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Developmental Biology

सरल लिथोग्राफी-फ्री सिंगल सेल माइक्रोपैटर्निंग लेजर-कट स्टेंसिल का उपयोग कर

Published: April 3, 2020 doi: 10.3791/60888
Automatic Translation
*1,2,3, *1,2,3, *1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4,5
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University, 3Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 4Department of Medicine III, University Hospital Heidelberg, 5German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Heidelberg/Mannheim
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल एक लिथोग्राफी-मुक्त माइक्रोपैटर्निंग विधि का परिचय देता है जो सीमित बायोइंजीनियरिंग पृष्ठभूमि वाले लोगों के लिए सरल और सुलभ है। यह विधि सेल मॉर्फोलोजी को मॉड्यूल करने के लिए ब्याज के आकार में माइक्रोपैटर्न एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के लिए अनुकूलित लेजर-कट स्टेंसिल का उपयोग करती है। माइक्रोपैटर्निंग की प्रक्रिया प्रेरित प्लुरीपोटस्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके प्रदर्शित की जाती है।

Abstract

एकल सेल संकल्प पर सेल भाग्य निर्धारण पर कोशिका आकार और आकार को नियंत्रित करने के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए सेल जीव विज्ञान में माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। वर्तमान अत्याधुनिक एकल सेल माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों में सॉफ्ट लिथोग्राफी और माइक्रो-कॉन्टैक्ट प्रिंटिंग शामिल है, जो एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन इसके लिए प्रशिक्षित इंजीनियरिंग कौशल और माइक्रोफैब्रिकेशन में कुछ सुविधा समर्थन की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं के लिए अधिक सुलभ तकनीक की आवश्यकता होती है। यहां, हम एक सरल वैकल्पिक लिथोग्राफी-मुक्त विधि का वर्णन करते हैं: स्टेंसिल-आधारित एकल सेल पैटर्निंग। हम स्टेंसिल डिजाइन, पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल फैब्रिकेशन, स्टेंसिल आधारित प्रोटीन इनकॉरपोरेशन और सेल प्लेटिंग और संस्कृति सहित कदम-दर-कदम प्रक्रियाएं प्रदान करते हैं। इस सरल विधि का उपयोग 2,000 कोशिकाओं की एक सरणी पैटर्न के लिए किया जा सकता है। हम एकल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) से अलग सेल आकार के साथ प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स की पैटर्निंग प्रदर्शित करते हैं, एक 1:1 वर्ग से एक 7:1 वयस्क कार्डियोमायोसाइट की तरह आयत के लिए । यह स्टेंसिल-आधारित एकल सेल पैटर्निंग लिथोग्राफी-मुक्त, तकनीकी रूप से मजबूत, सुविधाजनक, सस्ती, और सबसे महत्वपूर्ण रूप से सीमित बायोइंजीनियरिंग पृष्ठभूमि वाले लोगों के लिए सुलभ है।

Introduction

विभिन्न सेल प्रकारों में उनके निर्देशित भेदभाव के लिए अंतराल के आगमन और बाद में प्रोटोकॉल के विकास ने आणविक और रोगी-विशिष्ट स्तर पर विकास और रोग का अध्ययन करना संभव बना दिया है, विशेष रूप से रोगी-व्युत्पन्न iPSC कार्डियोमायोसाइट्स (iPSC-सीएम) का उपयोग कार्डियोमायोपैथी1,,2मॉडल के लिए किया है। हालांकि, आईपीएससी प्रणाली और अन्य इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके विकास और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने की एक प्रमुख सीमा संरचित माइक्रोएनवायरमेंट का अभाव है। सीटू में, कोशिकाओं को बाह्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के साथ-साथ पड़ोसी कोशिकाओं की बाधाओं के अधीन किया जाता है। इन सूक्ष्म वातावरणों की विशेष जैव रासायनिक संरचना और कठोरता कोशिकाओं के स्थानिक वितरण के साथ-साथ सेल आसंजन में शामिल होने के लिए उपलब्ध कारकों को निर्देशित करती है। यह, बदले में, इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग पाथवे, जीन अभिव्यक्ति और सेल भाग्य निर्धारण को प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, वयस्क जैसे रॉड आकार में माइक्रोपैटर्नवाले आईपीएससी-सीएम में काफी बेहतर संकुचन क्षमता, कैल्शियम प्रवाह, माइटोकॉन्ड्रियल संगठन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और ट्रांसवर्स-ट्यूबल फॉर्मेशन3है। इस प्रकार, माइक्रोएनवायरमेंट के गुण सेलुलर कार्यों के नियमन में अभिन्न हैं।

पिछले माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों भारी फोटोलिथोग्राफी पर भरोसा(चित्रा 1A)। इस तकनीक में, फोटोसेंसिटिव बहुलक, या फोटोडेकी की एक परत, समाधान से एक फ्लैट सब्सट्रेट पर घूमती है ताकि 1 माइक्रोन मोटी के बारे में पतली फिल्म बन सके। इसके बाद, पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश वांछित पैटर्न युक्त मास्क के माध्यम से फोटोडपर लागू होता है। पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के संपर्क में रासायनिक रूप से अपने संबंधित डेवलपर समाधान में अपनी घुलनशीलता को संशोधित करके फोटोडको बदल देता है, मुखौटा से सब्सट्रेट पर वांछित पैटर्न को स्थानांतरित करता है। कई माइक्रोपैटर्निंग विधियां फोटोलिथोग्राफी को शामिल करती हैं, क्योंकि यह कोशिका पैटर्न के डिजाइन पर माइक्रोमीटर-स्तरीय नियंत्रण को नैनोमीटर प्रदान करती है। हालांकि, फोटोडका का कताई अशुद्धियों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, क्योंकि सबसे छोटे धूल कण समाधान के प्रसार को एक पतली फिल्म में बाधित करेंगे। इसलिए फोटोलिथोग्राफी को अदूषित सुविधाओं में किया जाना चाहिए, जिन्हें बनाए रखना महंगा है और उपयोग करने के लिए विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, फोटोलिथोग्राफी में उपयोग किए जाने वाले रसायन अक्सर कोशिकाओं के लिए जहरीले होते हैं और महत्वपूर्ण जैव अणुओं को विकृत कर सकते हैं। इस प्रकार, फोटोलिथोग्राफी सुविधाजनक जैविक अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोपैटर्न के निर्माण में महत्वपूर्ण बाधाएं बन गई है।

