Summary
Burada açıklanan, açılı bir koronal yaklaşım kullanarak zorlu ve ulaşılması zor beyin bölgelerini (mekansal sınırlamalar nedeniyle) hedef alabilen stereotaktik bir prosedürdür. Bu protokol hem fare hem de sıçan modellerine uyarlanabilir ve kanül implantasyonu ve viral yapıların mikroenjectionları da dahil olmak üzere çeşitli nörobilimsel uygulamalara uygulanabilir.
Abstract
Stereotaktik cerrahi, modern sinirbilim laboratuvarında önemli bir araçtır. Bununla birlikte, ulaşılması zor beyin bölgelerini tam ve doğru bir şekilde hedefleme yeteneği, özellikle orta hat boyunca beyin yapılarını hedeflerken hala bir zorluk teşkil etmektedir. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüs ve üçüncü ventrikülden kaçınmak ve seçici ve ayrık beyin çekirdeklerini sürekli olarak hedefleme yeteneği yer almaktadır. Ek olarak, daha gelişmiş sinirbilim teknikleri (örneğin, optogenetik, lifli fotometri ve iki foton görüntüleme) beyne önemli donanımların hedefli implantasyonuna dayanır ve mekansal sınırlamalar yaygın bir engeldir. Burada, açılı bir koronal yaklaşım kullanılarak kemirgen beyin yapılarının stereotaktik olarak hedeflimi için değiştirilebilir bir protokol sunulmaktadır. 1) fare veya sıçan modellerine, 2) çeşitli sinirbilim tekniklerine ve 3) birden fazla beyin bölgesine uyarlanabilir. Temsili bir örnek olarak, bir optogenetik inhibisyon deneyi için fare hipotalamik ventromedial çekirdeğinin (VMN) hedeflanması için stereotaktik koordinatların hesaplanmasını içerir. Bu prosedür, adeno ilişkili bir virüsün (AAV) ışığa duyarlı bir klorür kanalını (SwiChR++) Cre'ye bağımlı bir fare modeline kodlaması ve ardından fiberoptik kanonun açılı bilateral implantasyonu ile başlar. Bu yaklaşımı kullanarak, bulgular insülin kaynaklı hipoglisemiye karşı sağlam glikoz karşı-gülatör yanıtları için VMN nöronlarının bir alt kümesinin aktivasyonunun gerekli olduğunu göstermektedir.
Introduction
Davranış, beslenme ve metabolizmanın sinirsel kontrolü, son derece karmaşık, bütünleştirici ve gereksiz nörosürücülerin koordinasyonunu içerir. Nörobilim alanının itici bir amacı, nöronal devre yapısı ve işlevi arasındaki ilişkiyi parçalamaktır. Klasik sinirbilim araçları (yani lezyonlama, lokal farmakolojik enjeksiyonlar ve elektriksel stimülasyon) davranışı ve metabolizmayı kontrol eden belirli beyin bölgelerinin rolü hakkında hayati bilgileri ortaya çıkarmış olsa da, bu araçlar özgüllük ve geri döndürülebilirlik eksikliği ile sınırlıdır1.
Nörobilim alanındaki son gelişmeler, devre fonksiyonunu yüksek mekansal çözünürlükle hücre tipi spesifik bir şekilde sorgulama ve manipüle etme yeteneğini büyük ölçüde geliştirmiştir. Örneğin optogenetik2 ve kemogenetik3 yaklaşımları, serbestçe hareket eden hayvanların genetik olarak tanımlanmış hücre tiplerinde aktivitenin hızlı ve geri dönüşümlü manipülasyonuna izin verir. Optogenetik, nöronal aktiviteyi kontrol etmek için channelrhodopsins olarak adlandırılan ışığa duyarlı iyon kanallarının kullanımını içerir. Bu tekniğin anahtarı, channelrhodopsin'in gen iletimi ve opsin'i aktive etmek için bir ışık kaynağıdır. Gen iletimi için ortak bir strateji, 1) ayrı nöronlarda Cre-rekombinaz ifade eden genetik olarak tasarlanmış fareler ve 2) Channelrhodopsin kodlaması için cre-dependent viral vektörler kombinasyonudur.
