיצוב הסטנסיל הראשון, ייצור, תא בודד מיקרוגרף של ipsc-CM על שמיכות פוליאקרילמיד הידרוג'ל מצופה, ו הדמיה מיקוד ראשוני של המבנה סרקומר של תא יחיד מיקרותבנית ipsc-CMs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