1 99 4 में, व्हाइटसाइड्स और सहकर्मियों4 ने सॉफ्ट लिथोग्राफी नामक तकनीकों के संग्रह का अग्रणी बनाकर फोटोलिथोग्राफी से जुड़ी कुछ चुनौतियों को पार कर लिया। सॉफ्ट लिथोग्राफी में पॉलीडिमेथिलसिलॉक्सेन (पीडीएम), एक पारदर्शी, रबर जैसी सामग्री से बनी माइक्रोस्ट्रक्चर्ड सतह का उपयोग ईसीएम प्रोटीन4का पैटर्न उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। सामान्य नरम लिथोग्राफिक तकनीकों में माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग और माइक्रोफ्लूइडिक पैटर्निंग शामिल हैं। माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग में, वर्तमान में सबसे लोकप्रिय नरम लिथोग्राफिक विधि, ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित एक पीडीएम स्टांप स्टांप(चित्रा 1 B)से संपर्क क्षेत्रों में सामग्री को सतह पर स्थानांतरित करता है। माइक्रोफ्लूइडिक पैटर्निंग में, माइक्रोस्ट्रक्चर को पीडीएम सतह पर डिज़ाइन किया गया है ताकि जब स्टांप को सब्सट्रेट में दबाया जाता है, तो माइक्रोचैनल्स का एक नेटवर्क, जिसके माध्यम से तरल पदार्थ वांछित क्षेत्रों में वितरित किया जा सकता है, बनाया जाता है(चित्रा 1 C)5। सॉफ्ट लिथोग्राफी फोटोलिथोग्राफी पर कई लाभ प्रदान करती है। एक बार एक मास्टर वेफर microfabricated है, PDMS टिकटों आसानी से स्वच्छ कमरे की सुविधाओं के आगे रोजगार के बिना दोहराया जा सकता है । इसके अलावा, नरम लिथोग्राफी की प्रक्रिया में कार्बनिक सॉल्वैंट्स की अनुपस्थिति पॉलीस्टायरीन जैसी पॉलीमेरिक सामग्रियों के उपयोग के लिए अनुमति देती है, जो आमतौर पर सेल संस्कृति में उपयोग की जाती है। अंत में, नरम लिथोग्राफिक विधियों का उपयोग करके माइक्रोपैटर्निंग सपाट सतहों तक सीमित नहीं है। इस प्रकार, सॉफ्ट लिथोग्राफी फोटोलिथोग्राफी6पर माइक्रोपैटर्न फैब्रिकेशन की पहुंच और कार्यक्षमता को बढ़ाती है। हालांकि, नरम लिथोग्राफी में महत्वपूर्ण कमियां हैं। उदाहरण के लिए, फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करके एक प्रारंभिक नक़्क़ाशी कदम, अभी भी स्टांप को माइक्रोफैब्रिकेटर करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, पीडीएम स्टांप का उपयोग करके माइक्रोपैटर्निंग सब्सट्रेट6पर प्रोटीन हस्तांतरण की गुणवत्ता में भिन्नता के अधीन है। इन विसंगतियों से बचने के लिए प्रोटीन हस्तांतरण के दौरान पीडीएम स्टांप पर लागू दबाव में अनुकूलन और स्थिरता की आवश्यकता होती है, अन्यथा पीडीएफएमएस मोल्डों के फीचर आकारों में विकृति और विकृति6हो सकती है। छोटे अणु अवशोषण7के कारण पीडीएम का बार - बार उपयोग करने की भी एक बड़ी चिंता है .

सॉफ्ट फोटोलिथोग्राफी और पीडीएम टिकटों का उपयोग करने से बचने के लिए, हम एक स्टेंसिल-आधारित, लिथोग्राफी-मुक्त एकल कोशिका माइक्रोपैटर्निंग विधि का वर्णन करते हैं जो फोटोलिथोग्राफी और सॉफ्ट लिथोग्राफी से जुड़ी कई बाधाओं को दूर करता है। इस विधि में, एक पॉलीएक्रिलैमाइड हाइड्रोजेल का उपयोग स्टेंसिल-आधारित ईसीएम प्रोटीन समावेश के लिए सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है, जो एकल एचआईपीएससी-सीएम की चयनात्मक चढ़ाना की अनुमति देता है। यह तकनीक क्लासिक सेल संस्कृति की स्थितियों में उपयोग की जाने वाली पॉलीमेरिक सामग्रियों के साथ अत्यधिक संगत है। इसके अलावा, उचित सफाई और रखरखाव के साथ, स्टेंसिल माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया के दौरान क्षरण और प्रोटीन अवशोषण के लिए पुन: प्रयोज्य और प्रतिरोधी होते हैं। अंत में, पैटर्निंग प्रक्रिया तकनीकी रूप से मजबूत, सस्ती, अनुकूलन योग्य और उन लोगों के लिए सुलभ है जिनके पास कोई विशेष बायोइंजीनियरिंग कौशल नहीं है। स्टेंसिल आधारित माइक्रोपैटर्निंग तकनीक का मोटे तौर पर हमारे हालिया प्रकाशनों मॉडलिंग में 8,9,10विभिन्न कार्डियोमायोपैथियों8का उपयोग किया गया है ।

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Protocol

1. नकारात्मक पैटर्न पॉलीइमिड आधारित स्टेंसिल का निर्माण

  1. कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन सॉफ्टवेयर (जैसे, ऑटोकैड, सॉलिडवर्क्स, ऑनशेप, एडोब इलस्ट्रेटर) का उपयोग करके .dxf प्रारूप में एक पैटर्न(चित्रा 2A)उत्पन्न करें।
    1. स्टेंसिल की सीमा को रेखांकित करने के लिए एक सर्कल (व्यास = 22 मिमी) उत्पन्न करें।
    2. एक ठोस भरा आकार या वांछित पैटर्न ड्रा।
    3. स्टेंसिल के सामने की ओर चिह्नित करने के लिए एक चिराल पत्र (जैसे, आर) शामिल करें।
      नोट: एक उदाहरण के रूप में, एकल सेल और सेल-जोड़ी स्तरों पर आईपीएससी-सीएम पैटर्न के लिए वर्गों और आयतों की एक सरणी उत्पन्न होती है। डिजाइन फ़ाइलें उपलब्ध हैं (पूरक फ़ाइलेंदेखें)। माइक्रोफैब्रिकेशन रिजॉल्यूशन लिमिट ~ 10 माइक्रोन है।
  2. लेजर-कट पॉलीइमिड फिल्म और फैब्रिकेस्टियल्स(चित्रा 2B,C)के लिए एक माइक्रोफैब्रिकेशन कंपनी को डिजाइन सबमिट करें।

2. सल्फो-सनापा एलिकोस की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल फिशर एट अल11से संशोधित किया गया है ।

