Échantillonnage et analyse des signaux olfacteurs d’animaux
Summary
Nous avons développé une méthodologie efficace pour l’échantillonnage et l’analyse des signaux d’odeur afin de comprendre comment ils peuvent être utilisés dans la communication animale. En particulier, nous utilisons la microextraction en phase solide de l’espace de tête couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse pour analyser les composants volatils des odeurs animales et des marquages olfacteurs.
Abstract
Nous avons développé une méthodologie efficace pour l’échantillonnage et l’analyse des signaux d’odeur, en utilisant la microextraction en phase solide headspace couplée à la chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse, pour comprendre comment ils peuvent être utilisés dans la communication animale. Cette technique permet l’analyse semi-quantitative des composants volatils des sécrétions odorantes en permettant la séparation et l’identification provisoire des composants de l’échantillon, suivie de l’analyse des rapports de surface de pointe pour rechercher des tendances qui pourraient signifier des composés pouvant être impliqués dans la signalisation. Les principaux points forts de l’approche actuelle sont la gamme de types d’échantillons qui peuvent être analysés; l’absence de nécessité pour toute préparation ou extraction d’échantillons complexes; la capacité de séparer et d’analyser les composants d’un mélange; l’identification des composants détectés; et la capacité de fournir des renseignements semi-quantitatifs et potentiellement quantitatifs sur les composants détectés. La principale limite de la méthodologie concerne les échantillons eux-mêmes. Étant donné que les composants d’intérêt particulier sont volatils et qu’ils pourraient facilement être perdus ou leurs concentrations modifiées, il est important que les échantillons soient stockés et transportés de manière appropriée après leur prélèvement. Cela signifie également que les conditions de stockage et de transport des échantillons sont relativement coûteuses. Cette méthode peut être appliquée à une variété d’échantillons (y compris l’urine, les matières fécales, les cheveux et les sécrétions d’odeurs odorantes). Ces odeurs sont constituées de mélanges complexes, se produisant dans une gamme de matrices, et nécessitent donc l’utilisation de techniques pour séparer les composants individuels et extraire les composés d’intérêt biologique.
Introduction
On sait très peu de choses sur les changements chimiques qui sous-tendent les signaux olfactifs chez les animaux1,également en raison des défis méthodologiques dans l’enregistrement et la quantification des profils chimiques volatils des odeurs2. Il existe plusieurs pièges potentiels lorsque vous travaillez avec des matrices chimiques très complexes; ceux-ci incluent lors de l’échantillonnage et de l’analyse des échantillons d’odeur3.
Au Rosalind Franklin Science Center de l’Université de Wolverhampton, nous entreprenons l’analyse des odeurs et des marques olfactives pour comprendre comment elles peuvent être utilisées par les animaux. Nous combinons la semi-industrie avec l’écologie comportementale, l’endocrinologie et la cytologie pour améliorer notre compréhension du rôle joué par les signaux olfactifs dans la communication animale.
Nous avons développé une méthodologie, puis analysé les odeurs et les marques d’une variété d’espèces, y compris plusieurs primates non humains (c.-à-d. lémuriens couronnés, lémuriens à collerette rouge, macaques japonais, babouins olives, chimpanzés) et d’autres mammifères (c.-à-d. chats, vaches). Nous avons recueilli et analysé une variété d’échantillons, y compris l’urine, les matières fécales, les cheveux et les sécrétions d’odeurs odorantes. Ces odeurs et marques olfactives sont constituées de mélanges complexes de composés et, par conséquent, toute méthodologie utilisée pour leur analyse doit inclure une certaine forme de technique de séparation. Comme illustré, ils se produisent également dans une gamme de matrices qui nécessite l’utilisation de techniques pour extraire les composants d’intérêt.
Des études antérieures de Vaglio et coll.4 et d’autres auteurs5 ont utilisé l’extraction dynamique de l’espace libre (DHS) avec chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse (GC-MS), tandis que l’extraction directe par solvant6 et les extractions complexes par solvant7 ont également été utilisées. En particulier, l’échantillonnage dynamique de l’espace libre implique la purge de l’espace libre avec un volume connu de gaz inerte qui élimine finalement tous les composés volatils à l’exception de ceux montrant une forte affinité pour la matrice de l’échantillon (par exemple, les composés polaires dans les échantillons aqueux).
Pour la méthodologie actuelle, nous avons adopté la technique de la microextraction en phase solide headspace (HS-SPME) couplée à la GC-MS. En particulier, nous avons développé et amélioré la méthodologie déjà utilisée par Vaglio et al. dans son précédent laboratoire GC-MS8,9,10.
