नमूना और पशु खुशबू संकेतों का विश्लेषण
Summary
हमने गंध संकेतों के नमूने और विश्लेषण के लिए एक प्रभावी पद्धति विकसित की है ताकि यह समझा जा सके कि उनका उपयोग पशु संचार में कैसे किया जा सकता है। विशेष रूप से, हम पशु गंध और सुगंध-चिह्नों के अस्थिर घटकों का विश्लेषण करने के लिए गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन का उपयोग करते हैं।
Abstract
हमने गंध संकेतों के नमूने और विश्लेषण के लिए एक प्रभावी पद्धति विकसित की है, हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन का उपयोग करके गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ मिलकर, यह समझने के लिए कि उनका उपयोग पशु संचार में कैसे किया जा सकता है। यह तकनीक नमूने में घटकों की पृथक्करण और अस्थायी पहचान को सक्षम करके गंध स्राव के अस्थिर घटकों के अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है, जिसके बाद पीक क्षेत्र अनुपात के विश्लेषण के बाद उन रुझानों की तलाश की जाती है जो संकेत में शामिल यौगिकों को दर्शाता है। इस वर्तमान दृष्टिकोण की प्रमुख ताकत नमूना प्रकारों की सीमा है जिसका विश्लेषण किया जा सकता है; किसी भी जटिल नमूना तैयारी या निष्कर्षण की आवश्यकता की कमी; मिश्रण के घटकों को अलग करने और विश्लेषण करने की क्षमता; पता चला घटकों की पहचान; और पता लगाया घटकों पर अर्द्ध मात्रात्मक और संभावित मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने की क्षमता । कार्यप्रणाली की मुख्य सीमा स्वयं नमूनों से संबंधित है। चूंकि विशिष्ट रुचि के घटक अस्थिर हैं, और इन्हें आसानी से खो दिया जा सकता है, या उनकी सांद्रता बदल जाती है, यह महत्वपूर्ण है कि नमूनों को उनके संग्रह के बाद उचित रूप से संग्रहीत और ले जाया जाता है। इसका मतलब यह भी है कि नमूना भंडारण और परिवहन की स्थिति अपेक्षाकृत महंगी है । इस विधि के नमूनों की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है (मूत्र, मल, बाल और खुशबू ग्रंथि गंध स्राव सहित) । इन गंधों में जटिल मिश्रण होते हैं, जो मैट्रिस की एक श्रृंखला में होते हैं, और इस प्रकार व्यक्तिगत घटकों को अलग करने और जैविक ब्याज के यौगिकों को निकालने के लिए तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है।
Introduction
जानवरों में घ्राण संकेतों को रेखांकित करने वाले रासायनिक परिवर्तनों के बारे में बहुत कम जानकारी है1, गंध2के अस्थिर रासायनिक प्रोफाइल को रिकॉर्ड करने और मात्रा में पद्धतिगत चुनौतियों के कारण भी । अत्यधिक जटिल, रासायनिक मैट्रिस के साथ काम करते समय कई संभावित नुकसान होते हैं; ये शामिल है जब नमूना और गंध नमूने का विश्लेषण3.
रोसालिंद फ्रैंकलिन साइंस सेंटर, यूनिवर्सिटी ऑफ वुल्वरहैम्पटन में, हम गंध और खुशबू के विश्लेषण-अंकों को यह समझने के लिए उपक्रम कर रहे हैं कि उनका उपयोग जानवरों द्वारा कैसे किया जा सकता है। हम पशु संचार में घ्राण संकेतों द्वारा निभाई गई भूमिका की हमारी समझ में सुधार करने के लिए व्यवहार पारिस्थितिकी, एंडोक्राइनोलॉजी और साइटोलॉजी के साथ अर्धविज्ञान को जोड़ते हैं।
हमने एक पद्धति विकसित की है और फिर कई गैर-मानव वानरों (यानी, ताज पहनाया लेमर, लाल-रफ्ड लेमर, जापानी मकाक, जैतून लंगूर, चिंपांजी) और अन्य स्तनधारियों (यानी बिल्लियों, गायों) सहित विभिन्न प्रजातियों से गंध और चिह्नों का विश्लेषण किया है। हमने मूत्र, मल, बाल और सुगंध-ग्रंथि गंध स्राव सहित विभिन्न नमूनों को एकत्र और विश्लेषण किया है। इन गंधों और खुशबू के निशान यौगिकों के जटिल मिश्रण से मिलकर बनता है और इसलिए किसी भी उनके विश्लेषण के लिए इस्तेमाल की पद्धति को विभाजक तकनीक के कुछ फार्म शामिल करने की जरूरत है । जैसा कि सचित्र है, वे मैट्रिस की एक श्रृंखला में भी होते हैं जो ब्याज के घटकों को निकालने के लिए तकनीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है।