  1. नमी प्रतिरोधी कार्डबोर्ड नमूना भंडारण बॉक्स (जैसे, 100 अच्छी तरह से, 10 x 10 रिक्त स्थान के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब, आयाम: 13.4 सेमी x 13.4 सेमी x 5.1 सेमी) का उपयोग करें। इसे "बीबीएस के 1,200 माइक्रोन के साथ नाम/तिथि/सल्फो-सांपा 40 माइक्रोन/पुनर्गठित" लेबल करें।
  2. ढक्कन पर 'एस' के साथ लेबल 50 माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब (पॉलीप्रोपाइलीन, 1.5 mL) लेबल करें।
  3. एक बाँझ 15 mL शंकुट्यूब में एक झिल्ली फिल्टर इकाई (पोर आकार = 0.22 माइक्रोन) का उपयोग कर के 4 mL निर्जल, अतिरिक्त शुष्क डाइमेथिल सल्फासऑक्साइड (DMSO) और बाँझ फिल्टर समाधान ले लो।
  4. तरल नाइट्रोजन स्नान तैयार करें और तरल नाइट्रोजन के वाष्पीकरण को कम करने के लिए ढक्कन के साथ कवर करें।
  5. फ़िल्टर किए गए डीएमएसओ के 2 मिलील में 50 मिलीग्राम सल्फो-सांपा भंग करें।
  6. भंवर अच्छी तरह से पूरी तरह से DMSO में सल्फो-संपा भंग करने के लिए ।
  7. सल्फो-संपाहल के 40 माइक्रोन एलिकोस को बाँझ 1.5 मीटर ट्यूबों में वितरित करें।
  8. ट्यूबों को बॉक्स में स्थानांतरित करें।
  9. फ्लैश-5 मिन के लिए तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों फ्रीज।
  10. -80 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट्स स्टोर करें।
    नोट: एलिकोट का उपयोग कम दक्षता के बिना 6 महीने तक किया जा सकता है। स्टॉक सल्फो-संपाह एकाग्रता 25 मिलीग्राम/mL या 50.77 mM है।

3. उपकरणों की नसबंदी

  1. ऑटोक्लेव दो संदंश, 24 ग्लास कवरस्लिप (22 x 22 मिमी, नंबर 1 या नंबर 1.5), एक रेजर ब्लेड, और तीन लिंट-फ्री शोषक पोंछे।
    नोट: 12 हाइड्रोजेल निर्माण करने के लिए, 24 ग्लास कवरस्लिप की आवश्यकता है। प्रति निर्माण दो कवरस्लिप होनी चाहिए। कुछ स्पेयर कवरस्लिप तैयार करने की सलाह दी जाती है।
  2. एक इथेनॉल प्रतिरोधी प्लास्टिक बॉक्स (जैसे, एक 1,000 माइक्रोन पिपेट टिप बॉक्स) में पैराफिन फिल्म (4 x 4 इंच) के दो टुकड़े रखें और उन्हें कम से कम 15 मिन के लिए ताजा 70% इथेनॉल में स्टरलाइज करें।

4. पॉलीएक्रिलैमाइड हाइड्रोगेल अग्रदूत समाधान की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल ली एट अल12से संशोधित किया गया है ।

  1. भंवर द्वारा 50 मिलीग्राम पॉलीप्रोपाइलीन अपकेंद्रित्र ट्यूब में 36.25 मिलीग्राम डिओनाइज्ड पानी में 125 मिलीग्राम अमीनोथाइल मेथक्रिलेट (एईएम) भंग करें।
  2. 10 केपीए पॉलीएक्रिलैमाइड अग्रदूत समाधान (8-0.15-15 मीटर) के 50 मिलील को तैयार करने के लिए, 40% एक्रिलैमाइड समाधान का 10 मिलील, 2% बीआईएस-एक्रिलैमाइड समाधान का 3.75 मिलील, और एईएम समाधान का 36.25 मिलीएल एक नए 50 mL पॉलीप्रोपाइलीन सेंटीमीटर ट्यूब में चरण 4.1 में तैयार किया गया है।
    नोट: अग्रदूत समाधान की अंतिम एकाग्रता 8% एक्रिलामाइड, 0.15% बीआईएस-एक्रिलामाइड, और 15 एमएम एईएम है, जिसे परमाणु बल माइक्रोस्कोपी द्वारा ~ 10 केपीए कठोरता के लिए मापा गया था। ब्याज के ऊतक अनुप्रयोगों के अनुसार, हाइड्रोगेल की कठोरता को 40% एक्रिलामाइड के अनुपात को 2% बीआईएस-एक्रिलामाइड समाधान में बदलकर बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, 8% एक्रिलैमाइड-0.08% बीआईएस-एक्रिलैमाइड समाधान 3 केपीए हाइड्रोगेल की पैदावार करता है; 8% एक्रिलैमाइड - 0.48% बीआईएस-एक्रिलैमाइड समाधान 38 केपीए हाइड्रोगेल पैदाकरता है; 8% एक्रिलैमाइड- 0.48% बीआईएस-एक्रिलैमाइड सॉल्यूशन 60 केपीए हाइड्रोगेल पैदाकरता है। बदले हुए अनुपात के साथ अग्रदूत समाधानों से बने हाइड्रोगेल की कठोरता की पुष्टि करने की सलाह दी जाती है।

5. फोटोसर्जक समाधान की तैयारी

  1. 5% फोटोसर्जेटर समाधान के 1 mL के लिए, पहले ढक्कन के साथ 1.5 मिलीग्राम पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रलाइज ट्यूब में 100% इथेनॉल के 700 माइक्रोन में 50 मिलीग्राम 2-हाइड्रोक्सी-4'-(हाइड्रोक्सिटहेक्सी) को भंग करें।
    नोट: 2- हाइड्रोक्सी-4'-(2-हाइड्रोक्सेटोहक्सी) - 2- मिथाइलप्रोपीओफेनोन पानी में घुलनशील नहीं है। भंवर द्वारा इथेनॉल में पाउडर को पूरी तरह से भंग करना सुनिश्चित करें।
  2. 2-हाइड्रोक्सी-4'-(2-हाइड्रोक्सेथेथक्सी) को पूरी तरह से भंग करने के बाद- 2- भंवर द्वारा इथेनॉल में मिथाइलप्रोपियोफेनोन, 1 मिलील की अंतिम मात्रा के लिए फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) के 300 माइक्रोन जोड़ें।
    नोट: 2-हाइड्रोक्सी-4'-(2-हाइड्रोक्सेटिनहेक्सी) की अंतिम एकाग्रता-2-मिथाइलप्रोपियोफेनोन समाधान 5% है। नाकाम 5% फोटोसर्जेटर समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 सप्ताह के लिए अच्छा है।

6. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान की तैयारी

नोट: तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स(सामग्री की तालिका)एक तापमान के प्रति संवेदनशील सामग्री है। ठंडा पिपेट युक्तियों और ट्यूबों के साथ ही बर्फ ठंड समाधान के साथ बर्फ पर काम करने के लिए सुनिश्चित करें । बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स का एक नया स्टॉक रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर धीरे-धीरे गल जाना चाहिए।