Les techniques d’extraction sans solvant sont très efficaces pour analyser de petits composés hautement volatils (qui autrement peuvent être facilement perdus d’un échantillon) car ces méthodes immobilisent les composés sur un support en phase solide et stable. Le HS-SPME utilise une fibre recouverte d’un polymère adsorbant pour capter les composés volatils dans l’espace libre de l’échantillon ou pour extraire des composés dissous par immersion dans un fluide biologique aqueux11. Le revêtement polymère ne lie pas fortement les composés, donc en chauffant dans le port d’injection du GC, ils peuvent être éliminés. Cette méthode est plus puissante que les techniques d’extraction par solvant et aussi plus efficace que le DHS.
Dans l’approche actuelle, les échantillons sont contenus dans des flacons en verre. Ces flacons sont réchauffés à une température de 40 °C pour simuler la température corporelle de l’animal afin de favoriser les composants volatils de la marque olflée pour occuper l’espace de tête du flacon. Une fibre SPME, recouverte de 65 μm de matériau sorbant polydiméthylsiloxane/divinylbenzène (PDMS/DVB), est exposée à l’environnement de l’espace libre et les composants volatils de l’échantillon sont adsorbés sur la fibre. Lors du chauffage de la fibre dans le port d’entrée d’un GC-MS, les composants volatils sont désorbés de la fibre, puis séparés par le GC. Des modèles de fragmentation spectrale de masse sont obtenus pour chaque composant à l’aide de la MS. En comparant ces spectres de masse avec des bases de données spectrales de masse, il peut être possible d’identifier provisoirement les composants de la marque olfique. Grâce à l’utilisation d’un auto-échantillonneur, nous sommes en mesure d’analyser plusieurs échantillons par lots de manière cohérente.
Étant donné que chaque type de fibre SPME a une affinité différente avec les produits chimiques polaires, la fibre est généralement choisie en fonction de la polarité et / ou du poids moléculaire des composés chimiques cibles. De plus, les conditions de GC sont modifiées en fonction du type de colonne de GC et des caractéristiques des composés chimiques cibles.
Cette technique permet l’analyse semi-quantitative des composants volatils des marques olfactif en permettant la séparation et l’identification provisoire des composants de l’échantillon, suivie de l’analyse des rapports de surface de crête pour rechercher des tendances qui pourraient signifier des composants du marquage olfactif pouvant être impliqués dans la signalisation.
Les principales forces de l’approche actuelle sont les suivantes :
- Plage de types d’échantillons qui peuvent être analysés.
- Aucune préparation ou extraction d’échantillon complexe n’est requise.
- La possibilité d’analyser des composants volatils.
- La possibilité de séparer les composants d’un mélange.
- Pour pouvoir identifier les composants détectés.
- La capacité de fournir des informations semi-quantitatives et potentiellement quantitatives sur les composants détectés.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’utilisation d’échantillons témoins, qu’il s’agit de contrôles environnementaux créés au moment du prélèvement d’échantillons ou de blancs du système, est cruciale pour l’interprétation des échantillons de marque olfécente. Tous les pics attribués à l’environnement d’échantillonnage ou au système instrumental doivent être exclus des échantillons de marques olfactuelles afin que seuls les pics d’intérêt soient inclus dans toute interprétation. Ces contrôles peuvent également jouer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Keith Holding pour son aide dans les analyses chimiques au Rosalind Franklin Science Center, Wolverhampton, et Ben Mantle pour la production de la vidéo. Nous sommes également reconnaissants au Professeur Gloriano Moneti, au Dr Giuseppe Pieraccini et aux membres du Centre de spectrométrie de masse de l’Université de Florence, à Florence, ainsi qu’au Prof. Luca Calamai et au Dr Marco Michelozzi du Laboratoire ARCA du CNR, Florence, pour leur aide dans la mise en place de cette méthodologie. Les projets de recherche qui comprenaient les méthodes d’échantillonnage et d’analyse décrites dans le manuscrit ont été soutenus par deux bourses intra-européennes Marie Skłodowska-Curie (identifiants de convention de subvention: 327083, 703611), une petite subvention(« The sensory enriched primate »)de la Primate Society of Great Britain et une petite bourse de recherche(« Do hunter-gatherers have a special sense of smell? »)de la British Academy/The Leverhulme Trust à S.V. Les travaux de laboratoire nécessaires à la mise en place de cette méthodologie ont également reçu un financement du concours annuel de financement de la Faculté des sciences et du génie (Wolverhampton) à S.V.
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
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- Heymann, E. W. The neglected sense-olfaction in primate behavior, ecology, and evolution. American Journal of Primatology. 68 (6), 519-524 (2006).
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