Vaglio एट अल द्वारा पिछले अध्ययन4 और अन्य लेखकों5 गैस क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-एमएस) के साथ गतिशील हेडस्पेस निष्कर्षण (DHS) का इस्तेमाल किया, जबकि प्रत्यक्ष विलायक निष्कर्षण6 और जटिल विलायक निष्कर्षण7 भी इस्तेमाल किया गया है । विशेष रूप से, गतिशील हेडस्पेस नमूने में निष्क्रिय गैस की एक ज्ञात मात्रा के साथ हेडस्पेस को शुद्ध करना शामिल है जो अंततः नमूना मैट्रिक्स के लिए एक मजबूत आत्मीयता दिखाने वालों के अपवाद के साथ सभी अस्थिर यौगिकों को हटा देता है (उदाहरण के लिए, जलीय नमूनों में ध्रुवीय यौगिक)।
वर्तमान कार्यप्रणाली के लिए, हमने जीसी-एमएस के साथ मिलकर हेडस्पेस सॉलिड-फेज माइक्रोएक्सट्रैक्शन (एचएस-एसपीएमई) की तकनीक अपनाई है। विशेष रूप से, हमने अपनी पिछली जीसी-एमएस प्रयोगशाला8,9,10में वग्लिओ एट अल द्वारा पहले से ही उपयोग की जाने वाली पद्धति को विकसित और बढ़ाया है।
सॉल्वैंटलेस निष्कर्षण तकनीक छोटे, अत्यधिक अस्थिर यौगिकों (जो अन्यथा एक नमूने से आसानी से खो सकती हैं) का विश्लेषण करने के लिए बहुत प्रभावी हैं क्योंकि ये विधियां एक स्थिर, ठोस चरण समर्थन पर यौगिकों को स्थिर करती हैं। एचएस-एसपीएमई नमूना हेडस्पेस में अस्थिर यौगिकों को पकड़ने या जलीय जैविक तरल पदार्थ11में विसर्जन द्वारा भंग यौगिकों को निकालने के लिए एक एसोरबेंट बहुलक के साथ लेपित फाइबर का उपयोग करता है। बहुलक कोटिंग यौगिकों को दृढ़ता से बांधती नहीं है, इसलिए जीसी के इंजेक्शन बंदरगाह में गर्म करके उन्हें हटाया जा सकता है। यह विधि विलायक निष्कर्षण तकनीकों की तुलना में अधिक शक्तिशाली है और डीएचएस की तुलना में अधिक प्रभावी भी है।
वर्तमान दृष्टिकोण नमूनों में कांच की शीशियों के भीतर निहित हैं। इन शीशियों को 40 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर गर्म किया जाता है ताकि जानवरों के शरीर के तापमान को अनुकरण किया जा सके ताकि शीशी के सिर-स्थान पर कब्जा करने के लिए सुगंध-निशान के अस्थिर घटकों को बढ़ावा दिया जा सके। एक एसपीएमई फाइबर, पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन/डिविनिलबेनजेन (पीडीएमएस/डीवीबी) शर्बत सामग्री के 65 माइक्रोन के साथ लेपित, हेडस्पेस पर्यावरण के संपर्क में है और नमूने से अस्थिर घटकों को फाइबर पर सोख रहे हैं। जीसी-एमएस के इनलेट पोर्ट में फाइबर को गर्म करने पर, अस्थिर घटकों को फाइबर से अलग किया जाता है और फिर जीसी द्वारा अलग किया जाता है। एमएस का उपयोग करके प्रत्येक घटक के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रल विखंडन पैटर्न प्राप्त किए जाते हैं। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रल डेटाबेस के खिलाफ इन द्रव्यमान स्पेक्ट्रा की तुलना करके, सुगंध-चिह्न के घटकों को अंतरिम रूप से पहचानना संभव हो सकता है। एक ऑटो-पारखी के उपयोग के माध्यम से, हम लगातार तरीके से बैचों में कई नमूनों का विश्लेषण करने में सक्षम हैं।
यह देखते हुए कि प्रत्येक प्रकार के एसपीएमई फाइबर में ध्रुवीय रसायनों के साथ एक अलग आत्मीयता होती है, फाइबर को आमतौर पर ध्रुवीयता और/या लक्ष्य रासायनिक यौगिकों के आणविक वजन के आधार पर चुना जाता है । इसके अलावा, जीसी की स्थिति जीसी कॉलम के प्रकार और लक्ष्य रासायनिक यौगिकों की विशेषताओं के आधार पर बदल रहे हैं ।
