Anpassbarer winkelster stereotaktischer Ansatz für vielseitige neurowissenschaftliche Techniken

Summary

Hier wird ein stereotaktisches Verfahren beschrieben, das mit einem abgewinkelten koronalen Ansatz auf herausfordernde und schwer zugängliche Hirnregionen (aufgrund räumlicher Einschränkungen) abzielen kann. Dieses Protokoll ist sowohl an Maus- als auch an Rattenmodelle anpassbar und kann auf verschiedene neurowissenschaftliche Anwendungen angewendet werden, einschließlich Kanülenimplantation und Mikroinjektionen viraler Konstrukte.

Abstract

Stereotaktische Chirurgie ist ein wesentliches Werkzeug im modernen neurowissenschaftlichen Labor. Die Fähigkeit, schwer erreichbare Hirnregionen präzise und genau anzusprechen, stellt jedoch immer noch eine Herausforderung dar, insbesondere wenn gehirne Strukturen entlang der Mittellinie anvisiert werden. Zu diesen Herausforderungen gehören die Vermeidung des oberen sagittalen Sinus und des dritten Ventrikels sowie die Fähigkeit, selektive und diskrete Gehirnkerne konsequent anzusprechen. Darüber hinaus beruhen fortgeschrittenere neurowissenschaftliche Techniken (z. B. Optogenetik, Faserphotometrie und Zwei-Photonen-Bildgebung) auf der gezielten Implantation signifikanter Hardware in das Gehirn, und räumliche Einschränkungen sind ein häufiges Hindernis. Hier wird ein modifizierbares Protokoll für das stereotaktische Targeting von Nagetier-Gehirnstrukturen mit einem abgewinkelten koronalen Ansatz vorgestellt. Es kann an 1) Maus- oder Rattenmodelle, 2) verschiedene neurowissenschaftliche Techniken und 3) mehrere Gehirnregionen angepasst werden. Als repräsentatives Beispiel umfasst es die Berechnung stereotaktischer Koordinaten für das Targeting des hypothalamischen ventromedialen Kerns der Maus (VMN) für ein optogenetisches Inhibitionsexperiment. Dieses Verfahren beginnt mit der bilateralen Mikroinjektion eines Adeno-assoziierten Virus (AAV), das einen lichtempfindlichen Chloridkanal (SwiChR++) zu einem Cre-abhängigen Mausmodell kodiert, gefolgt von der abgewinkelten bilateralen Implantation von faseroptischen Kanülen. Mit diesem Ansatz zeigen die Ergebnisse, dass die Aktivierung einer Untergruppe von VMN-Neuronen für intakte Glukose-Gegenregelreaktionen auf insulininduzierte Hypoglykämie erforderlich ist.

Introduction

Die neuronale Steuerung von Verhalten, Fütterung und Stoffwechsel beinhaltet die Koordination hochkomplexer, integrativer und redundanter Neuroschaltkreise. Ein treibendes Ziel der Neurowissenschaften ist es, die Beziehung zwischen neuronaler Schaltkreisstruktur und -funktion zu analysieren. Obwohl klassische neurowissenschaftliche Werkzeuge (d. H. Läsionierung, lokale pharmakologische Injektionen und elektrische Stimulation) wichtiges Wissen über die Rolle bestimmter Gehirnregionen, die Verhalten und Stoffwechsel steuern, aufgedeckt haben, sind diese Werkzeuge durch ihre mangelnde Spezifität und Reversibilität begrenzt¹.

Jüngste Fortschritte im Bereich der Neurowissenschaften haben die Fähigkeit, die Schaltungsfunktion zelltypspezifisch mit hoher raumzeitlicher Auflösung abzufragen und zu manipulieren, erheblich verbessert. Optogenetische^2- und chemogenetische^3-Ansätze ermöglichen beispielsweise die schnelle und reversible Manipulation der Aktivität in genetisch definierten Zelltypen frei beweglicher Tiere. Optogenetik beinhaltet die Verwendung von lichtempfindlichen Ionenkanälen, sogenannten Channelrhodopsinen, zur Steuerung der neuronalen Aktivität. Der Schlüssel zu dieser Technik ist die Genabgabe von Channelrhodopsin und einer Lichtquelle zur Aktivierung des Opsins. Eine gängige Strategie für die Genabgabe ist eine Kombination aus 1) gentechnisch veränderten Mäusen, die Cre-Recombinase in diskreten Neuronen exprimieren, und 2) Cre-abhängigen viralen Vektoren, die Channelrhodopsin kodieren.