Optogenetik nöronal aktiviteyi kontrol etmek için zarif, son derece hassas bir araç sağlarken, yöntem viral vektörün başarılı stereotaktik mikroenjeksiyonuna ve tanımlanmış bir beyin bölgesine fiberoptik yerleştirmeye dayatılır. Stereotaktik prosedürler modern sinirbilim laboratuvarında yaygın olmasına rağmen (ve bu prosedürü tanımlayan birkaç mükemmel protokol vardır)4,5,6, orta hat boyunca ayrı beyin bölgelerini tutarlı ve tekrar tekrar hedefleyebilmek (yani, homeostatik fonksiyonların düzenlenmesi için kritik bir beyin alanı olan mediobaz hipotalamus) ek zorluklar sunar. Bu zorluklar arasında üstün sagittal sinüsten, üçüncü ventrikülden ve bitişik hipotalamik çekirdeklerden kaçınmak yer almaktadır. Ek olarak, inhibisyon çalışmaları için gerekli olan donanımın bilateral implantasyonunda önemli mekansal sınırlamalar vardır. Bu zorlukları göz önünde bulundurarak, bu protokol burada açılı bir stereotaktik yaklaşımla ayrı beyin bölgelerini hedeflemek için değiştirilebilir bir prosedür sunar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm prosedürler Ulusal Sağlık Enstitüleri, Hayvanların Bakımı ve Kullanımı Rehberi uyarınca onaylandı ve washington Üniversitesi'nde hem Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) hem de Çevre Sağlığı ve Güvenliği tarafından onaylandı.
1. Açılı koordinatların hesaplanması
- Bir koronal beyin atlası kullanarak, hipotenüsün hedef ilgi bölgesinden geçmesi için sağ üçgeni işaretleyin. Temsili örnekte (Şekil 1), hipotalamik ventromedial çekirdek (VMN) koronal orta çizgiden 15 ° açıyla hedeflenmiştir.
NOT: Şekil 1'de gösterilen dönme ekseninin yerleşimi (ve dolayısıyla C tarafının uzunluğu) rastgeledir ve herhangi bir beyin bölgesini hedef almak için değiştirilebilir. Bu mantıksız görünse de, protokoldeki daha sonraki adımlar başın z eksenindeki konumunu, bu noktanın stereotaktik dönme merkeziyle hizalanacak şekilde ayarlayacaktır (bkz. bölüm 6). Bununla birlikte, baş tutucu aparatının fiziksel kısıtlamaları nedeniyle 15 ° 'lik bir koronal dönüş açısını aşmamanız önerilir. - İstenen açıyı (a) ve B tarafının tahmini uzunluğunu belirleyin ve A ve C taraflarının uzunluğunu hesaplamak için trigonometri kullanın. Bu adım, dönüş sırasında başın düzgün bir şekilde konumlandırılması için önemlidir.
NOT: Şekil 1'dekiörnekte, atlas kılavuz çizgileri B tarafının uzunluğuna yaklaşık olarak kullanılır ve 7.576 mm uzunluk elde edilir. Bu bilgiler, A tarafının uzunluğunu hesaplamak için kullanılır:
Bu örnekte, 2,03 mm, baş 15° döndürüldüğünde fiberoptiküllerin beyne girdiği orta çizgiden R/M mesafesini gösterir.- İsteğe bağlı olarak, D/V koordinatını yaklaşık olarak yaklaşık olarak C tarafının uzunluğunu hesaplayın:
NOT: 1) Hipotenozun uzunluğu (C) enjeksiyon derinliğini temsil etmez, ancak düz enjeksiyonlar için B tarafına karşı artan uzunluğa uyum sağlayacak şekilde ayarlanması gerekebilecek D /V koordinatının belirlenmesinde yardımcı olacaktır. Bu nedenle, D/V koordinatını optimize etmek için test enjeksiyonlarının yapılması önerilir. 2) VMN'yi hedefleyen bu örnekte, iki koordinat kümesi elde edilir: biri açılı olmayan mikroenjeksiyon için (A/P = -1.4, R/L = 0°'de 0,4, D/V = -5,7) ve açılı fiberoptik implantasyon için bir tane (A/P = -1,4, R/L = 15°'de 0,0, D/V = -5,4).
