Summary
الموصوف هنا هو إجراء مجسمة التي يمكن أن تستهدف مناطق الدماغ الصعبة ويصعب الوصول إليها (بسبب القيود المكانية) باستخدام نهج تاجي الزاوية. هذا البروتوكول قابل للتكيف مع كل من نماذج الماوس والجرذان ويمكن تطبيقه على التطبيقات العصبية العلمية المتنوعة ، بما في ذلك زرع القنية والحواس الدقيقة للبنى الفيروسية.
Abstract
الجراحة المجسمة هي أداة أساسية في مختبر علم الأعصاب الحديث. ومع ذلك، فإن القدرة على استهداف مناطق الدماغ التي يصعب الوصول إليها بدقة ودقة لا تزال تمثل تحديا، لا سيما عند استهداف هياكل الدماغ على طول الخط الوسطي. وتشمل هذه التحديات تجنب الجيوب الأنفية القوس متفوقة والبطين الثالث والقدرة على استهداف باستمرار نوى الدماغ انتقائية ومنفصلة. بالإضافة إلى ذلك، تعتمد تقنيات علم الأعصاب الأكثر تقدما (مثل علم الوراثة البصرية، وقياس الألياف الضوئية، والتصوير بالفوتونين) على الزرع المستهدف للأجهزة الهامة في الدماغ، والقيود المكانية هي عائق شائع. يقدم هنا بروتوكول قابل للتعديل للاستهداف المجسم لهياكل دماغ القوارض باستخدام نهج إكليلي بزاوية. ويمكن تكييفها إلى 1) نماذج الماوس أو الفئران، 2) تقنيات علم الأعصاب المختلفة، و 3) مناطق الدماغ متعددة. وكمثال تمثيلي، يتضمن حساب الإحداثيات المجسمة لاستهداف نواة التندرومية تحت المهاد للفأرة (VMN) لتجربة تثبيط البصرية. يبدأ هذا الإجراء بالاقتصاص الدقيق الثنائي لفيروس مرتبط بال أدينو (AAV) ترميز قناة كلوريد حساسة للضوء (SwiChR ++) إلى نموذج الماوس المعتمد على Cre ، يليه زرع ثنائي الزاوية لقنية الألياف البصرية. باستخدام هذا النهج، تظهر النتائج أن تنشيط مجموعة فرعية من الخلايا العصبية VMN مطلوب للاستجابات المضادة للتنظيم الجلوكوز سليمة لنقص السكر في الدم الناجم عن الأنسولين.
Introduction
السيطرة العصبية للسلوك والتغذية والتمثيل الغذائي ينطوي على تنسيق معقدة للغاية، والتكاملية، ودوائر عصبية زائدة عن الحاجة. هدف القيادة في مجال علم الأعصاب هو تشريح العلاقة بين بنية الدائرة العصبية والوظيفة. على الرغم من أن أدوات علم الأعصاب الكلاسيكية (أي الآفات والحقن الدوائية المحلية والتحفيز الكهربائي) قد كشفت عن معرفة حيوية فيما يتعلق بدور مناطق الدماغ المحددة التي تتحكم في السلوك والتمثيل الغذائي ، إلا أن هذه الأدوات محدودة بسبب افتقارها إلى التحديد وقابلية التراجع1.
وقد حسنت التطورات الأخيرة في مجال علم الأعصاب إلى حد كبير القدرة على استجواب والتلاعب وظيفة الدائرة بطريقة محددة من نوع الخلية مع قرار كبير ملعقة الصدغية. على سبيل المثال، تسمح النهج2 و3 الكيميائية الجينية بالتلاعب السريع والناقض للنشاط في أنواع الخلايا المحددة وراثيا للحيوانات المتحركة بحرية. Optogenetics ينطوي على استخدام القنوات الأيونية الحساسة للضوء، و يطلق عليها channelrhodopsins، للسيطرة على نشاط الخلايا العصبية. مفتاح هذه التقنية هو تسليم الجينات من channelrhodopsin ومصدر للضوء لتنشيط الأوبسين. استراتيجية مشتركة لتسليم الجينات من خلال مزيج من 1) الفئران المعدلة وراثيا التعبير عن Cre-recombinase في الخلايا العصبية المنفصلة، و 2) ناقلات الفيروسية المعتمدة على الكر ترميز channelrhodopsin.