Während die Optogenetik ein elegantes, hochpräzises Mittel zur Kontrolle der neuronalen Aktivität bietet, ist die Methode von einer erfolgreichen stereotaktischen Mikroinjektion des viralen Vektors und der faseroptischen Platzierung in einer definierten Gehirnregion abhängig. Obwohl stereotaktische Verfahren im modernen neurowissenschaftlichen Labor üblich sind (und es gibt mehrere ausgezeichnete^Protokolle,die dieses Verfahren beschreiben)⁴,^5,6, stellt die Fähigkeit, diskrete Hirnregionen entlang der Mittellinie (d.h. den mediobasalen Hypothalamus, ein für die Regulation homöostatischer Funktionen kritisches Hirnareal⁷⁾konsistent und reproduzierbar anzusprechen, zusätzliche Herausforderungen dar. Zu diesen Herausforderungen gehören die Vermeidung des oberen sagittalen Sinus, des dritten Ventrikels und der angrenzenden hypothalamischen Kerne. Darüber hinaus gibt es erhebliche räumliche Einschränkungen bei der bilateralen Implantation von Hardware, die für Hemmungsstudien erforderlich ist. Mit diesen Herausforderungen im Hinterkopf stellt dieses Protokoll ein modifizierbares Verfahren dar, um diskrete Gehirnregionen über einen abgewinkelten stereotaktischen Ansatz anzusprechen.

Protocol

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health, dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Tieren, genehmigt und sowohl vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) als auch von Environmental Health and Safety an der University of Washington genehmigt.

1. Berechnung von Winkelkoordinaten

1. Markieren Sie mit einem koronalen Hirnatlas ein rechtwinkliges Dreieck, so dass die Hypotenuse die Zielregion von Interesse passiert. Im repräsentativen Beispiel (Abbildung 1) wird der hypothalamische ventromediale Kern (VMN) in einem Winkel von 15° von der koronalen Mittellinie anvisiert.
   HINWEIS: Die Platzierung der in Abbildung 1 dargestellten Drehachse (und damit die Länge von Seite C) ist beliebig und kann so geändert werden, dass sie auf jede Gehirnregion abzielt. Obwohl dies kontraintuitiv erscheinen mag, werden spätere Schritte im Protokoll die Position des Kopfes in der z-Achse so anpassen, dass dieser Punkt mit dem stereotaktischen Drehmittelpunkt übereinstimmt (siehe Abschnitt 6). Es wird jedoch empfohlen, einen koronalen Drehwinkel von 15° aufgrund physikalischer Einschränkungen der Kopfhaltervorrichtung nicht zu überschreiten.
2. Bestimmen Sie den gewünschten Winkel (a) und die geschätzte Länge von Seite B und verwenden Sie die Trigonometrie, um die Länge der Seiten A und C zu berechnen. Dieser Schritt ist wichtig, um den Kopf während der Rotation richtig zu positionieren.
   HINWEIS: Im Beispiel in Abbildung 1werden Atlasgitternetzlinien verwendet, um die Länge von Seite B anzunähern, was eine Länge von 7,576 mm ergibt. Diese Informationen werden verwendet, um die Länge von Seite A zu berechnen:
   
   In diesem Beispiel gibt 2,03 mm den R/L-Abstand von der Mittellinie an, bei der die faseroptische Kanüle in das Gehirn eintritt, wenn der Kopf um 15° gedreht wird.
   1. Berechnen Sie optional die Länge von Seite C, um die D/V-Koordinate anzunähern:
      
      HINWEIS: 1) Die Länge der Hypotenuse (C) stellt nicht die Injektionstiefe dar, ist aber hilfreich bei der Bestimmung der D / V-Koordinate, die möglicherweise angepasst werden muss, um der erhöhten Länge im Vergleich zu Seite B für Straight-In-Injektionen Rechnung zu tragen. Es wird daher empfohlen, Testeinspritzungen durchzuführen, um die D/V-Koordinate zu optimieren. 2) In diesem Beispiel, das auf die VMN abzielt, werden zwei Koordinatensätze erhalten: eine für die mikroinjektion, die nicht abgewinkelt ist (A/ P = -1,4, R / L = 0,4 bei 0°, D / V = -5,7) und eine für die abgewinkelte faseroptische Implantation (A / P = -1,4, R / L = 0,0 bei 15 °, D / V = -5,4).