- İsteğe bağlı olarak, D/V koordinatını yaklaşık olarak yaklaşık olarak C tarafının uzunluğunu hesaplayın:
2. Açılı prosedür için stereotaksın hazırlanması
- Stereotaktik çerçevenin ve mikromanipülatörnün kalibre edildiğini onaylayın (tam protokol için Kopf kılavuzuna bakın).
- Orta yükseklik göstergesini baş tutucu taban plakasının soketine yerleştirin.
- Takım tutucusunda merkezleme kapsamını sabitleyin, ardından kapsamı görün. Artılar hizalanana ve ölçer nişangahlara odaklanana kadar mikromanipülatörnün konumunu ayarlayın.
NOT: Bu adım sırasında, kapsam baş tutucunun dönme merkezinin odak düzlemine yer almaktadır. Kurulduktan sonra, mikromanipülatör kalan adımlar sırasında hareket ettirilememelidir. - Kulak çubuklarını tutuculara yerleştirin ve her iki taraftaki gösterge çizgileri 0'da olacak şekilde ortalayın (Şekil 3A).
- Merkez yükseklik göstergesinin çapraz işaretinin üzerindeki x veydüzlemlerindeki kulak çubuklarını orta hizalamak için baş tutucudaki medial-lateral ve ön-arka düğmeleri kullanın (Şekil 3A).
- Kulak çubuğu konumunu z ekseninde hizalamak için kulak çubuklarını tutucudan çıkarın ve orta yükseklik ölçeri çıkarın. Kulak çubuklarını değiştirin ve 0'da tekrar ortalayın.
- Dürbünle görün. Sırasıyla dikey vites değiştirme düğmesini (Şekil 3B) ve koronal eğim düğmesini kullanarak, dürbün çaprazları koronal dönüş boyunca kulak çubukları arasında ortalanana kadar kulak çubuklarını alçaltır ve döndürün.
- Stereotaks artık kalibre edilmiş ve hazırdır. Baş tutucunun pozisyonunda daha fazla ayarlama yapmayın.
3. Enjeksiyon/implantasyon için malzemelerin hazırlanması
- Tüm aletlerin, cerrahi aletlerin ve malzemelerin sterilize olduğundan ve stereotaksın yanındaki steril bir cerrahi alana yerleştirildiklerinden emin olun.
- Viral yapıları biyogüvenlik seviyelerine ve ilgili kurumsal biyogüvenlik düzenleyici gerekliliklerine göre ele alın ve saklayın.
- Uygun elleçleme uygulamalarını ve kişisel koruyucu ekipmanları kullanmaya özen ederek virüsü şırınna çekin.
4. Anestezi
- Ameliyattan önce farenin vücut ağırlığını kaydedin.
- Isoflurane kullanarak fareyi derinlemesine uyuşturun.
- Kıtırlık tepkisi olmayana kadar bir parmak sıkışma testi yaparak farenin derinlemesine uyuşturulmasını sağlayın. Hayvan güçlü refleksler göstermeye devam ederse, anestezi konsantrasyonu ve / veya süresini artırın.
- Ameliyat sırasında nemli tutmak için her göze göz merhemi uygulayın.
- Saç kesme makinesi ile kafa derisini kulakların hemen arkasından gözlerin hemen arkasına tıraş edin.
- Fareye IACUC onaylı analjezik sağlayın.
- Cerrahi işlem boyunca hayvanı sürekli izleyin ve termal destek sağlayın.
5. Cerrahi prosedür
- Üst kesici dişleri ısırık çubuğundaki boşluğa yerleştirerek, dilin ısırık çubuğunun altında olduğundan emin olarak başı baş tutucuya yerleştirin.
- Kulak çubuklarını dış işitsel meatus'a hafifçe yerleştirerek başı kulak çubuklarına sabitleyin ve kulak çubuklarının simetrik olarak yerleştirilmesini sağlayın (yetişkin bir fare için genellikle üç ila dört). Bu adım, başın sabit ve dönme için ortalanmış olduğundan emin olmak için kritik öneme sahiptir.
- Aseptik olarak traş kesi bölgesini üç alternatif betadin ve alkol sürüntümü ile veya alternatif kurumsal olarak onaylanmış cerrahi bölge hazırlığı ile hazırlayın.