  1. हाइड्रोजेल निर्माण प्रति तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान के 200 μL तैयार करें। 12 निर्माणों के लिए, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान के 2.4 mL की जरूरत है। 10% अतिरिक्त समाधान तैयार करें (उदाहरण के लिए, 2.6 mL)।
  2. तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान के हर नए बैच/बहुत के लिए, कमजोर पड़ने अनुपात का अनुकूलन । पहली बार, 1:10, 1:20, 1:40 के कमजोर पड़ने के अनुपात का परीक्षण कमजोर पड़ने का अनुपात है कि कोशिका पैटर्निंग के लिए सबसे अच्छा गुण पैदावार मिल ।
    नोट: यदि तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान बहुत चिपचिपा है, यह स्टेंसिल के शीर्ष पर एक जेल बनेगी, और स्टेंसिल को हटाने पर छीलने की अधिक संभावना है। यदि प्रोटीन समाधान बहुत तरल है, तो यह स्टेंसिल के पैटर्न छेद के माध्यम से प्रवेश करेगा, जिसके परिणामस्वरूप खराब गुणवत्ता पैटर्निंग होगी।
  3. बर्फ के साथ बर्फ पर पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन स्टॉक स्टॉक समाधान बर्फ के साथ ठंडा Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम/पोषक तत्व मिश्रण एफ-12 (DMEM/F12) मीडिया या 1x PBS ऊपर अनुकूलित कमजोर पड़ने अनुपात के लिए । उदाहरण के लिए, DMEM/F12 मीडिया (1:20) के 2.4 mL में स्टॉक समाधान के 120 μL पतला और बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर रहते हैं।

7. हाइड्रोजेल निर्माण

  1. एक जैव सुरक्षा हुड में एक यूवी बेंच लैंप (365 एनएम, 4 mW/cm2)रखें।
  2. स्टरलाइज्ड पैराफिन फिल्मों को स्टेप 3.2 से रखें और बाँझ परिस्थितियों में पूरी तरह से सूख जाएं। अगर पैराफिन फिल्में पूरी तरह से ड्राई नहीं हैं तो किसी भी अवशिष्ट लिक्विड को हटाने के लिए वैक्यूम एम्पॅल सिस्टम का इस्तेमाल करें। ऑटोक्लेव्ड संदंश का उपयोग करके प्रत्येक पैराफिन फिल्म पर चरण 3.1 से छह ऑटोक्लेव कवरस्लिप रखें।
  3. 50 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन सेंट्रलाइज ट्यूब में पॉलीएक्रिलैमाइड अग्रदूत समाधान (चरण 4.2) के साथ 5% फोटोसर्जक समाधान (चरण 5.2) को कमजोर करके यूवी-क्रॉसलिंकेबल पॉलीएक्रिलैमाइड अग्रदूत समाधान तैयार करें। यूवी-क्रॉसलिंकेबल पॉलीएक्रिलैमाइड अग्रदूत समाधान के 5 मिलील के लिए, पॉलीएक्रिलैमाइड अग्रदूत समाधान के 5 mL में 5% फोटोसर्जक समाधान के 50 माइक्रोन जोड़ें।
  4. नसबंदी के लिए 0.22 माइक्रोन पोर आकार के साथ 50 मिलीआर फिल्टर यूनिट का उपयोग करके चरण 7.3 से अग्रदूत समाधान फ़िल्टर करें।
    नोट: हमेशा ताजा अग्रदूत समाधान तैयार करें।
  5. पैराफिन फिल्माया पेट्री डिश में प्रत्येक 22 x 22 मिमी ग्लास कवर स्लिप पर चरण 7.4 से पॉलीएक्रिलामाइड अग्रदूत समाधान के 200 माइक्रोन वितरित करें और बीच में समाधान को सैंडविच करने के लिए शीर्ष पर एक और 22 x 22 मिमी ग्लास कवरस्लिप के साथ ध्यान से कवर करें(चित्रा 3A)।
    नोट: पैराफिन फिल्म का उपयोग फैलने से बचने और कवरस्लिप के बीच में अग्रदूत समाधान को सीमित करने के लिए किया जाता है।
  6. यूवी बेंच लैंप के नीचे चरण 7.5 से कवरस्लिप युक्त पेट्री डिश रखें और 5 मिन(चित्रा 3B)के लिए पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल को फोटोपॉलीमेरीइज़ करें।
    नोट: यदि सतह गैर-सफेद है, तो सतह का यूवी अवशोषण फोटोक्रॉसलिंकिंग दक्षता को कम करता है। यूवी तीव्रता हानि को कम करने के लिए गैर-सफेद सतह पर श्वेत पत्र का कवरेज महत्वपूर्ण है। यूवी विकिरण से बचाने के लिए, एल्यूमीनियम पन्नी के साथ दीपक को कवर करें और यूवी सुरक्षा चश्मे पहनें।
  7. ध्यान से एक कवर अलग दूसरे से एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर कार्रवाई का लाभ उठाने(चित्रा 3C)द्वारा बंद पर्ची ।
    नोट: हाइड्रोजेल आमतौर पर शीर्ष कवरस्लिप से चिपके रहेंगे। सॉफ्ट हाइड्रोजेल से कवरस्लिप को अलग करते समय अतिरिक्त ध्यान दें, क्योंकि यह टूटने की संभावना है।
  8. पीबीएस के साथ एक डिस्पोजेबल पॉलीप्रोपाइलीन जलाशय भरें। पीबीएस युक्त जलाशय में हाइड्रोजेल-कवरस्लिप कंपोजिट को 5 मिन के लिए पीबीएस में हाइड्रोगेल को कुल्ला करने के लिए स्थानांतरित करें। रिंसिंग के बाद हाइड्रोजेल को पेट्री डिश में पैराफिन फिल्म पर वापस निर्माण करें ।