2. Vorbereitung der Stereotax für das winkelige Verfahren

1. Vergewissern Sie sich, dass der stereotaktische Rahmen und der Mikromanipulator kalibriert wurden (siehe Kopf-Handbuch für das vollständige Protokoll).
2. Setzen Sie das mittlere Höhenmessgerät in den Sockel der Kopfhalter-Grundplatte ein.
3. Befestigen Sie das Zentrierfernrohr im Werkzeughalter und sehen Sie dann das Zielfernrohr nach unten. Passen Sie die Position des Mikromanipulators an, bis das Fadenkreuz ausgerichtet und auf das Fadenkreuz des Messgeräts fokussiert ist.
   HINWEIS: Während dieses Schritts wird das Zielfernrohr in der Fokusebene des Drehmittelpunkts des Kopfhalters positioniert. Einmal eingerichtet, sollte der Mikromanipulator während der verbleibenden Schritte nicht bewegt werden.
4. Setzen Sie die Ohrbügel in die Halterungen ein und zentrieren Sie sie so, dass die Anzeigelinien auf beiden Seiten bei 0 liegen(Abbildung 3A).
5. Verwenden Sie die medial-lateralen und vorderen hinteren Knöpfe am Kopfhalter (Abbildung 2), um die Ohrbügel in der x- und y-Ebene über dem Fadenkreuz des mittleren Höhenmessers zentriert auszurichten (Abbildung 3A).
6. Um die Position der Ohrstange in der z-Achse auszurichten, entfernen Sie die Ohrbügel aus der Halterung und entfernen Sie die mittlere Höhenanzeige. Ersetzen Sie die Ohrbügel und zentrieren Sie sie wieder bei 0.
7. Sehen Sie sich den Umfang an. Verwenden Sie den vertikalen Schaltknopf (Abbildung 3B) bzw. den koronalen Kippknopf, um die Ohrbügel zu senken und zu drehen, bis das Fadenkreuz des Zielfernrohrs während der koronalen Rotation zwischen den Ohrbügeln zentriert bleibt.
8. Die Stereotax ist nun kalibriert und fertig. Nehmen Sie keine weiteren Anpassungen an der Position des Kopfhalters vor.

3. Vorbereitung von Materialien für die Injektion/Implantation

1. Stellen Sie sicher, dass alle Instrumente, chirurgischen Werkzeuge und Materialien sterilisiert und in ein steriles Operationsfeld neben der Stereotax gelegt werden.
2. Behandeln und lagern Sie virale Konstrukte entsprechend ihrem Biosicherheitsniveau und den relevanten institutionellen Biosicherheitsvorschriften.
3. Ziehen Sie das Virus in die Spritze und achten Sie auf die richtige Handhabung und persönliche Schutzausrüstung.

4. Anästhesie

1. Zeichnen Sie das Körpergewicht der Maus vor der Operation auf.
2. Betäuben Sie die Maus mit Isofluran.
3. Stellen Sie sicher, dass die Maus tief betäubt ist, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen, bis die zuckende Reaktion nicht mehr vorhanden ist. Wenn das Tier weiterhin starke Reflexe zeigt, erhöhen Sie die Konzentration und / oder Dauer der Anästhesie.
4. Tragen Sie Augensalbe auf jedes Auge auf, um es während der Operation feucht zu halten.
5. Rasieren Sie die Kopfhaut von direkt hinter den Ohren bis direkt hinter den Augen mit einem Haarschneider.
6. Versorgen Sie die Maus mit einem IACUC-zugelassenen Analgetikum.
7. Überwachen Sie das Tier während des gesamten chirurgischen Eingriffs kontinuierlich und bieten Sie thermische Unterstützung.