- Steril bir cerrahi alanı korumak ve ameliyat sonrası enfeksiyon riskini azaltmak için hayvanın üzerine cerrahi bir örtü yerleştirin.
- Kafa derisinin sagittal orta çizgisi boyunca bir kesi yaparak kafatasını ortaya çıkarın. Herhangi bir fasyayı çıkarmak ve dikişleri açığa çıkarmak için kafatasının yüzeyini hafifçe kazıyın.
NOT: Dikiş çizgilerinin görselleştirilmesi zorsa, dikiş görselleştirmesini iyileştirmek için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanılarak kafatasına hidrojen peroksit uygulanabilir. - Ortalama kapsamını tutucuya yerleştirin ve artı işareti bregma üzerine ortaleyin(Şekil 4, sol panel). Mikromanipülatör sıfır.
- Bregma-lambda (B-L) mesafesine dikkat ederek nişangahları caudally lambda'ya taşıyın.
NOT: Dikiş çizgileri orta hat boyunca düz bir çizgi izlemezse, hem bregma hem de lambda aracılığıyla "en uygun çizgi" kullanılarak orta hattın kurulması önerilir. Bununla birlikte, yukarıdaki adımlar izlenirse, kapsam retikülünün ilk yerleşimi kulak çubukları arasında yarı yarıya olmalı ve B-L orta hat dikişine yakından yaklaşmalıdır. - B-L mesafesi önemli ölçüde 4,21 mm'den küçük veya daha büyükse, 4,21 mm ± 0,2 mm B-L mesafesi elde etmek için atanan bregmayı kademeli olarak ayarlayın.
- Ortalama kapsamını hizalama göstergesiyle değiştirin. Probları lambda ve bregma üzerine yerleştirin ve baş tutucudaki sırt eğme düğmesini sagittal düzlemde (burun yukarı veya aşağı bakacak şekilde) hizaya ayarlayın, ardından bregma'yı yeniden atamak için merkezleme kapsamını kullanın.
- Koronal eğim düğmesini kullanarak koronal düzlemde seviyelendirmek için hizalama göstergesini kullanın. Kafatasındaki yüzey deformasyonlarını hesaba katmak için rostral/kaudal eksen boyunca birden fazla noktada ölçüm alın.
- 0° dönüş konumu olduğu için koronal eğim düğmesinin kadranındaki konuma dikkat edin.
6. Açılı koordinatlar için dönüşün merkezi eksenlerini hizalama
- Takım tutucusunda merkezleme kapsamını sabitleyin ve mikromanipülatörü bölüm 1'den hesaplanan koordinata yerleştirin. Açılı implantasyon için R/M koordinatının A tarafının uzunluğuna karşılık geldiğini unutmayın.
- Şekil 1'dekiörnekte, VMN'yi hedefleyen fiberoptik yerleştirme için açılı koordinatlar (A/P = -1.4, R/L = [2.03] 0° koronal rotasyonda, [0.00] 15° koronal rotasyonda, D/V = -5.4).
- Kapsamın aşağı doğru görülmesi ve bu koordinatın işaretlenerek (VMN örneği başına orta hattan R/L 2,03 mm; Şekil 4, orta panel). Bu işaret, kafa döndürüldüğünde canüllerin beyne gireceği noktayı temsil eder.
- Mikromanipülatörü orta hat üzerinde yeniden konumlandırın (R/L = 0,00). Başı bölüm 1'de hesaplanan açıya döndürmek için koronal eğim düğmesini kullanın.
- Kapsam artı işaretleri işaretle zaten hizalanırsa, bölüm 7'ye geçin.
- Kapsam artı işaretleri referans işaretiyle hizalanmazsa, çapraz artı işaretleri işarete mümkün olduğunca yakın hizalanana kadar dikey kaydırma düğmesini (Şekil 2) kullanarak z eksenindeki kafa konumunu ayarlayın.
- Başı 0° koronal konuma geri döndürün. Dikey kaydırma adım 6.3'te ayarlanmışsa, ortalama kapsamını kullanarak bregma'yı yeniden atayın.
- Kafa döndürüldüğünde artı işaretleri sürekli olarak referans işaretine çarpana kadar 6.3 ve 6.4 adımlarını yineleyin (Şekil 4C).
- Bu noktada, bölüm 1'de kurulan rastgele dönme noktası artık stereotaktik dönme merkezi ile hizalanmalıdır.