8. प्रोटीन संकीर्तन

  1. एक आइस बकेट और प्रीकूल पीबीएस तैयार करें।
    नोट: छह हाइड्रोगेल के लिए, ठंड पीबीएस के 1,200 माइक्रोन की आवश्यकता है।
  2. सल्फो-सांपा अलीकोट (1 शीशी = 6 जैल) निकालें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो अनुकूलन के बाद उपयोग किए जाने वाले सल्फो-संपा की मात्रा को कम किया जा सकता है।
  3. सल्फो-सांपा अलीकोट की शीशी में 1,200 माइक्रोन कोल्ड पीबीएस जोड़ें और ऊपर-नीचे पाइपिंग करके मिलाएं।
  4. पेट्री डिश में पैराफिन फिल्म पर सल्फो-सांपा के 200 माइक्रोन बांटें और हाइड्रोगेल-कवरस्लिप कंपोजिट के साथ हाइड्रोगेल-कवरस्लिप कंपोजिट के साथ कवर करें, जिसमें हाइड्रोगेल सल्फो-सांपा(चित्रा 3डी)से संपर्क करते हैं।
    नोट: सल्फो-संपा हाइड्रोलिसिस के कारण पानी के लिए अतिसंवेदनशील है। उपयोग से पहले -80 डिग्री सेल्सियस से ताजा गल। किसी भी बचे हुए को दोबारा इस्तेमाल या रीफ्रीज न करें।
  5. सल्फो-सांपा को सक्रिय करने के लिए 5 मिन के लिए 365 एनएम, 4 mW/cm2 पर यूवी लैंप के लिए हाइड्रोजेल का पर्दाफाश करें।
    नोट: एक्सपोजर के बाद, सल्फो-सांपा नारंगी से भूरे रंग(चित्रा 3E)में बदल जाएगा। यदि हाइड्रोगेल भूरा हो जाता है, तो यह सल्फो-सांपा के फिनाइल अजाइड समूह की सफल सक्रियता और हाइड्रोगेल पर सल्फो-सांपा को शामिल करने का संकेत देता है। सीधे अधिकतम 10 मिनट के भीतर 8.6−8.9 चरणों के साथ आगे बढ़ें, क्योंकि सल्फो-सांपा की गतिविधि में गिरावट आएगी।
  6. ताजा पीबीएस के साथ एक डिस्पोजेबल पॉलीप्रोपाइलीन जलाशय की भरपाई करें। सल्फो-संपाह सक्रियण के बाद, सक्रिय हाइड्रोगेल स्थानांतरित करें और अनबाउंड सल्फो-सांपा को हटाने के लिए पीबीएस जलाशय में हाइड्रोगेल को जल्दी से कुल्ला करें।
    नोट: एक लंबे समय तक धोने के परिणामस्वरूप कम प्रोटीन संयोजन दक्षता हो सकती है।
  7. एक त्वरित कुल्ला के बाद, पेट्री व्यंजनों में पैराफिन फिल्म पर हाइड्रोगेल से जुड़ी कवरस्लिप रखें और बाँझ लिंट-मुक्त पोंछे के साथ हाइड्रोगेल को ध्यान से डब करें।
    नोट: हाइड्रोजेल के शीर्ष पर शेष पीबीएस स्टेंसिल के माध्यम से तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान के रिसाव में परिणाम होगा, और बहुत बड़े पैमाने पर सूखने से स्टेंसिल के बहुत अधिक पालन के कारण स्टेंसिल को हटाने पर हाइड्रोजेल का टूटना होगा।
  8. स्टेंसिल और हाइड्रोगेल(चित्रा 3F)के बीच तंग सीलिंग सुनिश्चित करने के लिए ऑटोक्लेव्ड लिंट-फ्री वाइप्स के साथ हाइड्रोगेल और थपका के शीर्ष पर स्टेंसिल रखें।
  9. ध्यान से पतला तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान के 200 μL वितरित कदम 6.3(चित्रा 3जी)शीर्ष पर से तैयार किया। इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस) में रात भर छोड़ दें।
    नोट: जब स्टेंसिल-हाइड्रोगेल संपर्क तंग होता है और तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान एकाग्रता इष्टतम होती है, तो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान तनहा हो जाएगा और स्टेंसिल(चित्रा 3H)के शीर्ष पर रहेगा। अनुकूलन पर ऊष्मायन समय को कम किया जा सकता है। सैद्धांतिक रूप से इसे घटाकर 30 मिन-2 घंटे किया जा सकता है।
  10. अगले दिन, हाइड्रोगेल को 6 अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें और उन्हें पूरी तरह से पीबीएस में विसर्जित करें।
    नोट: स्टेंसिल को हाइड्रोजेल के फाड़ने और चिपकाने से रोकने के लिए कवरस्लिप पर पीबीएस विसर्जन के साथ स्टेंसिल को छीलने की सिफारिश की जाती है।
  11. हाइड्रोजेल को फाड़े बिना ऑटोक्लेव चिमटी का उपयोग करके स्टेंसिल को सावधानी से हटा दें। डीएमईएम के साथ अच्छी तरह से फिर से निलंबित करें, नमूनों वाले हाइड्रोगेल को इनक्यूबेटर में वापस करें, और उन्हें किसी भी संदूषण के लिए परीक्षण करने के लिए रात भर छोड़ दें।
  12. अगर मीडिया साफ रहता है तो हाइड्रोगेल सेल चढ़ाना के लिए तैयार हैं। संबंधित अनुप्रयोगों के लिए कोशिकाओं के आसंजन की अनुमति देने के लिए सेल चढ़ाना घनत्व और ऊष्मायन समय का अनुकूलन करें।
    नोट: एचआईपीएससी-सीएम, बीज और रातोंरात इनक्यूबेट के एकल सेल पैटर्निंग के लिए। सीडिंग के लिए निम्नलिखित सेल नंबरों की सिफारिश की जाती है: 30,000, 60,000, और 90,000 कोशिकाएं/ बहुत सारी कोशिकाओं को सीडिंग प्रति पैटर्न एक से अधिक कोशिका की ओर जाता है। सेल सीडिंग से पहले गैर-एकल कोशिकाओं को तनाव देने के लिए एक सेल छलनी की सिफारिश की जाती है।
  13. अगले दिन, सेल लगाव और प्रसार का निरीक्षण करें, और अलग कोशिकाओं से छुटकारा पाने के लिए मीडिया को बदलें।

9. इस्तेमाल स्टेंसिल की सफाई

  1. इस्तेमाल स्टेंसिल पर अवशिष्ट मैट्रिक्स प्रोटीन को हटाने के लिए, 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मीटर के लिए एंजाइम समाधान(सामग्री की तालिका)में स्टेंसिल को जलमग्न कर दें।
    नोट: एंजाइम का उपयोग किए जाने वाले मैट्रिक्स प्रोटीन के आधार पर चुना जाना चाहिए। कोलेजन से भरपूर मैट्रिक्स प्रोटीन सॉल्यूशन के लिए कोलेजेनेज का सेवन करें। एंजाइम समाधान में 10-15 min अल्ट्रासोनिकेशन की भी सिफारिश की जाती है।
  2. समाधान को एस्पिरेट करें और 10% ब्लीच के साथ भरें। कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट।
  3. पीबीएस के साथ 3x कुल्ला।
  4. उपयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 70% इथेनॉल में स्टोर करें।

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Representative Results

वर्गों या आयतों की एक सरणी युक्त स्टेंसिल के निर्माण का प्रदर्शन किया गया है(चित्र4A)। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, हमने नमूनों वाले मैट्रिक्स प्रोटीन द्वीप(चित्रा 4B और चित्रा 5A)और कोशिकाओं(चित्रा 4C)प्राप्त किए। सबऑप्टिमल मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान एकाग्रता ने सबऑप्टिमल पैटर्निंग(चित्रा 5B)का नेतृत्व किया। स्टेंसिल के सामने की ओर का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। यदि स्टेंसिल के पीछे की ओर उपयोग किया जाता है, तो लेजर कटिंग(चित्रा 6ए,बी)की दिशा के कारण मैट्रिक्स प्रोटीन द्वीपों का आकार बढ़ जाता है। जबकि आयताकार पैटर्न की चौड़ाई में काफी परिवर्तन नहीं हुआ(चित्रा 6C),स्टेंसिल के पीछे की ओर का उपयोग करते समय ऊंचाई में काफी वृद्धि हुई, जिससे इच्छित पहलू अनुपात(चित्रा 6D,ई)में कमी आई। हमने सिलिकॉन एस्टोमर सब्सट्रेट्स(चित्रा 7)के लिए स्टेंसिल-आधारित पैटर्निंग लागू की। सिलिकॉन एल्स्टोमर सब्सट्रेट्स पर पैटर्न वाले कार्डियोमायोसाइट्स को कम आवर्धन(चित्रा 7ए)और उच्च आवर्धन(चित्रा 7B)पर सार्कोरिक प्रोटीन α-actinin पर कार्डियक ट्रोपोनिन टी के इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री द्वारा कल्पना की गई थी। स्टेंसिल आधारित पैटर्निंग को विभिन्न कठोरता के साथ हाइड्रोगेल पर दो कार्डियोमायोसाइट्स के साथ-साथ पैटर्न पर भी लागू किया जा सकता है। एक प्रदर्शन के रूप में, हम शारीरिक रूप से प्रासंगिक कठोरता(चित्रा 8A)और पैथोलॉजिकल-प्रासंगिक कठोरता(चित्रा 8B)पर कार्डियोमायोसाइट पैटर्निंग दिखाते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: तीन सोने के मानक माइक्रोपैटर्निंग रणनीतियों की योजनाबद्ध । (A)फोटोलिथोग्राफी। (ख)माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग। (ग)माइक्रोफ्लूइडिक पैटर्निंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: स्टेंसिल डिजाइनिंग का वर्कफ्लो। (A)स्टेंसिल का कंप्यूटर-असिस्टेड डिजाइन । (ख)लेजर-कट पॉलीइमिड स्टेंसिल की एक प्रतिनिधि तस्वीर। (ग)स्टेंसिल की एक प्रतिनिधि सूक्ष्म छवि। पीला क्षेत्र पॉलीइमिड स्टेंसिल का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि हल्का नीला क्षेत्र लेजर-कट छेद की एक सरणी का प्रतिनिधित्व करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: हाइड्रोजेल निर्माण चरणों की तस्वीरें। (A)दो कवरस्लिप के बीच में अग्रदूत समाधान को सैंडविच करके पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल फैब्रिकेशन। (ख)यूवी बेंच लैंप के तहत पॉलीएक्रिलैमाइड हाइड्रोगेल की यूवी फोटो-क्रॉसलिंकिंग । यूवी लैंप उपयोगकर्ता संरक्षण के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाता है। (ग)फोटो-क्रॉसलिंकहाइड्रोल को एक तरफ एक कवरस्लिप को अलग करके प्राप्त किया जाता है । (घ)हाइड्रोजेल निर्माण ईसीएम प्रोटीन समावेश के लिए हाइड्रोजेल को संशोधित करने के लिए सल्फो-सांपा हल के संपर्क में है। यूवी एक्टिवेशन से पहले सल्फो-सांपा नारंगी है। (ई)यूवी सक्रियण के बाद, सल्फो-सांपा भूरे रंग का हो जाता है, यह दर्शाता है कि इसे हाइड्रोगेल सतह पर सक्रिय और शामिल किया जाता है। (एफ)अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए बाँझ लिंट-मुक्त पोंछे के साथ हाइड्रोगेल को डब करने के बाद, स्टेंसिल को हाइड्रोजेल पर रखा जाता है। (जी)बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान स्टेंसिल-हाइड्रोजेल निर्माण पर पाइप किया जाता है। (एच)यदि स्टेंसिल-हाइड्रोगेल संपर्क सफलतापूर्वक तंग है, तो तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान शीर्ष पर रहेगा और रिसना नहीं होगा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: विभिन्न आयताकार आकृतियों के साथ बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन और मानव प्रेरित प्लुरिटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स (hiPSC-सीएम) की माइक्रोपैटर्निंग। (A)विभिन्न पहलू अनुपात (1:1, 4:1, 11:1) के साथ लेजर-कट आयतों वाले स्टेंसिल की सूक्ष्म छवियां। (ख)हाइड्रोजेल सब्सट्रेट्स पर इम्यूनोस्टेन्ड मैट्रिक्स प्रोटीन द्वीपों की प्रतिनिधि छवियां । (ग)न्यूक्लिक (सियान) और कार्डियक ट्रोपोनिन टी (मजेंटा) के लिए दागित hiPSC-सीएम की प्रतिनिधि छवियां । स्केल बार = पैनलों बी और सी के लिए 20 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: ईसीएम प्रोटीन एकाग्रता उचित पैटर्न पैदा करने में एक आवश्यक भूमिका निभाता है। (क)एकल पैटर्न में तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन के बहुत समरूप वितरण के साथ एक इष्टतम एकाग्रता की प्रतिनिधि छवि। (ख)कम एकाग्रता के कारण सबऑप्टिमल मैट्रिक्स प्रोटीन पैटर्न, जो पैटर्न के बाहर मैट्रिक्स प्रोटीन का रिसाव और पैटर्न के भीतर मैट्रिक्स प्रोटीन की कम मात्रा के रूप में गेहूं रोगाणु agglutinin धुंधला द्वारा निर्धारित किया गया । स्केल बार = पैनलों के लिए 20 माइक्रोन ए और बी. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: स्टेंसिल साइड इफेक्ट। (A)बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन पैटर्न जब स्टेंसिल के सामने की ओर इस्तेमाल किया गया था । (ख)बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन पैटर्न जब स्टेंसिल के पीछे की ओर इस्तेमाल किया गया था । आयताकार तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन द्वीपों के(सी)चौड़ाई,(डी)ऊंचाई,(ई)पहलू अनुपात का परिमाणीकरण। ग्राफ की साजिश रची है मतलब ± SEM । सांख्यिकी की गणना अपेयर छात्र टी टेस्ट द्वारा की जाती है । n.s. = महत्वपूर्ण नहीं है। = पी एंड एलटी; 0.0001। स्केल बार = 20 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 7
चित्रा 7: सिलिकॉन elastomer सब्सट्रेट पर स्टेंसिल आधारित पैटर्निंग। (क)सिलिकॉन एल्स्टोमर सब्सट्रेट्स पर एकल कोशिका पैटर्न वाले कार्डियोमायोसाइट्स की एक प्रतिनिधि छवि कार्डियक मार्कर, कार्डियक ट्रोपोनिन टी (सीटीटीटी) द्वारा कम आवर्धन पर दागित होती है। स्केल बार = 300 माइक्रोन।(बी)उच्च आवर्धन पर सरकोरिक प्रोटीन α-actinin द्वारा दाग एक प्रतिनिधि एकल सेल पैटर्न कार्डियोमायोसाइट। स्केल बार = 10 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 8
चित्रा 8: विभिन्न कठोरता के साथ पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल पर hiPSC-सीएम की माइक्रोपैटर्निंग। (A)10 केपीए,(B)60 केपीए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चरण समस्या देखी गई संभावित कारण समाधान
1.1 पैटर्न आकार उम्मीद से बड़ा है स्टेंसिल फ़्लिप किया गया है स्टेंसिल के सामने और पीछे की ओर इंगित करने के लिए स्टेंसिल डिजाइन में एक चिरल पत्र/आकार शामिल करें
8.1 स्टेंसिल छीलने पर हाइड्रोजेल फ्रैक्चर हाइड्रोजेल स्टेंसिल से चिपक जाता है स्टेंसिल की सफाई
स्टेंसिल डालने से पहले हाइड्रोजेल को बहुत ज्यादा न सुखाएं
8.13 सेल अटैचमेंट सबऑप्टिमल है अपमानित सल्फो-संपा नए सल्फो-सपा का उपयोग करें
अक्षम प्रोटीन समावेश नया ईसीएम प्रोटीन समाधान तैयार करें
पुराना ईसीएम प्रोटीन समाधान
8.13 सेल पैटर्निंग सबऑप्टिमल है तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान पर फैल हाइड्रोगेल पर बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन समाधान के वितरण की जांच करने के लिए फ्लोरोफोर-कॉन्जुगेटएंटी एंटी माउस आईजीजी एंटीबॉडी या गेहूं रोगाणु एग्ग्लूटिनिन का उपयोग करके इम्यूनोस्टेनिंग करें
8.13 एक स्लॉट पर एक से अधिक सेल सिंगल सेल सस्पेंशन में नहीं सिंगल सेल सस्पेंशन के लिए 40−70 माइक्रोन सेल छलनी का उपयोग करें
सीडिंग घनत्व इष्टतम नहीं सीडिंग घनत्व को 30 हजार से 90 k प्रति मिलीएल तक अनुकूलित करें

तालिका 1: समस्या निवारण दिशानिर्देश। लगातार समस्याओं, संभावित कारणों और संभावित समाधानों पर चर्चा की जाती है।

पूरक फाइलें।   फाइलें डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें। 

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Discussion

हम एक लिथोग्राफी-फ्री स्टेंसिल-आधारित माइक्रोपैटर्निंग विधि का वर्णन करते हैं जो अनुयायी कोशिकाओं के प्रभावी पैटर्निंग को सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, हम पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल पर पॉलीएक्रिलैमाइड हाइड्रोगेल पर पॉलीएक्रिलैमाइड हाइड्रोगेल पर माइक्रोपैटर्निंग बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन द्वीपों द्वारा विभिन्न लंबाई-से-चौड़ाई अनुपात में HIPSC-सीएम की पैटर्निंग प्रदर्शित करते हैं- या पैथोलॉजिकल-प्रासंगिक ऊतक कठोरता या सिलिकॉन आधारित इलास्टोमर सब्सट्रेट्स। यह विधि किसी भी शोधकर्ताओं के लिए अपेक्षाकृत सरल और अत्यधिक सुलभ है, जिनमें फोटोलिथोग्राफी और माइक्रोफैब्रिकेशन तकनीकों में कम पृष्ठभूमि है। वर्णित विधि नरम लिथोग्राफी का उपयोग करके टिकटों को उत्पन्न करने और माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग तकनीक में शामिल ब्याज के सब्सटरेट में प्रोटीन स्थानांतरित करने से जुड़ी महत्वपूर्ण चुनौतियों को दरकिनार करती है। यह प्रोटोकॉल 1 को वर्कफ्लो प्रदान करता है) लागत प्रभावी तरीके से एक क्षेत्र और ब्याज के आकार के साथ कस्टम-डिज़ाइन किए गए स्टेंसिल बनाएं; 2) ब्याज की कठोरता के साथ एक हाइड्रोजेल सब्सट्रेट बनाना; और 3) हाइड्रोजेल सब्सट्रेट पर ईसीएम प्रोटीन को कुशलतापूर्वक संजोना।

सिलिकॉन आधारित सामग्रियों और कांच के कवरस्लिप13,14जैसे विभिन्न सामग्रियों के सब्सट्रेट्स पर त्रिकोण और सितारों सहित ईसीएम प्रोटीन के विभिन्न आकारों को पैटर्न करने के लिए पारंपरिक सॉफ्ट लिथोग्राफी विधियों का उपयोग किया गया है। इस अध्ययन में, हम केवल कार्डियोमायोसाइट्स के शारीरिक और रोग-प्रासंगिक आकार को देखते हुए आयताकार पैटर्न प्रदर्शित करते हैं। हमारा मानना है कि अन्य जटिल आकृतियों की स्टेंसिल-आधारित पैटर्निंग तब तक काम कर सकती है जब तक आकार की सबसे छोटी विशेषता संकल्प (~ 10 माइक्रोन) से परे नहीं जाती है। सब्सट्रेट सामग्रियों के संबंध में, हम प्रदर्शित करते हैं कि स्टेंसिल-आधारित पैटर्निंग हाइड्रोजेल(चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 4, चित्रा 5, चित्रा 6 और चित्रा 8)या सिलिकॉन आधारित इलास्टोमर सब्सट्रेट(चित्रा 7)पर लागू की जा सकती है। प्रस्तुत विधि पॉलीइमिड-सामग्रियों जैसे ऊतक संस्कृति प्लास्टिक और ग्लास कवरस्लिप के लिए न्यूनतम चिपकने के साथ सब्सट्रेट्स पर काम नहीं करती है क्योंकि पॉलीइमिड आधारित स्टेंसिल और इन सब्सट्रेट्स के बीच तंग सीलिंग हासिल नहीं की जाती है। तंग सीलिंग को सक्षम करने के लिए, आगे सतह संशोधन की आवश्यकता है। अंत में, हम बताते हैं कि विधि का उपयोग विभिन्न कठोरता (यानी, 10 केपीए, 60 केपीए)(चित्रा 8)के साथ हाइड्रोगेल पर सेल-जोड़ी पैटर्न का मज़बूती से उत्पादन करने के लिए किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में, सबसे महत्वपूर्ण कदम ईसीएम प्रोटीन एकाग्रता (प्रोटोकॉल अनुभाग 6) का अनुकूलन है। इस चरण का लक्ष्य ईसीएम प्रोटीन की इष्टतम एकाग्रता को ढूंढना है जो स्टेंसिल के छेद के माध्यम से प्रोटीन समाधान को रोकने के लिए पर्याप्त चिपचिपा है, लेकिन जेलेशन से बचने के लिए बहुत केंद्रित नहीं है(चित्र 5)। यह स्टेंसिल आधारित विधि ईसीएम प्रोटीन के प्रकार को प्रतिबंधित नहीं करती है। हालांकि चिपचिपा ईसीएम प्रोटीन समाधान स्टेंसिल के शीर्ष पर रहने की संभावना अधिक होती है, लेकिन कम चिपचिपा प्रोटीन का भी उपयोग किया जा सकता है। एक आवश्यकता यह सुनिश्चित कर रही है कि स्टेंसिल और पीए हाइड्रोगेल की सतहें एक सापेक्ष स्थिर हाइड्रोफोबिक इंटरफेस बनाने के लिए काफी सूखी हैं। इस प्रदर्शन में, तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स प्रोटीन का उपयोग किया गया था क्योंकि यह चिपचिपा है और एचआईपीएससी-सीएम को संभोग करने के लिए उपयुक्त है। हालांकि, अन्य ईसीएम प्रोटीन का उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, फाइब्रोनेक्टिन, जिलेटिन, कोलेजन, लेमिनिन)।

प्रत्येक दिए गए आवेदन के लिए ईसीएम प्रोटीन समाधान के अनुकूलन के अलावा, स्टेंसिल और हाइड्रोजेल सतह के बीच एक उचित मुहर पैदा करना ईसीएम प्रोटीन के साथ एक सटीक पैटर्न प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। क्योंकि अत्यधिक सूखने से हाइड्रोजेल का टूटना हो सकता है, स्टेंसिल को ओवरड्राई नहीं करना आवश्यक है। इन चरणों (यानी, हाइड्रोजेल पर स्टेंसिल रखने के साथ ही धीरे से इसे बाद में बंद pealing) कुछ अभ्यास की आवश्यकता है । प्रत्येक दी गई स्थिति के लिए एक इष्टतम हैंडलिंग प्रक्रिया स्थापित करने से स्टेंसिल से हाइड्रोगेल स्टिक होने से भी बचना होगा। इस अनुकूलन के साथ, लेजर कटिंग में खामियों के कारण सबमाइक्रोन स्केल लेजर बर्न्स हाइड्रोजेल क्षति के संबंध में तकनीक को काफी हद तक प्रभावित नहीं करेंगे।

एक और महत्वपूर्ण कदम हाइड्रोजेल सब्सट्रेट पर स्टेंसिल रखते समय स्टेंसिल के सामने का उपयोग करना है। हमने पाया कि प्रत्येक पक्ष के उपयोग का सब्सट्रेट पर प्रभाव पड़ता है, संभवतः लेजर कटिंग(चित्रा 6)के कारण। पहली बार विशिष्ट आकार या आकार में कोशिकाओं को पैटर्न करते समय एक सिफारिश एक अनुकूलन स्टेंसिल उत्पन्न करना है। स्टेंसिल-डिज़ाइन विशेषताएं जरूरी अंतिम पैटर्न वाले सेल आकारसे मेल नहीं खाती हैं। हम एक अनुकूलन स्टेंसिल उत्पन्न करने की सलाह देते हैं जिसमें सुविधा आकार का ढाल होता है। हमने समस्या निवारण(तालिका 1)में मदद करने के लिए संभावित समस्याओं और संभावित समाधानों को सूचीबद्ध करने के लिए एक टेबल तैयार किया।

इस पांडुलिपि में उल्लिखित उसी माइक्रोफैब्रिकेशन कंपनी का उपयोग करने की आवश्यकता नहीं है। स्टेंसिल की सटीक पीढ़ी की चाबियां लेजर के बीम व्यास और स्टेंसिल फिल्म की मोटाई, हमारे मामले में, पॉलीइमिड (50 माइक्रोन) हैं। हमारा मानना है कि एक उपयुक्त लेजर से लैस लेजर लैब कुछ चरणों के साथ स्टेंसिल उत्पन्न कर सकती है, लेजर तीव्रता, संरेखण और अन्य चरों का अनुकूलन कर सकती है। हालांकि हम केवल एक कंपनी के साथ काम किया है, वहां कई उपलब्ध कंपनियों को जो सटीक लेजर काटने प्रदर्शन कर रहे हैं ।

इस विधि के लिए एक सीमा संकल्प है । जबकि फोटोलिथोग्राफी नैनोस्केल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त कर सकती है, स्टेंसिल-आधारित पैटर्निंग रिज़ॉल्यूशन पॉलीइमिड स्टेंसिल के लेजर-कटिंग के संकल्प तक सीमित है, जो आज तक आमतौर पर कुछ माइक्रोन (~ 10 माइक्रोन) के पैमाने पर होता है। फिर भी, यह देखते हुए कि औसत सेल आकार 10 माइक्रोन से अधिक है, संकल्प आम तौर पर किसी भी एकल सेल पैटर्निंग पर लागू होता है।

संक्षेप में, यह विधि सेल-ईसीएम इंटरैक्शन का अध्ययन करने, सेल संरचना-फ़ंक्शन सहसंबंध और कई अन्य अनुप्रयोगों की जांच करने के लिए बहुमुखी प्लेटफ़ॉर्म प्रदान करती है। हमारा मानना है कि इस प्रोटोकॉल से कई बायोमेडिकल शोधकर्ताओं को फायदा होगा और सिंगल सेल स्टडीज की सुविधा मिलेगी ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को स्टैनफोर्ड चाइल्ड हेल्थ रिसर्च इंस्टीट्यूट (CHRI) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (1F32HL142205-01) से एसएल तक पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, निदेशक पायनियर पुरस्कार के NIH कार्यालय (LM012179-03), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अन्वेषक पुरस्कार की स्थापना की (17EIA333410923), स्टैनफोर्ड हृदय संस्थान, हॉफमैन और श्रोफेफर फाउंडेशन, और कार्डियोवस्कुलर मेडिसिन के स्टैनफोर्ड डिवीजन, चिकित्सा विभाग एस एमडब्ल्यू को , राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (UG3 TR002588, P01 HL141084 से पुरस्कार, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) और तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम (TRDRP 27IR-0012) को जेसीडब्ल्यू, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (AHA) पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप अवार्ड (18POST34030106) को एचवाई, और एच. एसवाई को हेन्स्ट फेलोशिप हम माइक्रोपैटर्न्ड एचआईपीएससी-सीएम की कॉन्फोकल इमेजिंग के समर्थन पर स्टैनफोर्ड न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी सर्विस के डॉ एंड्रयू ऑलसेन को धन्यवाद देते हैं । हम पहले स्टेंसिल डिजाइन, निर्माण, पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल कोटेड कवरस्लिप पर आईपीएससी-सीएम के एकल सेल माइक्रोपैटर्निंग और एकल सेल माइक्रोपैटर्नेड आईपीएससी-सीएम की सरकोवर संरचना की प्रारंभिक कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एचवाई को धन्यवाद देते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) Sigma-Aldrich 516155
Acrylamide solution 40% (solution) Sigma-Aldrich A-4058-100mL
Bench UV lamp 365 nm UVP UVP 95-0042-07, XX-15L
BioFlex culture plate FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC 6-well plate with silicon elastomer substrate
Bis-acrylamide solution 2% (solution) Sigma-Aldrich M1533-25mL
Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm Sigma CLS285522
Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) Sigma-Aldrich 410896
Matrigel Corning 356231 basement membrane matrix protein solution
Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics Acros Organics 326881000
Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane Millipore SLGV013SL
Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) Fisher Scientific SCGP00525
Stencils Potomac custom design
Sulfo-SANPAH ThermoFisher Scientific 22589
TrypLE Select 10x ThermoFisher Scientific A1217702 Enzyme used for stencil cleaning

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References

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सरल लिथोग्राफी-फ्री सिंगल सेल माइक्रोपैटर्निंग लेजर-कट स्टेंसिल का उपयोग कर
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Lee, S., Yang, H., Chen, C., Venkatraman, S., Darsha, A., Wu, S. M., Wu, J. C., Seeger, T. Simple Lithography-Free Single Cell Micropatterning using Laser-Cut Stencils. J. Vis. Exp. (158), e60888, doi:10.3791/60888 (2020).

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