5. Chirurgischer Eingriff

1. Legen Sie den Kopf in den Kopfhalter, indem Sie die oberen Schneidezähne in den Spalt in der Bissleiste legen und sicherstellen, dass sich die Zunge unter der Bissstange befindet.
2. Befestigen Sie den Kopf in den Ohrbügeln, indem Sie die Ohrbügel vorsichtig in den äußeren Hörfleisch einführen und sicherstellen, dass die Ohrbügel symmetrisch platziert sind (typischerweise zwischen drei und vier für eine erwachsene Maus). Dieser Schritt ist entscheidend, um sicherzustellen, dass der Kopf stabil und für die Rotation zentriert ist.
3. Bereiten Sie den rasierten Schnittbereich aseptisch mit drei abwechselnden Peelings von Betadin- und Alkoholtupfern oder mit einer alternativen institutionell zugelassenen Chirurgischen Vorbereitung vor.
4. Legen Sie einen chirurgischen Vorhang über das Tier, um ein steriles Operationsfeld zu erhalten und das Risiko einer postoperativen Infektion zu reduzieren.
5. Legen Sie den Schädel frei, indem Sie einen Schnitt entlang der sagittalen Mittellinie der Kopfhaut machen. Kratzen Sie vorsichtig die Oberfläche des Schädels, um Faszien zu entfernen und die Nähte freizulegen.
   HINWEIS: Wenn Nahtlinien schwer zu visualisieren sind, kann Wasserstoffperoxid mit einem sterilen Applikator mit Baumwollspitze auf den Schädel aufgetragen werden, um die Nahtvisualisierung zu verbessern.
6. Setzen Sie das Zentrierungsfernrohr in die Halterung ein und zentrieren Sie das Fadenkreuz auf Bregma(Abbildung 4,linkes Feld). Null der Mikromanipulator.
7. Bewegen Sie das Fadenkreuz kaudal zu Lambda und notieren Sie den Bregma-Lambda (B-L) Abstand.
   HINWEIS: Wenn die Nahtlinien keiner geraden Linie entlang der Mittellinie folgen, wird empfohlen, die Mittellinie mit der "Linie der besten Passform" sowohl durch Bregma als auch durch Lambda zu bestimmen. Wenn jedoch die oben genannten Schritte befolgt werden, sollte die anfängliche Platzierung des Scope-Absehens auf halbem Weg zwischen den Ohrbügeln liegen und sich der B-L-Mittelliniennaht nähern.
8. Wenn der B-L-Abstand deutlich kleiner oder größer als 4,21 mm ist, passen Sie das zugewiesene Bregma inkrementell an, um einen B-L-Abstand von 4,21 mm ± 0,2 mm zu erhalten.
9. Ersetzen Sie den Zentrierungsbereich durch die Ausrichtungsanzeige. Legen Sie die Sonden auf Lambda und Bregma und stellen Sie den dorsalen Neigungsknopf am Kopfhalter auf Höhe in der sagittalen Ebene (Nase nach oben oder unten) ein, und verwenden Sie dann das Zentrierfernrohr, um Bregma neu zuzuweisen.
10. Verwenden Sie die Ausrichtungsanzeige, um mit dem koronalen Neigungsknopf in der koronalen Ebene zu nivellieren. Messen Sie an mehreren Punkten in der rostralen / kaudalen Achse, um Oberflächenverformungen im Schädel zu berücksichtigen.
11. Beachten Sie die Position auf dem Zifferblatt des koronalen Kippknopfes, da dies die Drehposition von 0° ist.

6. Ausrichten der zentralen Drehachsen für abgewinkelte Koordinaten

1. Sichern Sie den Zentrierungsumfang im Werkzeughalter und positionieren Sie den Mikromanipulator auf die berechnete Koordinate aus Abschnitt 1. Beachten Sie, dass die R/L-Koordinate für die abgewinkelte Implantation der Länge von Seite A entspricht.
   1. Im Beispiel in Abbildung 1sind die abgewinkelten Koordinaten für die faseroptische Platzierung, die auf die VMN abzielt, (A/P = -1,4, R/L = [2,03] bei 0° koronaler Rotation, [0,00] bei 15° koronaler Rotation, D/V = -5,4).
2. Sichtung des Zielfernrohrs und Markieren dieser Koordinate (R/L 2,03 mm von der Mittellinie gemäß VMN-Beispiel; Abbildung 4,mittlerer Bereich). Diese Markierung stellt den Punkt dar, an dem die Kanüle in das Gehirn eintritt, sobald der Kopf gedreht wird.
3. Positionieren Sie den Mikromanipulator über der Mittellinie (R/L = 0,00). Verwenden Sie den koronalen Kippknopf, um den Kopf in den in Abschnitt 1 berechneten Winkel zu drehen.
   1. Wenn das Fadenkreuz des Zielfernrohrs bereits mit der Markierung in Einklang steht, fahren Sie mit Abschnitt 7 fort.
   2. Wenn das Fadenkreuz des Zielfernrohrs nicht mit der Referenzmarke ausgerichtet ist, stellen Sie die Kopfposition in der z-Achse mit dem vertikalen Schiebeknopf(Abbildung 2)ein, bis das Fadenkreuz so nah wie möglich an der Markierung ausgerichtet ist.
4. Drehen Sie den Kopf zurück in die koronale Position von 0°. Wenn die vertikale Verschiebung in Schritt 6.3 angepasst wurde, weisen Sie bregma mithilfe des Zentrierungsbereichs neu zu.
5. Wiederholen Sie die Schritte 6.3 und 6.4, bis das Fadenkreuz beim Drehen des Kopfes konstant die Referenzmarke erreicht(Abbildung 4C).
6. An dieser Stelle sollte der in Abschnitt 1 festgelegte beliebige Rotationspunkt nun mit dem stereotaktischen Drehmittelpunkt ausgerichtet werden.