في حين أن optogenetics يوفر وسيلة أنيقة ودقيقة للغاية للسيطرة على نشاط الخلايا العصبية ، فإن هذه الطريقة تعتمد على التجميل المجسم الناجح للناقل الفيروسي ووضع الألياف البصرية في منطقة محددة في الدماغ. على الرغم من أن الإجراءات المجسمة شائعة داخل مختبر علم الأعصاب الحديث (وهناك العديد من البروتوكولات الممتازة التي تصف هذا الإجراء)4،5،6، أن تكون قادرة على استهداف مناطق الدماغ المنفصلة باستمرار وعلى نحو مستنسخ على طول الخط الوسطي (أي تحت المهاد المتوسط ، وهي منطقة دماغ حاسمة لتنظيم الوظائف المنزلية7)يمثل تحديات إضافية. وتشمل هذه التحديات تجنب الجيوب الأنفية القوس متفوقة, البطين الثالث, والنوى تحت المهاد المجاورة. وبالإضافة إلى ذلك، هناك قيود مكانية كبيرة لزرع ثنائي للأجهزة المطلوبة لدراسات تثبيط. مع وضع هذه التحديات في الاعتبار ، يقدم هذا البروتوكول هنا إجراء قابلا للتعديل لاستهداف مناطق الدماغ المنفصلة من خلال نهج مجسم بزاوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على جميع الإجراءات وفقا للمعاهد الوطنية للصحة، ودليل رعاية واستخدام الحيوانات، ووافقت عليها كل من اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها (IACUC) والصحة والسلامة البيئية في جامعة واشنطن.
1. حساب الإحداثيات الزاوية
- باستخدام أطلس الدماغ التاجي، ضع علامة على مثلث قائم بحيث يمر نقص التهام عبر المنطقة المستهدفة ذات الاهتمام. في المثال التمثيلي(الشكل 1)،يتم توجيه النواة البطنية تحت المهاد (VMN) بزاوية 15 درجة من خط الوسط الإكليلي.
ملاحظة: وضع محور الدوران الموضح في الشكل 1 (وبالتالي طول الجانب ج) هو وضع عشوائي ويمكن تعديله لاستهداف أي منطقة في الدماغ. على الرغم من أن هذا قد يبدو غير بديهي، فإن الخطوات اللاحقة في البروتوكول سوف تعدل موضع الرأس في المحور z بحيث تتماشى هذه النقطة مع مركز الدوران المجسم (انظر القسم 6). ومع ذلك ، يوصى بعدم تجاوز زاوية دوران تاجية 15 درجة بسبب القيود المادية لجهاز حامل الرأس. - قم بإنشاء الزاوية المطلوبة (أ) والطول المقدر للجانب B واستخدم علم المثلثات لحساب طول الجانبين A و C. هذه الخطوة مهمة لتحديد موضع الرأس بشكل صحيح أثناء الدوران.
ملاحظة: في المثال في الشكل 1، يتم استخدام خطوط الشبكة أطلس لتقريب طول الجانب B، مما ينتج عن طول 7.576 مم. يتم استخدام هذه المعلومات لحساب طول الجانب أ:
في هذا المثال، يشير 2.03 مم إلى مسافة R/L من خط الوسط الذي تدخل فيه قنية الألياف البصرية إلى الدماغ عندما يتم تدوير الرأس بمقدار 15 درجة.- اختياريا، حساب طول الجانب C لتقريب D/V الإحداثي:
ملاحظة: 1) طول hypotenuse (C) لا يمثل عمق الحقن ولكن سوف تكون مفيدة في تحديد احداثي D / V، والتي قد تحتاج إلى تعديل لاستيعاب لزيادة طول مقابل الجانب باء للحقن مباشرة في. لذلك يوصى بإجراء حقن الاختبار لتحسين تنسيق D/V. 2) في هذا المثال استهداف VMN، يتم الحصول على مجموعتين من الإحداثيات: واحدة للتحنيم الدقيق غير الزاوية (A/P = -1.4، R/L = 0.4 عند 0°، D/V = -5.7) وواحدة لزراعة الألياف البصرية الزاوية (A/P = -1.4، R/L = 0.0 عند 15 درجة، D/V = -5.4).