यह तकनीक नमूने में घटकों की पृथक्करण और अस्थायी पहचान को सक्षम करके सुगंध-चिह्नों के अस्थिर घटकों के अर्ध-मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देती है, जिसके बाद पीक एरिया अनुपात के विश्लेषण के बाद उन रुझानों की तलाश की जाती है जो संकेत देने में शामिल होने वाले सुगंध-अंकन के घटकों को दर्शाता है।
इस वर्तमान दृष्टिकोण की प्रमुख ताकत हैं:
- नमूना प्रकारों की सीमा जिसका विश्लेषण किया जा सकता है।
- कोई जटिल नमूना तैयार करने या निष्कर्षण की आवश्यकता नहीं है।
- अस्थिर घटकों का विश्लेषण करने की क्षमता।
- मिश्रण के घटकों को अलग करने की क्षमता।
- पता लगाया घटकों की पहचान करने में सक्षम होना।
- पता लगाया घटकों पर अर्द्ध मात्रात्मक और संभावित मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने की क्षमता।
Protocol
Representative Results
Discussion
नियंत्रण नमूनों का उपयोग, नमूना संग्रह और सिस्टम रिक्त स्थान के समय बनाए गए दोनों पर्यावरणीय नियंत्रण, सुगंध-चिह्न नमूनों की व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण हैं। नमूना पर्यावरण या वाद्य प्रणाली के लिए जि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम वीडियो के उत्पादन के लिए Rosalind फ्रैंकलिन विज्ञान केंद्र, Wolverhampton, और बेन मेंटल में रासायनिक विश्लेषण के साथ उनकी सहायता के लिए कीथ होल्डिंग शुक्रिया अदा करते हैं । हम प्रो ग्लोरियानो मोनेटी, डॉ जूसेपे पियरासिनी और फ्लोरेंस विश्वविद्यालय के मास स्पेक्ट्रोमेट्री सेंटर, फ्लोरेंस के सदस्यों और सीएनआर की एआरए लैब, फ्लोरेंस के प्रो लुका कैलामाई और डॉ मार्को मिशेलोज्जी के भी आभारी हैं, इस पद्धति को स्थापित करने में उनकी मदद के लिए। अनुसंधान परियोजनाओं में पांडुलिपि में वर्णित नमूना और विश्लेषण विधियों को दो मैरी Skłodowska-क्यूरी इंट्रा यूरोपीय फैलोशिप (अनुदान समझौते की IDS: 327083, 703611), ग्रेट ब्रिटेन के रहनुमा सोसायटी से एक छोटा सा अनुदान (‘संवेदी समृद्ध रहनुमा‘) द्वारा समर्थित किया गया था, और एक छोटे से अनुसंधान अनुदान (‘क्या शिकारी-संग्रहकर्ताओं गंध की एक विशेष भावना है?‘) ब्रिटिश अकादमी/लीवरहुमे ट्रस्ट से एसवी तक इस पद्धति को स्थापित करने के लिए आवश्यक प्रयोगशाला कार्य को विज्ञान और इंजीनियरिंग की वार्षिक वित्तपोषण प्रतियोगिता (Wolverhampton) के संकाय से एसवी के लिए धन भी प्राप्त हुआ ।
Materials
| 10 mL autosampler vials | Agilent | 5188-5392 | 10 ml screwtop vials with |
| 18 mm vial caps | Agilent | 8010-0139 | Magnetic with PTFE/silicone septa |
| Autosampler | Agilent | GC120 PAL autosampler | |
| Capillary column | Agilent | HP5-MS | 30 m x 0.25 mm; 0.25 µm |
| Data analysis software | Agilent | – | ChemStation |
| Gas Chromatograph | Agilent | 7890B | |
| Inlet septa | Agilent | 5182-3442 | Merlin microseal |
| Mass Selective Detector | Agilent | 5977A | |
| Reporting software | Microsoft | – | Excel |
| Spectral library | NIST | – | NIST/EPA/NIH Mass Spectral Library |
| Spectral library search program | NIST | – | MS Search v.2.2 |
| Splitless Inlet liner | Agilent | 5190-4048 | |
| SPME fibres | Agilent | SU57345U | 65 µm PDMS/DVB fibre |
References
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