JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

Пользовательская многофотонная микроскопическая платформа для живого изображения мыши Корнеа и Конъюнктивы

Published: May 17, 2020
doi:
10.3791/60944
, , , ,
1Department of Biomedical Engineering,National Taiwan University, 2Institute of Pharmacology, College of Medicine,National Taiwan University, 3Molecular Imaging Center,National Taiwan University, 4Department of Dermatology,National Taiwan University Hospital, and College of Medicine, 5Research Center for Developmental Biology and Regenerative Medicine,National Taiwan University, 6Department of Ophthalmology,Chang Gung Memorial Hospital, 7College of Medicine,Chang Gung University

Summary

Здесь представлена многофотонная микроскопическая платформа для визуализации глазной поверхности живой мыши. Флуоресцентная трансгенная мышь обеспечивает визуализацию ядер клеток, клеточных мембран, нервных волокон и капилляров в глазной поверхности. Нелинейные сигналы второго гармонического поколения, полученные из коллагеновых структур, обеспечивают безымянные изображения для стромальных архитектур.

Abstract

Обычный гистологический анализ и системы клеточной культуры недостаточны для полного моделирования физиологической и патологической динамики in vivo. Мультифотонная микроскопия (MPM) стала одним из самых популярных методов визуализации биомедицинских исследований на клеточном уровне in vivo, преимущества включают высокое разрешение, глубокое проникновение тканей и минимальную фототоксичность. Мы разработали платформу MPM изображений с индивидуальным держателем глаз мыши и стереотаксис этап для изображения глазной поверхности in vivo. Двойной флуоресцентный белок репортер мыши позволяет визуализировать ядра клеток, клеточные мембраны, нервные волокна и капилляры в глазной поверхности. В дополнение к многофотонным сигналам флуоресценции, приобретение второго гармонического поколения (SHG) одновременно позволяет характеристику коллагеновой стромальной архитектуры. Эта платформа может быть использована для интравитальной визуализации с точным позиционированием по всей глазной поверхности, включая роговицу и конъюнктиву.

Introduction

Структуры глазной поверхности, включая роговицу и конъюнктиву, защищают другие более глубокие глазные ткани от внешних нарушений. Роговица, прозрачная передняя часть глаза, функционирует как рефракционная линза для направления света в глаз, так и в качестве защитного барьера. Эпителий роговицы является внешним слоем роговицы и состоит из различных слоев поверхностных клеток, клеток крыла и базальных клеток. Корнеальная строма состоит из сложно упакованных коллагеновых ламелл, встроенных в кератоциты. Корнеловый эндотелий, один слой плоских шестиугольных клеток, играет важную роль в поддержании прозрачности роговицы, сохраняя строму роговицы в относительно обезвоженном состоянии через свои насосныефункции 1. Лимбус образует границу между роговицей и конъюнктивой, и является резервуаром эпителиальных стволовых клеток роговицы2. Высоко васкуляризованная конъюнктива помогает смазыть глаза, производя слизь и слезы3.

Клеточная динамика структур поверхности роговицы традиционно изучается либо гистологическим анализом, либо культурой клеток в пробирке, которые не могут адекватно имитировать динамику клеток in vivo. Таким образом, неинвазивный подход к живой визуализации может преодолеть такой разрыв. Благодаря своим преимуществам, которые включают высокое разрешение, минимальный фотопамаж и более глубокую глубину изображения, MPM стал мощным условием в различных областяхбиологических исследований 4,,5,,6,,7,,8. Для визуализации роговицы, MPM предоставляет клеточную информацию из внутренней аутофторесценции, полученной из внутриклеточного NAD (P)H. Сигналы второго гармонического поколения (SHG), полученные из не-центросимметрических волокон I коллагена под фемтосекундным лазерным сканированием, обеспечивают коллагеновые стромальные структуры без дополнительных процедурокрашивания 9. Ранее мы и другие группы использовали MPM для визуализации роговицы животных и человека9,,10,,11,,12,,13,,14,,15.

Трансгенные линии мыши, экспонирующие флуоресцентные белки в конкретных популяциях клеток, широко используются для различных исследований в клеточной биологии, включая развитие, гомеостаз тканей, регенерацию тканей и канцерогенез. Мы использовали трансгенные штаммы мыши помечены флуоресцентными белками для in vivoизображения роговицы 9,10, волосяныефолликулы 10 и эпидермис10 по MPM. Двойной флуоресцентный штамм мыши с клеточной мембраной, помеченной tdTomato и ядром клетки с тегами EGFP, выведен из двух штаммов мыши: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sortm1Ytchn/J,#021847)16 и mT-mG (Gt(ROSA26)ACTB-tdTomato-EGFP, #007676)17. R26R-GR трансгенная линия мыши содержит двойной флуоресцентный белок репортер конструкций, в том числе гена синтеза H2B-EGFP и mCherry-GPI якорный ген синтеза сигнала, вставленный в gt (ROSA)26Sor локус. Трансгенный штамм mT-mG является клеточной мембраной tdTomato и EGFP флуоресцентных мышей Cre-репортер. До рекомбинации Cre белок клеточной мембраны с экспрессией флуоресценции tdTomato широко присутствует в различных клетках. Этот трансгенный штамм мыши позволяет нам визуализировать ядра-EGFP и мембраны с tdTomato без возбуждения Cre. Две самки (R26R-GR)и один самец (mT-mG) трансгеннаямышь были выведены вместе, чтобы произвести достаточно мышей для экспериментов. Их потомство с R26R-GRq/-;mT-mGq/- генотип, двойной флуоресцентный штамм мышей, были использованы в этом исследовании. По сравнению с одной флуоресцентной линиимыши репортера, как описано ранее 9,10, это двойное флуоресцентное напряжение мыши репортер дает нам 50% сокращение приобретения изображений времени.

В этой работе мы описываем подробный технический протокол для виво-изображения глазной поверхности шаг за шагом с помощью нашей платформы визуализации и двойных флуоресцентных трансгенных мышей.

Protocol

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с процедурами, утвержденными Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) Национального университета Тайваня и Мемориальной больницы Чан Гун. 1. Установка мультифотонной микроскопии …

Representative Results

Используя эту живую платформу визуализации, мышь глазной поверхности могут быть визуализированы на клеточном уровне. Для визуализации отдельных одиночных клеток на глазной поверхности мы использовали двойных флуоресцентных трансгенных мышей с EGFP, выраженными в ядре и tdTomato, выраженн?…

Discussion

Эта специально построенная платформа MPM изображений с программным обеспечением управления была использована для интравитальной визуализации эпителиальных органов мыши, включаякожу 10,волосяной фолликул 10 иглазную поверхность 9,10…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Благодарим Министерство науки и технологий Тайваня (106-2627-M-002-034, 107-2314-B-182A-089, 108-2628-B-002-023, 108-2628-B-002-023), Национальная университетская больница Тайваня (NTUH108-T17) и Мемориальный госпиталь Чан Гун, Тайвань (CMRPG3G1621, CMRPG3G1622, CMRPG3G1623).

Materials

AVIZO Lite software Thermo Fisher Scientific Version: 2019.3.0
Bandpass filters Semrock FF01-434/17
FF01-500/24
FF01-585/40
Dichroic mirrors Semrock FF495-Di01-25×36 FF580-Di01-25×36
Galvano Thorlabs GVS002
Jade BIO control software SouthPort Corporation Jade BIO
Oxybuprocaine hydrochloride Sigma O0270000
PMT Hamamatsu H7422A-40
Polyesthylene Tube BECTON DICKINSON 427401
Stereotaxic mouse holder Step Technology Co.,Ltd 000111
Ti: Sapphire laser Spectra-Physics Mai-Tai DeepSee
Upright microscopy Olympus BX51WI
Vidisic Gel Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH D13581
Zoletil Virbac VR-2831
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  2. Van Buskirk, E. M. The anatomy of the limbus. Eye (London). 3, 101-108 (1989).
  3. Hodges, R. R., Dartt, D. A. Tear film mucins: front line defenders of the ocular surface; comparison with airway and gastrointestinal tract mucins. Experimental Eye Research. 117, 62-78 (2013).
  4. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation imaging of the structural alterations in keratoconus ex vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 47 (12), 5251-5259 (2006).
  5. Konig, K. Multiphoton microscopy in life sciences. Journal of Microscopy. 200, 83-104 (2000).
  6. Rompolas, P., et al. Spatiotemporal coordination of stem cell commitment during epidermal homeostasis. Science. 352 (6292), 1471-1474 (2016).
  7. Park, S., et al. Tissue-scale coordination of cellular behaviour promotes epidermal wound repair in live mice. Nature Cell Biology. 19 (2), 155-163 (2017).
  8. Xin, T., Gonzalez, D., Rompolas, P., Greco, V. Flexible fate determination ensures robust differentiation in the hair follicle. Nature Cell Biology. 20 (12), 1361-1369 (2018).
  9. Wu, Y. F., et al. Intravital multiphoton microscopic imaging platform for ocular surface imaging. Experimental Eye Research. 182, 194-201 (2019).
  10. Wu, Y. F., Tan, H. Y., Lin, S. J. Long-Term Intravital Imaging of the Cornea, Skin, and Hair Follicle by Multiphoton Microscope. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  11. Lo, W., et al. Fast Fourier transform-based analysis of second-harmonic generation image in keratoconic cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 3501-3507 (2012).
  12. Tan, H. Y., et al. Multiphoton fluorescence and second harmonic generation microscopy for imaging infectious keratitis. Journal of Biomedical Optics. 12 (2), 024013 (2007).
  13. Jester, J. V., et al. Four-dimensional multiphoton confocal microscopy: the new frontier in cellular imaging. Oculur Surface. 2 (1), 10-20 (2004).
  14. Morishige, N., et al. Second-harmonic imaging microscopy of normal human and keratoconus cornea. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (3), 1087-1094 (2007).
  15. Hao, M., et al. In vivo non-linear optical (NLO) imaging in live rabbit eyes using the Heidelberg Two-Photon Laser Ophthalmoscope. Experimental Eye Research. 91 (2), 308-314 (2010).
  16. Chen, Y. T., et al. R26R-GR: a Cre-activable dual fluorescent protein reporter mouse. PLoS One. 7 (9), 46171 (2012).
  17. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  18. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  19. Masihzadeh, O., Lei, T. C., Ammar, D. A., Kahook, M. Y., Gibson, E. A. A multiphoton microscope platform for imaging the mouse eye. Molecular Vision. 18, 1840-1848 (2012).
  20. Zhang, H., et al. Two-photon imaging of the cornea visualized in the living mouse using vital dyes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6526-6536 (2013).
  21. Lee, J. H., et al. Comparison of confocal microscopy and two-photon microscopy in mouse cornea in vivo. Experimental Eye Research. 132, 101-108 (2015).
  22. Ehmke, T., et al. In vivo nonlinear imaging of corneal structures with special focus on BALB/c and streptozotocin-diabetic Thy1-YFP mice. Experimental Eye Research. 146, 137-144 (2016).
  23. Webster, M. T., Manor, U., Lippincott-Schwartz, J., Fan, C. M. Intravital Imaging Reveals Ghost Fibers as Architectural Units Guiding Myogenic Progenitors during Regeneration. Cell Stem Cell. 18 (2), 243-252 (2016).
  24. Mesa, K. R., et al. Homeostatic Epidermal Stem Cell Self-Renewal Is Driven by Local Differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  25. Goh, C. C., et al. Real-time imaging of dendritic cell responses to sterile tissue injury. Journal of Investigative Dermatology. 135 (4), 1181-1184 (2015).
  26. Kissenpfennig, A., et al. Dynamics and function of Langerhans cells in vivo: dermal dendritic cells colonize lymph node areas distinct from slower migrating Langerhans cells. Immunity. 22 (5), 643-654 (2005).
  27. Chow, Z., Mueller, S. N., Deane, J. A., Hickey, M. J. Dermal regulatory T cells display distinct migratory behavior that is modulated during adaptive and innate inflammation. Journal of Immunology. 191 (6), 3049-3056 (2013).
  28. Dudeck, A., et al. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34 (6), 973-984 (2011).

Tags

Multiphoton MicroscopyLive ImagingMouse CorneaMouse ConjunctivaDual Fluorescent Transgenic MouseEGFPTdTomatoSHGStereotaxic Mouse HolderEyelid RetractionEye GelZ-stack Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wu, Y., Ye, R., Pan, M., Lin, S., Tan, H. A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva. J. Vis. Exp. (159), e60944, doi:10.3791/60944 (2020).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image