सरल लिथोग्राफी-फ्री सिंगल सेल माइक्रोपैटर्निंग लेजर-कट स्टेंसिल का उपयोग कर
Summary
यह प्रोटोकॉल एक लिथोग्राफी-मुक्त माइक्रोपैटर्निंग विधि का परिचय देता है जो सीमित बायोइंजीनियरिंग पृष्ठभूमि वाले लोगों के लिए सरल और सुलभ है। यह विधि सेल मॉर्फोलोजी को मॉड्यूल करने के लिए ब्याज के आकार में माइक्रोपैटर्न एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स प्रोटीन के लिए अनुकूलित लेजर-कट स्टेंसिल का उपयोग करती है। माइक्रोपैटर्निंग की प्रक्रिया प्रेरित प्लुरीपोटस्टेम सेल व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स का उपयोग करके प्रदर्शित की जाती है।
Abstract
एकल सेल संकल्प पर सेल भाग्य निर्धारण पर कोशिका आकार और आकार को नियंत्रित करने के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए सेल जीव विज्ञान में माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। वर्तमान अत्याधुनिक एकल सेल माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों में सॉफ्ट लिथोग्राफी और माइक्रो-कॉन्टैक्ट प्रिंटिंग शामिल है, जो एक शक्तिशाली तकनीक है, लेकिन इसके लिए प्रशिक्षित इंजीनियरिंग कौशल और माइक्रोफैब्रिकेशन में कुछ सुविधा समर्थन की आवश्यकता होती है। इन सीमाओं के लिए अधिक सुलभ तकनीक की आवश्यकता होती है। यहां, हम एक सरल वैकल्पिक लिथोग्राफी-मुक्त विधि का वर्णन करते हैं: स्टेंसिल-आधारित एकल सेल पैटर्निंग। हम स्टेंसिल डिजाइन, पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल फैब्रिकेशन, स्टेंसिल आधारित प्रोटीन इनकॉरपोरेशन और सेल प्लेटिंग और संस्कृति सहित कदम-दर-कदम प्रक्रियाएं प्रदान करते हैं। इस सरल विधि का उपयोग 2,000 कोशिकाओं की एक सरणी पैटर्न के लिए किया जा सकता है। हम एकल मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (hiPSC) से अलग सेल आकार के साथ प्राप्त कार्डियोमायोसाइट्स की पैटर्निंग प्रदर्शित करते हैं, एक 1:1 वर्ग से एक 7:1 वयस्क कार्डियोमायोसाइट की तरह आयत के लिए । यह स्टेंसिल-आधारित एकल सेल पैटर्निंग लिथोग्राफी-मुक्त, तकनीकी रूप से मजबूत, सुविधाजनक, सस्ती, और सबसे महत्वपूर्ण रूप से सीमित बायोइंजीनियरिंग पृष्ठभूमि वाले लोगों के लिए सुलभ है।
Introduction
विभिन्न सेल प्रकारों में उनके निर्देशित भेदभाव के लिए अंतराल के आगमन और बाद में प्रोटोकॉल के विकास ने आणविक और रोगी-विशिष्ट स्तर पर विकास और रोग का अध्ययन करना संभव बना दिया है, विशेष रूप से रोगी-व्युत्पन्न iPSC कार्डियोमायोसाइट्स (iPSC-सीएम) का उपयोग कार्डियोमायोपैथी1,,2मॉडल के लिए किया है। हालांकि, आईपीएससी प्रणाली और अन्य इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके विकास और शरीर विज्ञान का अध्ययन करने की एक प्रमुख सीमा संरचित माइक्रोएनवायरमेंट का अभाव है। सीटू में, कोशिकाओं को बाह्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के साथ-साथ पड़ोसी कोशिकाओं की बाधाओं के अधीन किया जाता है। इन सूक्ष्म वातावरणों की विशेष जैव रासायनिक संरचना और कठोरता कोशिकाओं के स्थानिक वितरण के साथ-साथ सेल आसंजन में शामिल होने के लिए उपलब्ध कारकों को निर्देशित करती है। यह, बदले में, इंट्रासेलुलर सिग्नलिंग पाथवे, जीन अभिव्यक्ति और सेल भाग्य निर्धारण को प्रभावित करता है। उदाहरण के लिए, वयस्क जैसे रॉड आकार में माइक्रोपैटर्नवाले आईपीएससी-सीएम में काफी बेहतर संकुचन क्षमता, कैल्शियम प्रवाह, माइटोकॉन्ड्रियल संगठन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी और ट्रांसवर्स-ट्यूबल फॉर्मेशन3है। इस प्रकार, माइक्रोएनवायरमेंट के गुण सेलुलर कार्यों के नियमन में अभिन्न हैं।