7. Mikroenjeksiyon
- Stereotaktik matkabı tutucuya yerleştirin ve mikromanipülatörü ilk enjeksiyon koordinatına manevra yap.
- VMN'yi hedefleme örneğine göre, kafa düzken A/P = -1.4 ve R/L = 0.4'te detaya gidin.
- Matkabı, uç kafatasının hemen üstünde olana kadar diraye kadar dirdir. Matkabı açın ve uç kafatasını (dura değil) delinene kadar hafifçe diriltin.
- Kontrallateral enjeksiyon bölgesi için tekrarlayın.
- 27-30G iğneye (örneğin, steril 0,5 mL insülin şırıngası) 90° büküm sokmak için steril bir iğne sürücüsü kullanın ve bükülen iğneyi dura mater'i hafifçe dürtmek için kullanın.
- NOT: Kanama meydana gelirse, steril pamuk uçlu bir aplikatör ile basınç uygulayın ve kanama durana kadar steril suyla temizleyin.
- Enjekte etmeye hazır olduğunuzda, stereotaktik tutucuya doldurulmuş bir Hamilton şırıncısını dikkatlice yerleştirin.
NOT: Mikromanipülatördeki koordinatlar artık yeni bir araca geçtikten sonra geçerli değildir. Enjeksiyon için yeni hedef olarak çapak deliğinin merkezini kullanın. - İğneyi çapak deliğinin üzerine dikkatlice yerleştirin.
- Çapak deliğinin ortasındaki dura hafifçe dokunana kadar iğneyi dira diri diri diri dürt. KRİtİk: Mikromanipülatöre sadece z ekseninde sıfır, böylece stereotaktik merkezleme kapsamı ve matkap için mikromanipülatördeki koordinatlar korunur.
- İğneyi yavaşça beyne diri olun, iğnenin çapak deliğinin kenarında sapmamasını sağlamak için yakından seyredemeyin. D/V enjeksiyon koordinatı için 0,05 mm ventral olana kadar alçalmaya devam edin ve 1 dakika bekleyin. Bu ekstra adım, iğne çıkarmada viral geri akışı en aza indirmek için küçük bir "cep" oluşturur.
- İğneyi yavaşça D/V koordinatlarına kaldırın ve enjeksiyona başlayın.
NOT: Akış hızı ve hacmi hedef bölgeye ve deneysel tasarıma bağlı olarak değişecektir. VMN nöronlarının optogenetik susturulması için yeterli kapsama alanı istenir, bu nedenle 1 nL / s hızında 200 nL virüs enjekte edilir. - Mikroenjeksiyondan sonra, çekilme sırasında virüs efflux'ını en aza indirmek için enjeksiyon yerinde 10 dakika bekleyin.
- Mikropipti beyinden yaklaşık 1 mm/dk hızla yavaşça çekin.
- İğne kafatasından temizlendikten sonra, iğnenin kan veya doku ile tıkanmadığından emin olmak için küçük bir miktarda virüs fırlatın. Devam etmeden önce virüsü çıkarmak için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.
- Kontralteral taraf için 7.6–7.12 adımlarını yineleyin.
- İyileşmeyi iyileştirmek için mikroenjeksiyon çapak deliklerini kemik balmumu ile kapatın (Şekil 5B).
8. Fiberoptik implantasyon
NOT: Viral enjeksiyondan sonra bilateral fiberoptik kanüller bölüm 1 başına hesaplanan açıyla implante edilir. Bu koordinatların bölüm 6'dan kafatasında işaretlenmiş olması gerektiğini unutmayın.
- Açılı koordinatlar için 7.1 –7.4 adımlarını yineleyin.
- Başı 0° seviyesi konumuna getirin.
- Daha sonra, kemik vidaları için dört ek delik üretmek için el matkabı kullanın: iki ön ve iki arka olarak yerleştirilmelidir (Şekil 5A). Bunlar, fiberoptikleri kafatasına yapıştırmak için çapa görevi görecektir (Şekil 5D).