- اختياريا، حساب طول الجانب C لتقريب D/V الإحداثي:
2. إعداد ستريوتاكز لإجراء الزاوية
- تأكد من أن الإطار المجسم والميكرومانيبولاتور قد تمت معايرة (انظر دليل كوبف للبروتوكول الكامل).
- ضع مقياس الارتفاع المركزي في مأخذ لوحة قاعدة حامل الرأس.
- تأمين نطاق توسيط في حامل الأداة، ثم مشاهدة أسفل النطاق. ضبط موضع المايكرومايبوولاتور حتى يتم محاذاة مرمى وتركز على مرمى قياس.
ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، يتم وضع النطاق في المستوى البؤري لمركز دوران حامل الرأس. وبمجرد تأسيسها، لا ينبغي نقل المايكرومانيبواتيور خلال الخطوات المتبقية. - ضع قضبان الأذن في أصحابها ومركز لهم بحيث خطوط المؤشر على كلا الجانبين في 0(الشكل 3A).
- استخدم المقابض الوسطية الجانبية والخلفية الأمامية على حامل الرأس(الشكل 2)لمحاذاة قضبان الأذن في المستويات x و y فوق مرمى مقياس الارتفاع المركزي(الشكل 3A).
- لمحاذاة موضع شريط الأذن في المحور z، قم بإزالة قضبان الأذن من الحامل وإزالة مقياس ارتفاع الوسط. استبدال قضبان الأذن ومركز لهم مرة أخرى في 0.
- شاهد أسفل النطاق. استخدم مقبض التحول العمودي(الشكل 3B)ومقبض الإمالة الإكليلية، على التوالي، لخفض وتدوير قضبان الأذن حتى تظل مرمى النطاق مركزة بين قضبان الأذن طوال الدوران الإكليلي.
- يتم الآن معايرة ستيريوتاكز وجاهزة. لا تقم بإجراء أي تعديلات أخرى على وضع حامل الرأس.
3. إعداد المواد للحقن / زرع
- تأكد من تعقيم جميع الأدوات والأدوات الجراحية والمواد ووضعها في حقل جراحي معقم بجوار الضريبة المجسمة.
- التعامل مع وتخزين البنى الفيروسية وفقا لمستوى السلامة البيولوجية والمتطلبات التنظيمية المؤسسية ذات الصلة بالسلامة البيولوجية.
- وضع الفيروس في الحقنة ، مع الحرص على استخدام ممارسات المناولة المناسبة ومعدات الحماية الشخصية.
4. التخدير
- سجل وزن جسم الفأر قبل الجراحة.
- تخدير عميق الماوس باستخدام isoflurane.
- تأكد من تخدير الماوس بعمق من خلال إجراء اختبار قرصة إصبع القدم حتى تغيب الاستجابة المتكف. إذا استمر الحيوان في إظهار ردود فعل قوية ، فزيد من تركيز و / أو مدة التخدير.
- تطبيق مرهم العين على كل عين لإبقائها رطبة أثناء الجراحة.
- حلق فروة الرأس من خلف الأذنين مباشرة إلى خلف العينين بمقص شعر.
- تزويد الماوس مع مسكن IACUC المعتمدة.
- مراقبة الحيوان باستمرار طوال العملية الجراحية وتقديم الدعم الحراري.
5. إجراء العمليات الجراحية
- ضع الرأس في حامل الرأس عن طريق وضع القواطع العلوية في الفجوة في شريط اللدغة ، مع التأكد من أن اللسان تحت شريط اللدغة.
- قم بتأمين الرأس في قضبان الأذن عن طريق إدخال قضبان الأذن برفق في اللحم السمعي الخارجي، مع ضمان وضع قضبان الأذن بشكل متناظر (عادة بين ثلاثة وأربعة لفأر بالغ). هذه الخطوة حاسمة لضمان أن الرأس مستقرة وتتركز على التناوب.
- إعداد منطقة شق حلق بالتناوب مع ثلاث الدعك من بيتادين ومسحات الكحول، أو مع بديل إعداد الموقع الجراحية المعتمدة مؤسسيا.
- ضع ستارة جراحية على الحيوان للحفاظ على حقل جراحي معقم وتقليل خطر العدوى بعد الجراحة.
- كشف الجمجمة عن طريق إجراء شق على طول خط الوسط القوسي من فروة الرأس. كشط بلطف سطح الجمجمة لإزالة أي اللفافة وفضح الغرز.