पिछले माइक्रोपैटर्निंग तकनीकों भारी फोटोलिथोग्राफी पर भरोसा(चित्रा 1A)। इस तकनीक में, फोटोसेंसिटिव बहुलक, या फोटोडेकी की एक परत, समाधान से एक फ्लैट सब्सट्रेट पर घूमती है ताकि 1 माइक्रोन मोटी के बारे में पतली फिल्म बन सके। इसके बाद, पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश वांछित पैटर्न युक्त मास्क के माध्यम से फोटोडपर लागू होता है। पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के संपर्क में रासायनिक रूप से अपने संबंधित डेवलपर समाधान में अपनी घुलनशीलता को संशोधित करके फोटोडको बदल देता है, मुखौटा से सब्सट्रेट पर वांछित पैटर्न को स्थानांतरित करता है। कई माइक्रोपैटर्निंग विधियां फोटोलिथोग्राफी को शामिल करती हैं, क्योंकि यह कोशिका पैटर्न के डिजाइन पर माइक्रोमीटर-स्तरीय नियंत्रण को नैनोमीटर प्रदान करती है। हालांकि, फोटोडका का कताई अशुद्धियों के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, क्योंकि सबसे छोटे धूल कण समाधान के प्रसार को एक पतली फिल्म में बाधित करेंगे। इसलिए फोटोलिथोग्राफी को अदूषित सुविधाओं में किया जाना चाहिए, जिन्हें बनाए रखना महंगा है और उपयोग करने के लिए विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, फोटोलिथोग्राफी में उपयोग किए जाने वाले रसायन अक्सर कोशिकाओं के लिए जहरीले होते हैं और महत्वपूर्ण जैव अणुओं को विकृत कर सकते हैं। इस प्रकार, फोटोलिथोग्राफी सुविधाजनक जैविक अनुप्रयोगों के लिए माइक्रोपैटर्न के निर्माण में महत्वपूर्ण बाधाएं बन गई है।
1 99 4 में, व्हाइटसाइड्स और सहकर्मियों4 ने सॉफ्ट लिथोग्राफी नामक तकनीकों के संग्रह का अग्रणी बनाकर फोटोलिथोग्राफी से जुड़ी कुछ चुनौतियों को पार कर लिया। सॉफ्ट लिथोग्राफी में पॉलीडिमेथिलसिलॉक्सेन (पीडीएम), एक पारदर्शी, रबर जैसी सामग्री से बनी माइक्रोस्ट्रक्चर्ड सतह का उपयोग ईसीएम प्रोटीन4का पैटर्न उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। सामान्य नरम लिथोग्राफिक तकनीकों में माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग और माइक्रोफ्लूइडिक पैटर्निंग शामिल हैं। माइक्रोकॉन्टैक्ट प्रिंटिंग में, वर्तमान में सबसे लोकप्रिय नरम लिथोग्राफिक विधि, ईसीएम प्रोटीन के साथ लेपित एक पीडीएम स्टांप स्टांप(चित्रा 1 B)से संपर्क क्षेत्रों में सामग्री को सतह पर स्थानांतरित करता है। माइक्रोफ्लूइडिक पैटर्निंग में, माइक्रोस्ट्रक्चर को पीडीएम सतह पर डिज़ाइन किया गया है ताकि जब स्टांप को सब्सट्रेट में दबाया जाता है, तो माइक्रोचैनल्स का एक नेटवर्क, जिसके माध्यम से तरल पदार्थ वांछित क्षेत्रों में वितरित किया जा सकता है, बनाया जाता है(चित्रा 1 C)5। सॉफ्ट लिथोग्राफी फोटोलिथोग्राफी पर कई लाभ प्रदान करती है। एक बार एक मास्टर वेफर microfabricated है, PDMS टिकटों आसानी से स्वच्छ कमरे की सुविधाओं के आगे रोजगार के बिना दोहराया जा सकता है । इसके अलावा, नरम लिथोग्राफी की प्रक्रिया में कार्बनिक सॉल्वैंट्स की अनुपस्थिति पॉलीस्टायरीन जैसी पॉलीमेरिक सामग्रियों के उपयोग के लिए अनुमति देती है, जो आमतौर पर सेल संस्कृति में उपयोग की जाती है। अंत में, नरम लिथोग्राफिक विधियों का उपयोग करके माइक्रोपैटर्निंग सपाट सतहों तक सीमित नहीं है। इस प्रकार, सॉफ्ट लिथोग्राफी फोटोलिथोग्राफी6पर माइक्रोपैटर्न फैब्रिकेशन की पहुंच और कार्यक्षमता को बढ़ाती है। हालांकि, नरम लिथोग्राफी में महत्वपूर्ण कमियां हैं। उदाहरण के लिए, फोटोलिथोग्राफी का उपयोग करके एक प्रारंभिक नक़्क़ाशी कदम, अभी भी स्टांप