NOT: Delikleri, fiberoptiğin kafatasının üzerinde bulunan yüksük kısmını barındıracak şekilde açılı koordinat çapak deliklerinden yeterince uzağa boşluk açtığınızdan emin olun. - Mümkün olduğunca hafifçe, kemik vidalarını kafatasına sıkıca oturacak şekilde ayarlamak için küçük düz başlı tornavidayı kullanın, ancak beyne nüfuz etmezler.
- Fiberoptik bir kanolü, kanon tutucuya kenetleyin ve stereotaktik tutucuya yerleştirin.
- Mikromanipülatördeki koordinatların yeni alet için geçerli olmadığını tekrar belirterek başı hesaplanan açıya döndürün. İmplantasyon hedefi olarak açılı çapak deliklerinin merkezini kullanın.
- Fiberoptiği, çapak deliğinin ortasındaki duraya dokunana kadar küçümseyin (Şekil 5C). Mikromanipülatöre z ekseninde sıfır, ardından fiberoptiği yavaşça D/V açılı koordinata (VMN örneği başına-5,4) yavaşlatın.
- Fiberoptik yüksükleri ipsilateral ankraj vidalarına bağlamak için siyanoakrilat jeli kullanın, ardından bir mikropipette ucu ile bir hızlandırıcı uygulayın (Şekil 5D).
- Siyanoakrilat jel tamamen sertleştikten sonra, kanolün tutucuyu hafifçe gevşetin ve fiberoptik yüksükten temizlenene kadar yükseltin.
- Kontralatör açılı koordinat için 8,5–8,9 arası adımları tekrarlayın, sonra başı düzleştirin. Ekstra güvenlik için, siyanoakrilat jel ve hızlandırıcı ile iki açılı fiberoptik kanolün arasında ek bir bağlantı yapın (Şekil 5D).
- Küçük, nispeten ince miktarda diş çimentosu hazırlayın. Fiberoptik kanonların çapa vidalarını ve tabanını iyice örttürdklerinden emin olarak kafatasının yüzeyine uygulayın. Fiberoptik yama kabloları ile sonraki çiftleşme için yeterince yüksük açık bırakın.
- Çimento kuruduktan sonra fareyi stereotaktik aparattan çıkarın.
- Fareyi termal destek ile bir kurtarma kafesine yerleştirin. Uyanık, hareketli ve tımarlı göründüğünde iyileşmesine ve ev kafesine aktarılmasına izin verin.
9. Ameliyat sonrası bakım
- Hayvanları ameliyat sonrası 3 gün boyunca davranış, duruş, aktivite ve tımar için günlük olarak izleyin ve yiyecek alımı ve vücut ağırlığı kayıtlarını tutun.
- Hayvanlar ağrı veya kötü sağlıkla ilgili herhangi bir genel gösterge sergilerse, veteriner hizmetlerine danışın.
- Davranışsal çalışmalara başlamadan önce farelere iyileşme ve viral ifade için en az 2 hafta izin verin.
10. Optogenetik
- Optogenetik çalışmaların performansı için Sidor ve ark.8.
- Çalışmaların tamamlanmasında viral ekspresy anlatım ve lif yerleşimini doğrulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, hipotalamik VMN nöronlarının glisemik kontrol9'dakirolünü sorgulamak için optogenetik çalışmaları yapmak için cerrahi bir prosedürü açıklar. İlk olarak VMN'ye inhibitör bir channelrhodopsin virüsünün bilateral mikroenjeksiyon için standart (açılı olmayan) stereotaktik bir yaklaşım kullanılmıştır. Açılı bir yaklaşım da uygun olsa da, ilgi çekici beyin bölgesini hedeflemek yeterli olduğu ve kolay, güvenilir ve tutarlı bir yaklaşım olduğu için standart (açılı olmayan) yaklaşım seçilmiştir. Bununla birlikte, VMN'nin orta çizgiye yakınlığı göz önüne alındığında, uzay kısıtlamaları bilateral fiberoptiklerin açılı olmayan implantasyonuna izin vermemiş ve fiberoptiklerin bir açıyla hassas bir şekilde implante edilmesi için cerrahi bir strateji geliştirilmesinigerektirmiştir (Şekil 6).
Bu cerrahi stratejiyi kullanarak, "SwiChR++" virüs10olarak adlandırılan floresan muhabirle kaynaşmış modifiye bir channelrhodopsin anion-iletken kanalını ifade eden Cre'ye bağımlı bir AAV'yi mikroenjaktize ettik , nos1-cre farelerinin VMN'sine iki taraflı olarak. Bunu, her enjeksiyon bölgesine orta çizgiden 15° açıyla optik fiber dorsolateral implantasyonu izledi. Beklendiği gibi, viral ekspresyon VMN ile sınırlıydı ve diğer beyin bölgelerinde tespit edildi.
Şekil 1: Hipotalamik ventromedial çekirdeği hedefleyen açılı koordinatların hesaplanması için temsili örnek. Açılar ve çizgi parçaları ölçeklemek için çizilmez. (A) Bu uzunluk temel trigonometri kullanılarak hesaplanmalıdır. Bu örnekte, A = 2,03 mm. (B) Rasgele döndürme ekseninin atanmasına dayalı tahmini uzunluk. Bu örnekte, B = 7.576 mm. (C) Hesaplanan hipotenoz. Fiberoptik/iğne yerleştirme derinliğinin optimizasyon gerektiren hedef bölgeye istenilen yakınlığa bağlı olduğu unutulmamalıdır. Bu rakam Faber ve ark. 201911'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Stereotaktik kafa tutucu aparatı için ayar düğmeleri. Bu rakam Faber ve ark. 201911'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Baş tutucunun dönme merkezini hizalama. (A) Kulak çubuklarının yerleştirilmesi. (B) 0° seviye koronal dönüş sırasında (solda), dikey kaymayı ayarlamadan önce 15° dönüş sırasında ve dönüş merkezi yanlış hizalanır (ortada) ve dikey kaymayı ayarladıktan sonra 15° döndürme sırasında ve dönüş merkezi düzgün bir şekilde hizalanır (sağda). Bu rakam Faber ve ark. 201911'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bregma atama ve hayvan başını merkezi dönme eksenleriyle hizalama. (A) Tipik bregma yerleşimini gösteren temsili resim. (B) Hizalamadan önce, kafa düzken bir referans işareti çizme. (C) Dikey kaymayı ayarladıktan ve bregma'yı yeniden ayarladıktan sonra düzgün hizalanmış dönme ekseni. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Fiberoptik implantasyon prosedürü. (A) Mikroenjeksiyon (m), fiberoptik (f) ve çapa vidaları (*) için pilot deliklerin ortalama kapsamı görünümü. (B) yerleştirilen çapa vidalarının ve kemik balmumu kaplı mikroenjeksiyon matkap deliklerinin ortalama kapsamı görünümü. (C) Açılı implantasyon sırasında fiberoptiğin yerine yerleştirilmesi. (D) Temsili bilateral açılı fiberoptik yerleştirme. Noktalı siyah oklar, fiberoptiği ankraj vidalarına ve ipsilateral fiberoptiklere tutturmak için süper tutkalın kullanıldığı alanları gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Ventromedial hipotalamusun bilateral hedeflemesi için temsili sonuçlar. (A) VMN'yi hedeflemek için bilateral mikroenjeksiyon ve açılı fiberoptik stratejiyi temsil eden şematik. (B) SwiChR-GFP'nin bilateral ekspresyonını ve açılı fiberoptik sistemlerden doku hasarını gösteren temsili görüntü. 3V = üçüncü ventrikül, ARC = arcuate çekirdeği ve VMN = ventromedial çekirdek. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nörobilimdeki son gelişmeler, beyin nörositlerinin aktivitesi ve işlevi hakkında ileri içgörü ve anlayışı desteklemiştir. Bu, ayrık nöronal popülasyonları ve bunların projeksiyon alanlarını in vivo etkinleştirmek veya susturmak için optogenetik ve kemogenetik teknolojilerin uygulanmasını içerir. Daha yakın zamanlarda, bu, serbestçe hareket eden hayvanlarda tanımlanmış bir hücre tipinde nöronal aktivitenin in vivo kaydı için genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin (örneğin, GCaMP, RCaMP) ve diğer florometrik biyosensörlerin (örneğin, dopamin, norepinefrin) geliştirilmesini içermektedir. Bununla birlikte, bu teknolojilerin etkin istihdamı, ilgi çekici bölgeyi hedeflemek için başarılı stereotaktik cerrahiye dayanmaktadır. Birçok beyin bölgesini hedeflemek için uygun olan bu yöntemleri açıklayan birkaç yerleşik protokol olsa da, orta hat boyunca derin beyin bölgelerini hedeflemek önemli ek zorlukları temsil eder. Burada, açılı stereotaktik bir yaklaşımla ayrı beyin bölgelerini hedeflemek için ayrıntılı bir cerrahi teknik gösterilmiştir. Daha da önemlisi, bu teknik çeşitli nörobilim tekniklerine (örneğin optogenetik, kemogenetik ve fiber fotometri yaklaşımları) uyarlanabilir ve uygulanabilir.