ملاحظة: إذا كان من الصعب تصور خطوط الغرز، يمكن تطبيق بيروكسيد الهيدروجين على الجمجمة باستخدام قضيب معقم يميل إلى القطن لتحسين التصور خياطة. - وضع نطاق توسيط في حامل ووسط مرمى على bregma(الشكل 4، لوحة اليسار). صفر المايكرومانيبواتور.
- نقل مرمى caudally إلى لامبدا، مشيرا إلى المسافة bregma-lambda (B-L).
ملاحظة: إذا خطوط خياطة لا تتبع خط مستقيم على طول خط الوسط، فمن المستحسن إنشاء خط الوسط باستخدام "خط من أفضل تناسب" من خلال كل من bregma و lambda. ومع ذلك، إذا تم اتباع الخطوات المذكورة أعلاه، يجب أن يكون الموضع الأولي للنطاق الشبكي في منتصف الطريق بين قضبان الأذن وقريبة من خياطة خط الوسط B-L. - إذا كانت المسافة B-L أقل أو أكبر بكثير من 4.21 مم، قم بتعديل البريغما المعينة تدريجيا للحصول على مسافة B-L من 4.21 مم ± 0.2 مم.
- استبدل نطاق التوسيط بمؤشر المحاذاة. وضع المسابير على لامبدا وbregma وضبط مقبض الميل الظهري على حامل الرأس إلى مستوى في الطائرة القوس (الأنف التي تواجه صعودا أو أسفل)، ثم استخدام نطاق مركزة لإعادة تعيين bregma.
- استخدم مؤشر المحاذاة إلى مستوى في المستوى التاجي باستخدام مقبض الميل التاجي. قياس في نقاط متعددة في جميع أنحاء المحور الوردي / caudal لحساب التشوهات السطحية في الجمجمة.
- لاحظ الموضع على قرص مقبض الميل الإكليلي، حيث أن هذا هو موضع الدوران 0°.
6. محاذاة المحاور المركزية للدوران للإحداثيات الزاوية
- تأمين نطاق توسيط في حامل الأداة ووضع micromanipulator إلى تنسيق محسوب من القسم 1. لاحظ أن تنسيق R/L للزرع الزاوية يتوافق مع طول الجانب A.
- في المثال في الشكل 1، تكون الإحداثيات الزاوية لوضع الألياف البصرية التي تستهدف VMN (A / P = -1.4 ، R / L = [2.03] عند دوران إكليلي 0 ° ، [0.00] عند دوران إكليلي 15 درجة ، D / V = -5.4).
- رؤية أسفل النطاق ووضع علامة على هذا التنسيق (R/L 2.03 مم من خط الوسط لكل مثال VMN; الشكل 4، لوحة الأوسط). تمثل هذه العلامة النقطة التي تدخل فيها القنية الدماغ بمجرد تدوير الرأس.
- قم بتغيير موضع الميكروماينيبوالاتور عبر خط الوسط (R/L = 0.00). استخدم مقبض الميل الإكليلي لتدوير الرأس إلى الزاوية المحسوبة في القسم 1.
- إذا كانت خطوط النطاق المتقاطعة تصطف بالفعل مع العلامة، انتقل إلى القسم 7.
- إذا لم تصطف مرمى النطاق مع العلامة المرجعية، فاضبط موضع الرأس في المحور z باستخدام مقبض التحول الرأسي(الشكل 2)حتى خط الشعيرات المتصالبة لأعلى أقرب ما يمكن إلى العلامة.
- تدوير الرأس مرة أخرى إلى موقف 0 درجة التاجية. إذا تم تعديل الإزاحة العمودية في الخطوة 6.3، إعادة تعيين bregma باستخدام نطاق توسيط.
- كرر الخطوتين 6.3 و 6.4 حتى تصل الشعيرات باستمرار إلى العلامة المرجعية عند تدوير الرأس(الشكل 4C).
- وفي هذه المرحلة، ينبغي الآن مواءمة نقطة الدوران التعسفية التي أنشئت في الباب 1 مع مركز الدوران المجسم.
7. الميكرويكشن
- وضع الحفر المجسمة في حامل والمناورة micromanipulator إلى تنسيق الحقن الأول.
- في المثال لاستهداف VMN، حفر في A / P = -1.4 و R / L = 0.4 بينما الرأس هو المستوى.
- خفض الحفر حتى بت هو فقط فوق الجمجمة. بدوره على الحفر، وانخفاض بلطف حتى بت قد حفرت للتو من خلال الجمجمة (وليس دورا).
- كرر لموقع الحقن العكسي.
- استخدمي إبرة معقمة للسائق لإدخال ثني 90 درجة إلى إبرة 27-30G (على سبيل المثال، حقنة الأنسولين المعقمة 0.5 مل)، واستخدم الإبرة المنحنية لكزة بلطف من خلال ماتر دورا.
- ملاحظة: في حالة حدوث نزيف، قم بتطبيق الضغط باستخدام قضيب معقم يميل إلى القطن وانظفه بالماء المعقم حتى يتوقف النزيف.
- عندما تكون على استعداد لحقن، ضع بعناية حقنة هاملتون مليئة في حامل مجسمة.
ملاحظة: لم تعد الإحداثيات على micromanipulator تنطبق بعد التبديل إلى أداة جديدة. استخدام مركز ثقب التجشؤ كهدف جديد للحقن. - ضع الإبرة بعناية فوق ثقب التجشؤ.
- خفض الإبرة حتى يمس قليلا دورا داخل وسط ثقب بور. حرج: صفر micromanipulator فقط في المحور z، بحيث يتم الحفاظ على الإحداثيات على micromanipulator لنطاق توسيط مجسمة والحفر.
- خفض الإبرة ببطء في الدماغ، ويراقب عن كثب لضمان أن الإبرة لا ينحرف على حافة ثقب بور. استمر في الانخفاض حتى 0.05 مم في الجهاز البطني إلى تنسيق الحقن D/V وانتظر دقيقة واحدة. هذه الخطوة الإضافية يخلق صغيرة "جيب" لتقليل التدفق الخلفي الفيروسي على إزالة إبرة.
- رفع الإبرة ببطء إلى تنسيق D / V وبدء الحقن.
ملاحظة: معدل التدفق وحجم تختلف تبعا للمنطقة المستهدفة والتصميم التجريبي. لإسكات optogenetic من الخلايا العصبية VMN، هو المطلوب تغطية كافية، لذلك يتم حقن 200 nL من الفيروس بمعدل 1 nL/s. - بعد الحقن المجهري، انتظر 10 دقائق في موقع الحقن لتقليل efflux من الفيروس أثناء الانسحاب.
- سحب ببطء micropipette من الدماغ بمعدل تقريبي من 1 ملم / دقيقة.
- بمجرد أن تكون الإبرة خالية من الجمجمة ، أخرج حجما صغيرا من الفيروس لضمان عدم انسداد الإبرة بالدم أو الأنسجة. استخدم قضيبا معقما يميل إلى القطن لإزالة الفيروس قبل المتابعة.
- كرر الخطوات 7.6-7.12 للجانب المقابل.
- ختم ثقوب الثقوب microinjection بور مع الشمع العظام لتحسين الشفاء (الشكل 5B).
8. زرع الألياف البصرية
ملاحظة: بعد الحقن الفيروسي، تزرع قنية الألياف البصرية الثنائية في الزاوية المحسوبة لكل قسم 1. لاحظ أن هذه الإحداثيات يجب أن تكون بالفعل ملحوظة على الجمجمة من القسم 6.
- كرر الخطوات 7.1 -7.4 للإحداثيات الزاوية.
- إعادة الرأس إلى مستوى 0 درجة الموقف.
- بعد ذلك، استخدم الحفر اليدوي لإنتاج أربعة ثقوب إضافية لالمسامير العظام: يجب وضع اثنين الأمامي واثنين من الخلفي(الشكل 5A). وسوف تكون بمثابة المراسي للصق الألياف البصرية على الجمجمة (الشكل 5D).
ملاحظة: تأكد من الفضاء الثقوب بعيدا بما فيه الكفاية من ثقوب الثقب تنسيق الزاوية لاستيعاب الجزء الحديدي من الألياف البصرية التي تجلس فوق الجمجمة. - بلطف قدر الإمكان، استخدم مفك مسطح الرأس صغيرة لتعيين مسامير العظام بحيث أنها تجلس بحزم في الجمجمة ولكن لا تخترق الدماغ.