7. Mikroinjektion

1. Setzen Sie den stereotaktischen Bohrer in die Halterung und manövrieren Sie den Mikromanipulator zur ersten Injektionskoordinate.
   1. Gemäß dem Beispiel für das Targeting des VMN bohren Sie bei A / P = -1,4 und R / L = 0,4, während der Kopf eben ist.
2. Senken Sie den Bohrer, bis sich der Bohrer direkt über dem Schädel befindet. Schalten Sie den Bohrer ein und senken Sie ihn vorsichtig ab, bis der Bohrer gerade durch den Schädel gebohrt hat (nicht die Dura).
3. Wiederholen Sie dies für die kontralaterale Injektionsstelle.
4. Verwenden Sie einen sterilen Nadeltreiber, um eine 90° -Biegung in eine 27-30G-Nadel (z. B. einer sterilen 0,5 ml Insulinspritze) einzuführen, und verwenden Sie die gebogene Nadel, um sanft durch die Dura mater zu stechen.
5. HINWEIS: Wenn Blutungen auftreten, drücken Sie mit einem sterilen Applikator mit Baumwollspitze und reinigen Sie ihn mit sterilem Wasser, bis die Blutung aufgehört hat.
6. Wenn Sie bereit zur Injektion sind, legen Sie vorsichtig eine gefüllte Hamilton-Spritze in den stereotaktischen Halter.
   HINWEIS: Die Koordinaten auf dem Mikromanipulator gelten nach dem Wechsel zu einem neuen Werkzeug nicht mehr. Verwenden Sie die Mitte des Gratlochs als neues Ziel für die Injektion.
7. Positionieren Sie die Nadel vorsichtig über dem Gratloch.
8. Senken Sie die Nadel, bis sie die Dura in der Mitte des Gratlochs leicht berührt. KRITISCH: Null der Mikromanipulator nur in der z-Achse, so dass die Koordinaten auf dem Mikromanipulator für den stereotaktischen Zentrierungsumfang und Den Bohrer beibehalten werden.
9. Senken Sie die Nadel langsam in das Gehirn und achten Sie genau darauf, dass die Nadel nicht am Rand des Gratlochs abgelenkt wird. Fahren Sie mit dem Absenken bis 0,05 mm ventral zur D/V-Injektionskoordinate fort und warten Sie 1 Minute. Dieser zusätzliche Schritt schafft eine kleine "Tasche", um den viralen Rückfluss bei der Nadelentfernung zu minimieren.
10. Heben Sie die Nadel langsam auf die D/V-Koordinate an und starten Sie die Injektion.
    HINWEIS: Durchflussrate und Volumen variieren je nach Zielregion und experimentellem Design. Für die optogenetische Stummschaltung von VMN-Neuronen ist eine ausreichende Abdeckung erwünscht, so dass 200 nL Virus mit einer Rate von 1 nL / s injiziert werden.
11. Warten Sie nach der Mikroinjektion 10 Minuten an der Injektionsstelle, um den Ausfluss des Virus während des Entzugs zu minimieren.
12. Ziehen Sie die Mikropipette langsam mit einer ungefähren Geschwindigkeit von 1 mm / min aus dem Gehirn.
13. Sobald die Nadel vom Schädel frei ist, werfen Sie ein kleines Virusvolumen aus, um sicherzustellen, dass die Nadel nicht mit Blut oder Gewebe verstopft ist. Verwenden Sie einen sterilen Applikator mit Baumwollspitze, um das Virus zu entfernen, bevor Sie fortfahren.
14. Wiederholen Sie die Schritte 7.6 bis 7.12 für die kontralaterale Seite.
15. Versiegeln Sie die Mikroinjektionsgratlöcher mit Knochenwachs, um die Heilung zu verbessern (Abbildung 5B).

8. Faseroptische Implantation

HINWEIS: Nach der Virusinjektion werden bilaterale faseroptische Kanülen im berechneten Winkel gemäß Abschnitt 1 implantiert. Beachten Sie, dass diese Koordinaten bereits auf dem Schädel aus Abschnitt 6 markiert sein sollten.

1. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.4 für die abgewinkelten Koordinaten.
2. Bringen Sie den Kopf in die Position von Ebene 0° zurück.
3. Als nächstes verwenden Sie den Handbohrer, um vier zusätzliche Löcher für die Knochenschrauben zu erzeugen: zwei sollten vorne und zwei hinter(Abbildung 5A) platziert werden. Diese dienen als Anker, um die Faseroptik am Schädel zu befestigen (Abbildung 5D).
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Löcher weit genug von den abgewinkelten Koordinatengratlöchern entfernt sind, um den Ferrule-Teil der Faseroptik aufzunehmen, der über dem Schädel sitzt.
4. Verwenden Sie den kleinen Flachkopfschraubendreher so vorsichtig wie möglich, um die Knochenschrauben so einzustellen, dass sie fest im Schädel sitzen, aber nicht in das Gehirn eindringen.
5. Klemmen Sie eine faseroptische Kanüle in den Kanülenhalter und legen Sie sie in den stereotaktischen Halter.
6. Drehen Sie den Kopf in den berechneten Winkel und achten Sie erneut darauf, dass die Koordinaten auf dem Mikromanipulator nicht für das neue Werkzeug gelten. Verwenden Sie die Mitte der abgewinkelten Gratlöcher als Implantationsziel.
7. Senken Sie die Faser, bis sie nur noch die Dura in der Mitte des Gratlochs berührt(Abbildung 5C). Null den Mikromanipulator in der z-Achse, dann langsam langsamer die Glasfaser auf die D/V-Winkelkoordinate (-5,4 gemäß VMN-Beispiel).
8. Verwenden Sie Cyanacrylatgel, um die faseroptische Ferrule mit den ipsilateralen Ankerschrauben zu verbinden, und tragen Sie dann ein Beschleunigungsmittel mit einer Mikropipettenspitze auf (Abbildung 5D).
9. Sobald das Cyanacrylatgel vollständig ausgehärtet ist, lösen Sie den Kanülenhalter vorsichtig und heben Sie ihn an, bis sich die faseroptische Ferrule entfernt hat.
10. Wiederholen Sie die Schritte 8.5–8.9 für die Winkelkoordinate, und nivellieren Sie dann den Kopf. Für zusätzliche Sicherheit stellen Sie eine zusätzliche Verbindung zwischen den beiden abgewinkelten faseroptischen Kanülen mit dem Cyanacrylatgel und dem Beschleunigungsmittel her (Abbildung 5D).
11. Bereiten Sie eine kleine, relativ dünne Menge Zahnzement vor. Auf die Oberfläche des Schädels auftragen und sicherstellen, dass die Ankerschrauben und die Basis der faseroptischen Kanülen gründlich abgedeckt sind. Lassen Sie genug von der Ferrule sauber für die anschließende Paarung mit den Glasfaser-Patchkabeln.
12. Sobald der Zement trocken ist, entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Apparat.
13. Legen Sie die Maus in einen Erholungskäfig mit thermischer Unterstützung. Lassen Sie es sich erholen und in den Heimkäfig übertragen, sobald es alarmiert, mobil und gepflegt erscheint.

9. Postoperative Versorgung

1. Überwachen Sie die Tiere täglich für 3 Tage postoperativ auf Verhalten, Haltung, Aktivität und Pflege und führen Sie Aufzeichnungen über Nahrungsaufnahme und Körpergewicht.
2. Wenn Tiere allgemeine Anzeichen für Schmerzen oder schlechte Gesundheit aufweisen, wenden Sie sich an den Tierarzt.
3. Erlauben Sie Mäusen mindestens 2 Wochen zur Genesung und zur viralen Expression, bevor Sie mit Verhaltensstudien beginnen.

10. Optogenetik

1. Für die Durchführung optogenetischer Studien siehe Sidor et al.⁸.
2. Validierung der viralen Expression und Faserplatzierung nach Abschluss der Studien.

Representative Results

Dieses Protokoll beschreibt einen chirurgischen Eingriff zur Durchführung optogenetischer Studien, um die Rolle hypothalamischer VMN-Neuronen bei der glykämischen Kontrolle zu untersuchen⁹. Zuerst wurde ein standardmäßiger (nicht abgewinkelter) stereotaktischer Ansatz für die bilaterale Mikroinjektion eines inhibitorischen Channelrhodopsinvirus in das VMN verwendet. Während auch ein abgewinkelter Ansatz geeignet wäre, wurde der Standardansatz (nicht abgewinkelter Ansatz) gewählt, da er ausreicht, um die interessierende Hirnregion anzusprechen, und ein einfacher, zuverlässiger und konsistenter Ansatz ist. Angesichts der Nähe des VMN zur Mittellinie erlaubten die Platzbeschränkungen jedoch keine nicht abgewinkelte Implantation bilateraler Faseroptik, was die Entwicklung einer chirurgischen Strategie zur präzisen Implantation von Faseroptik in einem Winkel erforderte (Abbildung 6).