Bu yaklaşımı kullanarak, nöronal nitrik oksit sintazını (VMNNOS1 nöronları) ifade eden VMN nöronlarının akut optogenetik susturulmasının farelerde insülin kaynaklı hipoglisemiye glukagon yanıtlarını körelttiği gösterilmiştir9. Biraz değiştirilmiş bir yaklaşım kullanılarak, VMN NOS1 nöronlarının1) tek taraflı aktivasyonunun, normalde hipoglisemiye yanıt için ayrılmış karşıt yanıtlar tarafından yönlendirilen sağlam hiperglisemiyi ortaya çıkardığı ve 2) savunma hareketsizliği davranışını ortaya çıkardığı gösterilmiştir. Ayrıca, bu davranışsal ve metabolik yanıtlar farklı beyin bölgelerine nöronal projeksiyonları içerir. Özellikle, stria terminalilerin ön yatak çekirdeğine yansıtan VMNNOS1 nöronlarının aktivasyonu glisemik yanıtlarda yer larken, periaqueductal griye yansıtan VMNNOS1 nöronları korku kaynaklı davranış yanıtlarına bağlıdır9.
Protokolün Kopf Model 1900 stereotaks ve beraberindeki aksesuarlara son derece özel olduğu belirtilmelidir. Bu sistem, beyin bölgelerini ayırmak için hassas, tekrarlanabilir implantasyonun yanı sıra mikroenjeksiyon sağlarken (birden fazla araç arasında ortak bir merkez çizgisi konumu ile), strateji ve yaklaşım diğer stereotaksik çerçevelere uyacak şekilde uyarlanabilir. Özellikle, açılı mikroenjeksiyonlar ve implantasyonlar yapmak için başı döndürmek yerine, alternatif bir yaklaşım aynı ilkeleri kullanmak ve bunun yerine dorsal-ventral manipülatörü döndürmektir (bkz. Correia vd.12).
Her yeni yöntemde olduğu gibi, bireylerin bir deneyin güvenilirliğini, tutarlılığını ve doğruluğunu geliştirmek için tekniği optimize etmesi kritik öneme sahiptir. Ek olarak, verilerin uygun analizi ve yorumlanması için gerekli uygun kontrollerin dahil edilmesi önemlidir. Bunlar arasında Cre-negatif çöp arkadaşı kontrollerinin kullanımı, viral muhabir kontrolleri (yani AAV-GFP), elektrofizyoloji kullanılarak ışığa bağımlı nöronal ateşleme modülasyonunun doğrulanması ve (çalışma tamamlandığında) ilgi çekici bölgede viral hedefleme ve fiberoptik yerleşimin doğrulanması sayar. Teknik hususların ve önerilen kontrollerin ayrıntılı bir incelemesi için Cardozo ve Lammel13 tarafından yayına başvurmanız önerilir.
Özetle, daha gelişmiş ve hassas sinirbilim tekniklerinin tanıtılması, beynin davranış, biliş ve fizyolojideki rolünün önemli bir ilerlemesini ve anlaşılmasını desteklemiştir ve bu gelişmeler CNS ile ilgili bozukluklar için potansiyel tedavilere yol açabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK) tarafından F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M .), Amerikan Diyabet Derneği Yenilikçi Temel Bilim Ödülü (#1-19-IBS-192'den G.J..M.)'ye) ve NIDDK destekli Beslenme Obezitesi Araştırma Merkezi (DK-035816), Diyabet Araştırma Merkezi (DK-017047) ve Diyabet, Washington Üniversitesi'nde Obezite ve Metabolizma Eğitimi T32 DK0007247 (T.H.M) hibesi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | -- | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L.
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