को माइक्रोफैब्रिकेटर करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, पीडीएम स्टांप का उपयोग करके माइक्रोपैटर्निंग सब्सट्रेट6पर प्रोटीन हस्तांतरण की गुणवत्ता में भिन्नता के अधीन है। इन विसंगतियों से बचने के लिए प्रोटीन हस्तांतरण के दौरान पीडीएम स्टांप पर लागू दबाव में अनुकूलन और स्थिरता की आवश्यकता होती है, अन्यथा पीडीएफएमएस मोल्डों के फीचर आकारों में विकृति और विकृति6हो सकती है। छोटे अणु अवशोषण7के कारण पीडीएम का बार – बार उपयोग करने की भी एक बड़ी चिंता है .
सॉफ्ट फोटोलिथोग्राफी और पीडीएम टिकटों का उपयोग करने से बचने के लिए, हम एक स्टेंसिल-आधारित, लिथोग्राफी-मुक्त एकल कोशिका माइक्रोपैटर्निंग विधि का वर्णन करते हैं जो फोटोलिथोग्राफी और सॉफ्ट लिथोग्राफी से जुड़ी कई बाधाओं को दूर करता है। इस विधि में, एक पॉलीएक्रिलैमाइड हाइड्रोजेल का उपयोग स्टेंसिल-आधारित ईसीएम प्रोटीन समावेश के लिए सब्सट्रेट के रूप में किया जाता है, जो एकल एचआईपीएससी-सीएम की चयनात्मक चढ़ाना की अनुमति देता है। यह तकनीक क्लासिक सेल संस्कृति की स्थितियों में उपयोग की जाने वाली पॉलीमेरिक सामग्रियों के साथ अत्यधिक संगत है। इसके अलावा, उचित सफाई और रखरखाव के साथ, स्टेंसिल माइक्रोफैब्रिकेशन प्रक्रिया के दौरान क्षरण और प्रोटीन अवशोषण के लिए पुन: प्रयोज्य और प्रतिरोधी होते हैं। अंत में, पैटर्निंग प्रक्रिया तकनीकी रूप से मजबूत, सस्ती, अनुकूलन योग्य और उन लोगों के लिए सुलभ है जिनके पास कोई विशेष बायोइंजीनियरिंग कौशल नहीं है। स्टेंसिल आधारित माइक्रोपैटर्निंग तकनीक का मोटे तौर पर हमारे हालिया प्रकाशनों मॉडलिंग में 8,9,10विभिन्न कार्डियोमायोपैथियों8का उपयोग किया गया है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक लिथोग्राफी-फ्री स्टेंसिल-आधारित माइक्रोपैटर्निंग विधि का वर्णन करते हैं जो अनुयायी कोशिकाओं के प्रभावी पैटर्निंग को सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में, हम पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल पर पॉलीएक?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को स्टैनफोर्ड चाइल्ड हेल्थ रिसर्च इंस्टीट्यूट (CHRI) और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (1F32HL142205-01) से एसएल तक पोस्टडॉक्टोरल फेलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था, निदेशक पायनियर पुरस्कार के NIH कार्यालय (LM012179-03), अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन अन्वेषक पुरस्कार की स्थापना की (17EIA333410923), स्टैनफोर्ड हृदय संस्थान, हॉफमैन और श्रोफेफर फाउंडेशन, और कार्डियोवस्कुलर मेडिसिन के स्टैनफोर्ड डिवीजन, चिकित्सा विभाग एस एमडब्ल्यू को , राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (UG3 TR002588, P01 HL141084 से पुरस्कार, R01 HL126527, R01 HL113006, R01 HL123968) और तंबाकू से संबंधित रोग अनुसंधान कार्यक्रम (TRDRP 27IR-0012) को जेसीडब्ल्यू, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (AHA) पोस्टडॉक्टोरल फैलोशिप अवार्ड (18POST34030106) को एचवाई, और एच. एसवाई को हेन्स्ट फेलोशिप हम माइक्रोपैटर्न्ड एचआईपीएससी-सीएम की कॉन्फोकल इमेजिंग के समर्थन पर स्टैनफोर्ड न्यूरोसाइंस माइक्रोस्कोपी सर्विस के डॉ एंड्रयू ऑलसेन को धन्यवाद देते हैं । हम पहले स्टेंसिल डिजाइन, निर्माण, पॉलीएक्रिलामाइड हाइड्रोगेल कोटेड कवरस्लिप पर आईपीएससी-सीएम के एकल सेल माइक्रोपैटर्निंग और एकल सेल माइक्रोपैटर्नेड आईपीएससी-सीएम की सरकोवर संरचना की प्रारंभिक कॉन्फोकल इमेजिंग के लिए एचवाई को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| 2-Aminoethyl methacrylate hydrochloride (powder) | Sigma-Aldrich | 516155 | |
| Acrylamide solution 40% (solution) | Sigma-Aldrich | A-4058-100mL | |
| Bench UV lamp 365 nm | UVP | UVP 95-0042-07, XX-15L | |
| BioFlex culture plate | FLEXCELL INTERNATIONAL CORPORATION, Burlington, NC | 6-well plate with silicon elastomer substrate | |
| Bis-acrylamide solution 2% (solution) | Sigma-Aldrich | M1533-25mL | |
| Corning cover glasses square, No. 2, W × L 22 mm × 22 mm | Sigma | CLS285522 | |
| Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) (powder) | Sigma-Aldrich | 410896 | |
| Matrigel | Corning | 356231 | basement membrane matrix protein solution |
| Methyl sulfoxide, 99.7+%, Extra Dry, AcroSeal, ACROS Organics | Acros Organics | 326881000 | |
| Millex (13mm) filter unit with Durapore Membrane | Millipore | SLGV013SL | |
| Millipore 50mL Steriflip (0.22 µm) | Fisher Scientific | SCGP00525 | |
| Stencils | Potomac | custom design | |
| Sulfo-SANPAH | ThermoFisher Scientific | 22589 | |
| TrypLE Select 10x | ThermoFisher Scientific | A1217702 | Enzyme used for stencil cleaning |
References
- Burridge, P. W., et al. Chemically Defined and Small Molecule-Based Generation of Human Cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. Translation of Human-Induced Pluripotent Stem Cells: From Clinical Trial in a Dish to Precision Medicine. Journal of the American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).
- Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
- Kumar, A., Biebuyck, H. A., Whitesides, G. M. Patterning Self-Assembled Monolayers: Applications in Materials Science. Langmuir. 10 (5), 1498-1511 (1994).
- Wilbur, J. L., Kumar, A., Kim, E., Whitesides, G. M. Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials. 6 (7-8), 600-604 (1994).
- Théry, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. Journal of Cell Science. 123 (24), 4201-4213 (2010).
- Toepke, M. W., Beebe, D. J. PDMS absorption of small molecules and consequences in microfluidic applications. Lab on a Chip. 6 (12), 1484-1486 (2006).
- Seeger, T., et al. A Premature Termination Codon Mutation in MYBPC3 Causes Hypertrophic Cardiomyopathy via Chronic Activation of Nonsense-Mediated Decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
- Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
- Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature Protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Lee, S., Stanton, A. E., Tong, X., Yang, F. Hydrogels with enhanced protein conjugation efficiency reveal stiffness-induced YAP localization in stem cells depends on biochemical cues. Biomaterials. 202, 26-34 (2019).
- Théry, M., Pépin, A., Dressaire, E., Chen, Y., Bornens, M. Cell distribution of stress fibres in response to the geometry of the adhesive environment. Cell Motility. 63 (6), 341-355 (2006).
- Kilian, K. A., Bugarija, B., Lahn, B. T., Mrksich, M. Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (11), 4872-4877 (2010).