Mit dieser chirurgischen Strategie haben wir ein Cre-abhängiges AAV mikroinjektiert, das einen modifizierten Channelrhodopsin-Anionen-leitenden Kanal exprimiert, der mit dem fluoreszierenden Reporter, einem sogenannten "SwiChR++" -Virus^10,bilateral zum VMN von Nos1-cre-Mäusen verschmolzen ist. Es folgte die Implantation einer Rückenfaser dorsolateral zu jeder Injektionsstelle in einem Winkel von 15° von der Mittellinie. Wie erwartet, wurde die virale Expression auf das VMN beschränkt und in anderen Gehirnbereichen nicht nachgewiesen.

Abbildung 1: Repräsentatives Beispiel für die Berechnung von Winkelkoordinaten, die auf den hypothalamischen ventromediale Kern abzielen. Winkel und Liniensegmente werden nicht maßstabsgetreu gezeichnet. (A) Diese Länge sollte mit Hilfe der grundlegenden Trigonometrie berechnet werden. In diesem Beispiel ist A = 2,03 mm. (B) Geschätzte Länge basierend auf der Zuweisung einer beliebigen Drehachse. In diesem Beispiel ist B = 7,576 mm. (C) Berechnete Hypotenuse. Es sollte beachtet werden, dass die Tiefe des Faser-/Nadeleinführungs von der gewünschten Nähe zur Zielregion abhängt, die optimiert werden muss. Diese Zahl wurde von Faber et al. 2019¹¹modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Einstellknöpfe für die stereotaktische Kopfhaltervorrichtung. Diese Zahl wurde von Faber et al. 2019¹¹modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Ausrichten des Drehmittelpunkts des Kopfhalters. (A) Positionierung der Ohrbügel. (B) Sichtung des Zielfernrohrs während der koronalen Drehung auf 0°-Ebene (links), während der 15°-Drehung vor der Einstellung der vertikalen Verschiebung und des Drehmittelpunkts ist falsch ausgerichtet (Mitte) und während der 15°-Drehung nach Anpassung der vertikalen Verschiebung und der Drehmittelpunkt ist richtig ausgerichtet (rechts). Diese Zahl wurde von Faber et al. 2019¹¹modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Zuweisen von Bregma und Ausrichten des Tierkopfes mit zentralen Drehachsen. (A) Repräsentatives Bild, das auf eine typische Bregma-Platzierung hinweist. (B) Zeichnen einer Referenzmarkierung bei ebener Höhe des Kopfes vor der Ausrichtung. (C) Richtig ausgerichtete Drehachse, nach Einstellung der vertikalen Verschiebung und Neueinstellung der Bregma. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Faseroptische Implantation. (A) Zentrierweite der Pilotbohrungen für Mikroinjektion (m), Glasfaser (f) und Ankerschrauben (*). (B) Zentrierende Zielfernrohransicht von implantierten Ankerschrauben und mit Knochenwachs bedeckten Mikroinjektionsbohrlöchern. (C) Positionierung der Faseroptik während der abgewinkelten Implantation. (D) Repräsentative bilaterale abgewinkelte faseroptische Platzierung. Gepunktete schwarze Pfeile zeigen Bereiche an, in denen Sekundenkleber verwendet wird, um die Faseroptik an den Ankerschrauben und ipsilateralen Faseroptik zu verankern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse für die bilaterale Ausrichtung des ventromedialen Hypothalamus. (A) Schematisch für die bilaterale Mikroinjektion und die gewinkelte Glasfaserstrategie für die Ausrichtung auf das VMN. (B) Repräsentatives Bild, das die bilaterale Expression von SwiChR-GFP und Gewebeschäden aus abgewinkelten faseroptischen Bahnen zeigt. 3V = dritter Ventrikel, ARC = Arkuatkern und VMN = ventromedialer Kern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Jüngste Fortschritte in den Neurowissenschaften haben fortgeschrittene Einblicke und Verständnis für die Aktivität und Funktion von Gehirnneuroschaltkreisen unterstützt. Dazu gehört die Anwendung optogenetischer und chemogenetischer Technologien zur Aktivierung oder Stille diskreter neuronaler Populationen und ihrer Projektionsstellen in vivo. In jüngerer Zeit wurden gentechnisch kodierte Calciumindikatoren (z. B. GCaMP, RCaMP) und andere fluorometrische Biosensoren (z. B. Dopamin, Noradrenalin) zur in vivo-Aufzeichnung der neuronalen Aktivität in einem definierten Zelltyp bei frei beweglichen Tieren entwickelt. Der effektive Einsatz dieser Technologien hängt jedoch von einer erfolgreichen stereotaktischen Operation ab, um die Region von Interesse anzusprechen. Während es mehrere etablierte Protokolle gibt, die diese Methoden beschreiben, die für das Targeting vieler Gehirnregionen geeignet sind, stellt das Targeting tiefer Hirnregionen entlang der Mittellinie erhebliche zusätzliche Herausforderungen dar. Hier wird eine detaillierte Operationstechnik zur Gezielter diskreter Hirnregionen über einen abgewinkelten stereotaktischen Ansatz demonstriert. Wichtig ist, dass diese Technik an eine Vielzahl von neurowissenschaftlichen Techniken (z. B. Optogenetik, Chemogenetik und Faserphotometrie) angepasst und angewendet werden kann.