- المشبك قنية الألياف البصرية في حامل القنية ووضعه في حامل مجسمة.
- تدوير الرأس إلى الزاوية المحسوبة، مشيرا مرة أخرى إلى أن الإحداثيات على micromanipulator لا تنطبق على الأداة الجديدة. استخدام مركز ثقوب الثقوب الزاوية كهدف زرع.
- خفض الألياف البصرية حتى يمس فقط دورا داخل وسط ثقب بور (الشكل 5C). صفر micromanipulator في المحور ض ، ثم أبطأ ببطء الألياف البصرية إلى D / V الزاوية تنسيق (-5.4 في المثال VMN).
- استخدام هلام سيانواكريلات لربط الألياف البصرية فيرول مسامير مرساة ipsilateral، ثم تطبيق المسرع مع طرف micropipette (الشكل 5D).
- مرة واحدة وقد تصلب هلام سيانواكريلات تماما، وتخفيف بلطف حامل القنية ورفع حتى واضحة من الألياف البصرية فيرول.
- كرر الخطوات 8.5-8.9 للتنسيق الزاوية العكسية، ثم مستوى الرأس. لمزيد من الأمن، وجعل اتصال إضافي بين اثنين من القنية الألياف البصرية الزاوية مع هلام سيانواكريلات والمسرع(الشكل 5D).
- إعداد كمية صغيرة، رقيقة نسبيا من الاسمنت الأسنان. تنطبق على سطح الجمجمة، والتأكد من تغطية بدقة مسامير مرساة وقاعدة من القنية الألياف البصرية. ترك ما يكفي من الحديد نظيفة للتزاوج اللاحقة مع كابلات التصحيح الألياف البصرية.
- بمجرد الانتهاء من الأسمنت الجاف، قم بإزالة الماوس من الجهاز المجسم.
- ضع الماوس في قفص الانتعاش مع الدعم الحراري. السماح لها لاسترداد ونقل إلى قفص المنزل بمجرد أن يظهر في حالة تأهب، والمحمول، والاستمالة.
9. الرعاية بعد الجراحة
- مراقبة الحيوانات يوميا لمدة 3 أيام بعد الجراحة للسلوك، والموقف، والنشاط، والاستمالة، والاحتفاظ بسجلات تناول الطعام ووزن الجسم.
- إذا أظهرت الحيوانات أي مؤشرات عامة للألم أو سوء الصحة، استشر الخدمات البيطرية.
- السماح للفئران على الأقل 2 أسابيع للتعافي والتعبير الفيروسي قبل بدء الدراسات السلوكية.
10. علم الوراثة البصرية
- لأداء دراسات علم الوراثة البصرية، راجع سيدوروآخرون.
- التحقق من صحة التعبير الفيروسي ووضع الألياف عند الانتهاء من الدراسات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول إجراء جراحي لإجراء دراسات علم الوراثة البصرية لاستجواب دور الخلايا العصبية VMN تحت المهاد في التحكم في نسبة السكر في الدم9. وكان أول استخدام نهج مجسم قياسي (غير ذو زاوية) للتشخيص الدقيق الثنائي لفيروس القناة المثبطة لفيروس VMN. وفي حين أن اتباع نهج ذو زوايا سيكون مناسبا أيضا، فقد تم اختيار النهج القياسي (غير الزاوية) لأنه كاف لاستهداف منطقة الدماغ ذات الاهتمام وهو نهج سهل وموثوق ومتسق. ومع ذلك ، نظرا لقرب VMN من خط الوسط ، لم تسمح قيود المساحة بزرع الألياف البصرية الثنائية بدون زاوية ، مما استلزم وضع استراتيجية جراحية لزرع الألياف البصرية بدقة بزاوية(الشكل 6).
باستخدام هذه الاستراتيجية الجراحية، ونحن microinjected AAV تعتمد على كري التعبير عن قناة معدلة موصل أنيون القناة تنصهر مع مراسل الفلورسنت، ويشار إليها باسم "SwiChR ++" فيروس10،ثنائيا إلى VMN من الفئران Nos1-cre. وأعقب ذلك زرع الألياف البصرية الظهرية إلى كل موقع حقن بزاوية 15 درجة من خط الوسط. كما هو متوقع، تم تقييد التعبير الفيروسي إلى VMN ولم يتم اكتشافه في مناطق الدماغ الأخرى.
الشكل 1: مثال تمثيلي لحساب الإحداثيات الزاوية التي تستهدف النواة البطنية تحت المهاد. لا يتم رسم زوايا وشرائح الخط إلى الحجم. (أ)يجب حساب هذا الطول باستخدام علم المثلثات الأساسي. في هذا المثال، A = 2.03 مم (B) الطول المقدر استنادا إلى تعيين محور دوران عشوائي. في هذا المثال، B = 7.576 مم (C) تحت ضغط الدم المحسوب. وتجدر الإشارة إلى أن عمق الألياف البصرية / إبرة الإدراج يعتمد على القرب المطلوب من المنطقة المستهدفة، الأمر الذي يتطلب التحسين. تم تعديل هذا الرقم من فابر وآخرون 201911. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ضبط المقابض لجهاز حامل الرأس المجسمة. تم تعديل هذا الرقم من فابر وآخرون 201911. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: محاذاة مركز حامل الرأس للدوران. (أ) وضع قضبان الأذن. (ب)رؤية أسفل النطاق أثناء دوران تاجي على مستوى 0 درجة (يسار)، أثناء دوران 15 درجة قبل ضبط التحول الرأسي، ويتم محاذاة مركز الدوران بشكل خاطئ (وسط)، وخلال دوران 15 درجة بعد ضبط التحول الرأسي، ويتم محاذاة مركز الدوران بشكل صحيح (يمين). تم تعديل هذا الرقم من فابر وآخرون 201911. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: تعيين bregma ومحاذاة رأس الحيوان مع محاور مركزية من التناوب. (أ) صورة تمثيلية تشير إلى وضع البريغما النموذجي. (B) رسم علامة مرجعية بينما الرأس هو المستوى، قبل المحاذاة. (ج) محور محاذاة بشكل صحيح من دوران، بعد ضبط التحول العمودي وإعادة ضبط bregma. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: عملية زرع الألياف البصرية. (أ) توسيط نطاق عرض الثقوب التجريبية للميكروبيكشن (م) ، الألياف البصرية (و) ، ومسامير مرساة (*). (ب) توسيط نطاق عرض مسامير مرساة مزروعة، وشمع العظام غطت ثقوب الحفر microinjection. (ج) وضع الألياف البصرية في مكانها أثناء زرع الزاوية. (د) ممثل ثنائي الزاوية الألياف البصرية التنسيب. تشير الأسهم السوداء المنقطة إلى المناطق التي يستخدم فيها الغراء الفائق لترسيخ الألياف البصرية إلى مسامير المرساة والألياف البصرية ipsilateral. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: النتائج التمثيلية للاستهداف الثنائي لمهاد التهوية. (أ)التخطيطي الذي يمثل الميكروبيكشن الثنائي واستراتيجية الألياف البصرية الزاوية لاستهداف VMN. (ب) صورة تمثيلية تظهر التعبير الثنائي عن SwiChR-GFP وتلف الأنسجة من مساحات الألياف البصرية الزاوية. 3V = البطين الثالث، ARC = نواة قوسية، وVMN = نواة البطين. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وقد دعمت التطورات الأخيرة في علم الأعصاب البصيرة المتقدمة والفهم في نشاط ووظيفة الدوائر العصبية في الدماغ. ويشمل ذلك تطبيق التكنولوجيات البصرية والكيموجينية لتنشيط أو إسكات مجموعات الخلايا العصبية المنفصلة ومواقع الإسقاط الخاصة بها في الجسم الحي. وفي الآونة الأخيرة، شمل ذلك تطوير مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (مثل GCaMP وRCaMP) وغيرها من أجهزة الاستشعار الحيوية الفلورية (مثل الدوبامين والنورادرينالين) لتسجيل نشاط الخلايا العصبية في الجسم الحي في نوع محدد من الخلايا في الحيوانات المتحركة بحرية. ومع ذلك، فإن الاستخدام الفعال لهذه التقنيات يعتمد على الجراحة المجسمة الناجحة لاستهداف المنطقة ذات الاهتمام. في حين أن هناك العديد من البروتوكولات المعمول بها التي تصف هذه الأساليب، والتي هي مناسبة لاستهداف العديد من مناطق الدماغ، واستهداف مناطق الدماغ العميقة على طول خط الوسط يمثل تحديات إضافية كبيرة. أظهرت هنا هو تقنية جراحية مفصلة لاستهداف مناطق الدماغ منفصلة عن طريق نهج مجسم الزاوية. والأهم من ذلك، يمكن تكييف هذه التقنية وتطبيقها على مجموعة متنوعة من تقنيات علم الأعصاب (أي علم الوراثة البصرية، وعلم الوراثة الكيميائية، ونهج قياس الألياف الضوئية).
باستخدام هذا النهج، ويظهر أن إسكات optogenetic الحادة من الخلايا العصبية VMN التعبير عن سينثاز أكسيد النيتريك العصبية (VMNNOS1 الخلايا العصبية) يحد من استجابات الجلوكاجون لنقص السكر في الدم الناجم عن الأنسولين في الفئران9. باستخدام نهج معدلة قليلا، كما ثبت أن التنشيط من جانب واحد من الخلايا العصبيةVMN NOS1 1) يثير ارتفاع السكر في الدم قوية التي تحركها الاستجابات المضادة للتنظيم التي عادة ما تكون محفوظة للاستجابة لنقص السكر في الدم، و 2) يثير سلوك الجمود الدفاعي. وعلاوة على ذلك، تنطوي هذه الاستجابات السلوكية والأيضية على إسقاطات الخلايا العصبية لمناطق الدماغ المتميزة. على وجه التحديد، وتشارك في تفعيل الخلايا العصبيةNOS1 VMN إسقاط إلى نواة السرير الأمامي من المحطة الطرفية ستريا في الاستجابات نسبة السكر في الدم، في حين ترتبط الخلايا العصبيةVMN NOS1 إسقاط إلى الرمادي البيريادوكتال إلى استجابات السلوك الناجم عن الخوف9.
وتجدر الإشارة إلى أن البروتوكول هو خاص للغاية إلى نموذج كوبف 1900 stereotax والملحقات المصاحبة لها. في حين أن هذا النظام يتيح زراعة دقيقة وقابلة للاستنساخ وكذلك microinjection لمناطق الدماغ منفصلة (مع موقف خط مركزي مشترك عبر أدوات متعددة)، يمكن تكييف الاستراتيجية والنهج لتتناسب مع إطارات ستيريوتاكسيك أخرى. على وجه التحديد ، بدلا من تدوير الرأس لإجراء عمليات التنحية الدقيقة والغرسات الزاوية ، فإن النهج البديل هو استخدام نفس المبادئ وتدوير المتلاعب الظهري البطني بدلا من ذلك (انظر كورياوآخرون. 12).
كما هو الحال مع أي طريقة جديدة ، من الأهمية بمكان بالنسبة للأفراد لتحسين هذه التقنية لتحسين موثوقية التجربة واتساقها ودقتها. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم إدراج الضوابط المناسبة اللازمة للتحليل والتفسير السليمين للبيانات. وتشمل هذه استخدام ضوابط القمامة السلبية كري، وضوابط المراسل الفيروسي (أي AAV-GFP)، والتحقق من تعديل إطلاق الخلايا العصبية المعتمدة على الضوء باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية، و (عند الانتهاء من الدراسة) التحقق من صحة الاستهداف الفيروسي ووضع الألياف البصرية في المنطقة ذات الاهتمام. ويوصى بالإشارة إلى منشور كاردوزو ولاميل13 لإجراء استعراض مفصل للاعتبارات التقنية والضوابط المقترحة.
باختصار، أدى إدخال تقنيات علم الأعصاب الأكثر تقدما ودقة إلى دعم تقدم وفهم كبيرين لدور الدماغ في السلوك والإدراك وعلم وظائف الأعضاء، وقد تؤدي هذه التطورات إلى علاجات محتملة للاضطرابات المرتبطة ب CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (NIDDK) منح F31-DK-113673 (C.L.F.) و T32-GM-095421 (C.L.F.) وDK-089056 (G.J.M #1-19-IBS-192 إلى G.J.M)ومركز أبحاث السمنة الغذائية الممول من NIDDK (DK-035816) ومركز أبحاث السكري (DK-017047) ومرض السكري، منحة التدريب على السمنة والتمثيل الغذائي T32 DK0007247 (T.H.M) في جامعة واشنطن.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | -- | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L.
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