Mit diesem Ansatz wurde gezeigt, dass akutes optogenetisches Stummschalten von VMN-Neuronen, die neuronale Stickoxidsynthase (VMN^{NOS1-Neuronen)} exprimieren, die Glucagonreaktionen auf insulininduzierte Hypoglykämie bei Mäusen abstumpft⁹. Mit einem leicht modifizierten Ansatz wird weiter gezeigt, dass die einseitige Aktivierung von VMN^{NOS1-Neuronen} 1) eine robuste Hyperglykämie hervorruft, die durch gegenregulatorische Reaktionen verursacht wird, die normalerweise für die Reaktion auf Hypoglykämie reserviert sind, und 2) defensives Immobilitätsverhalten hervorruft. Darüber hinaus beinhalten diese Verhaltens- und Stoffwechselreaktionen neuronale Projektionen auf verschiedene Gehirnbereiche. Insbesondere die Aktivierung von VMN^{NOS1-Neuronen,} die auf den vorderen Bettkern der Stria terminalis projizieren, sind an glykämischen Reaktionen beteiligt, während VMN^{NOS1-Neuronen,} die auf das periaquäduktale Grau projizieren, mit angstinduzierten Verhaltensreaktionen verbunden sind⁹.

Es ist zu beachten, dass das Protokoll sehr spezifisch für die Kopf Model 1900 Stereotax und das dazugehörige Zubehör ist. Während dieses System eine präzise, reproduzierbare Implantation sowie Mikroinjektion in diskrete Gehirnregionen (mit einer gemeinsamen Mittellinienposition über mehrere Werkzeuge hinweg) ermöglicht, können die Strategie und der Ansatz an andere stereotaxische Rahmen angepasst werden. Anstatt den Kopf zu drehen, um abgewinkelte Mikroinjektionen und Implantationen durchzuführen, besteht ein alternativer Ansatz darin, die gleichen Prinzipien zu verwenden und stattdessen den dorsal-ventralen Manipulator zu drehen (siehe Correia et al.¹²).

Wie bei jeder neuen Methode ist es für Einzelpersonen von entscheidender Bedeutung, die Technik zu optimieren, um die Zuverlässigkeit, Konsistenz und Genauigkeit eines Experiments zu verbessern. Darüber hinaus ist es wichtig, die notwendigen geeigneten Kontrollen für die ordnungsgemäße Analyse und Interpretation von Daten einzubeziehen. Dazu gehören die Verwendung von Cre-negativen Littermatkontrollen, virale Reporterkontrollen (z. B. AAV-GFP), die Überprüfung der lichtabhängigen neuronalen Feuermodulation mittels Elektrophysiologie und (nach Abschluss der Studie) die Validierung des viralen Targetings und der faseroptischen Platzierung in der Region von Interesse. Es wird empfohlen, sich auf die Veröffentlichung von Cardozo und Lammel¹³ zu beziehen, um eine detaillierte Überprüfung der technischen Überlegungen und der vorgeschlagenen Kontrollen zu erhalten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Einführung fortschrittlicherer und präziserer neurowissenschaftlicher Techniken einen signifikanten Fortschritt und ein Verständnis der Rolle des Gehirns in Verhalten, Kognition und Physiologie unterstützt hat, und diese Fortschritte können zu potenziellen Therapien für ZNS-bedingte Störungen führen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiberoptic Cannulae	Doric Lenses	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Customizable
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System	Kopf	Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge	Kopf	Model 1900-51
Kopf Model 1905 Alignment Indicator	Kopf	Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1911
Kopf Model 1915 Centering Scope	Kopf	Model 1915
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 1922
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator	Kopf	Model 1940
Micro4 Microinjection System	World Precision Instruments	--
Mouse bone screws	Plastics One	00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule	Thor Labs	XCL
Surgical Drill	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill