Fleksibel vinklet stereotaktisk tilgang til alsidige neurovidenskabsteknikker

Summary

Beskrevet her er en stereotaktisk procedure, der kan målrette udfordrende og vanskelige at nå hjernen regioner (på grund af rumlige begrænsninger) ved hjælp af en vinklet koronar tilgang. Denne protokol kan tilpasses både muse- og rottemodeller og kan anvendes på forskellige neurovidenskabelige applikationer, herunder kanyleimplantatering og mikroinjektioner af virale konstruktioner.

Abstract

Stereotaktisk kirurgi er et vigtigt redskab i det moderne neurovidenskabslaboratorium. Men evnen til præcist og præcist at målrette vanskelige at nå hjernen regioner stadig udgør en udfordring, især når rettet mod hjernen strukturer langs midterlinjen. Disse udfordringer omfatter undgå af den overlegne sagittal sinus og tredje ventrikel og evnen til konsekvent at målrette selektive og diskrete hjernekerner. Derudover er mere avancerede neurovidenskabsteknikker (f.eks. optogenetik, fiberfotometri og to-fotonbilleddannelse) afhængige af målrettet implantation af betydelig hardware til hjernen, og rumlige begrænsninger er en almindelig hindring. Præsenteret her er en modificerbar protokol for stereotaktisk målretning af gnaver hjernestrukturer ved hjælp af en vinklet koronar tilgang. Det kan tilpasses til 1) mus eller rotte modeller, 2) forskellige neurovidenskab teknikker, og 3) flere hjerneområder. Som et repræsentativt eksempel omfatter det beregning af stereotaktiske koordinater til målretning af musens hypothalamus ventromediale kerne (VMN) for et optogenetisk hæmningseksperiment. Denne procedure begynder med den bilaterale mikroinjektion af en adeno-associeret virus (AAV), der kodning af en lysfølsom chloridkanal (SwiChR++) til en cre-afhængig musemodel efterfulgt af den vinklede bilaterale implantation af fiberoptiske kanyler. Ved hjælp af denne tilgang viser resultaterne, at aktivering af en delmængde af VMN-neuroner er nødvendig for intakte glukosetællerresponser på insulininduceret hypoglykæmi.

Introduction

Neural kontrol af adfærd, fodring og metabolisme indebærer koordinering af meget komplekse, integrative og overflødige neurokredsløb. Et drivende mål for neurovidenskab feltet er at dissekere forholdet mellem neuronal kredsløb struktur og funktion. Selvom klassiske neurovidenskabsværktøjer (dvs. læsionering, lokale farmakologiske injektioner og elektrisk stimulering) har afdækket vital viden om den rolle, som specifikke hjerneregioner, der styrer adfærd og metabolisme, er disse værktøjer begrænset af deres mangel på specificitet og reversibilitet¹.

Nylige fremskridt inden for neurovidenskab område har i høj grad forbedret evnen til at afhøre og manipulere kredsløb funktion i en celle-type specifik måde med høj spatiotemporal opløsning. Optogenetiske^2- og chemogenetiske^3-tilgange tillader f.eks. hurtig og reversibel manipulation af aktivitet hos genetisk definerede celletyper af frit bevægende dyr. Optogenetik indebærer brug af lysfølsomme ionkanaler, såkaldte channelrhodopsiner, til at kontrollere neuronal aktivitet. Nøglen til denne teknik er genlevering af channelrhodopsin og en lyskilde til at aktivere opsin. En fælles strategi for genlevering er gennem en kombination af 1) genetisk manipulerede mus, der udtrykker Cre-rekombininer i diskrete neuroner, og 2) Cre-afhængige virale vektorer, der kodning channelrhodopsin.

Mens optogenetik giver en elegant, meget præcis måde at kontrollere neuronal aktivitet, metoden er betinget af vellykket stereotaktisk mikroinjection af den virale vektor og fiberoptisk placering i en defineret hjerneregion. Selvom stereotaktiske procedurer er almindelige inden for det moderne neurovidenskabslaboratorium (og der er flere fremragende protokoller, der beskriver denne procedure)^4,5,6, at være i stand til konsekvent og reproducerativt at målrette diskrete hjerneområder langs midterlinjen (dvs. den mediobasale hypothalamus, et hjerneområde, der er afgørende for reguleringen af homøostatiske funktioner⁷) præsenterer yderligere udfordringer. Disse udfordringer omfatter undgåelse af den overlegne sagittal sinus, tredje ventrikel, og tilstødende hypothalamus kerner. Derudover er der betydelige rumlige begrænsninger for den bilaterale implantation af hardware, der er nødvendig for hæmningsundersøgelser. Med disse udfordringer i tankerne, denne protokol heri præsenterer en modificerbar procedure for målretning diskrete hjerne regioner via en vinklet stereotaktisk tilgang.

Protocol

Alle procedurer blev godkendt i overensstemmelse med National Institutes of Health, vejledningen for pleje og brug af dyr og blev godkendt af både Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Environmental Health and Safety ved University of Washington.

1. Beregning af vinklede koordinater

1. Ved hjælp af en koronar hjerne atlas, markere en ret trekant, således at hypotenus passerer gennem målet region af interesse. I det repræsentative eksempel (Figur 1) er den hypothalamus ventromediale kerne (VMN) rettet mod en 15° vinkel fra koronar midterlinjen.
   BEMÆRK: Placeringen af rotationsaksen afbildet i figur 1 (og dermed længden af side C) er vilkårlig og kan ændres for at målrette enhver hjerneregion. Selv om dette kan virke ulogisk, justerer senere trin i protokollen hovedets position i z-aksen, så dette punkt flugter med det stereotaktiske rotationscenter (se afsnit 6). Det anbefales dog ikke at overskride en koronar rotationsvinkel på 15° på grund af de fysiske begrænsninger i hovedholderapparatet.
2. Fastlæg den ønskede vinkel (a) og den anslåede længde af side B, og brug trigonometri til at beregne længden af siderne A og C. Dette trin er vigtigt for korrekt positionering af hovedet under rotation.
   BEMÆRK: I eksemplet i figur 1bruges atlasgitterlinjer til at tilnærme længden af side B, hvilket giver en længde på 7,576 mm. Disse oplysninger bruges til at beregne længden af side A:
   
   I dette eksempel angiver 2,03 mm R/L-afstanden fra midterlinjen, hvor den fiberoptiske kanyle kommer ind i hjernen, når hovedet roteres med 15°.
   1. Du kan også beregne længden af side C for at tilnærme D/V-koordinaten:
      
      BEMÆRK: 1) Længden af hypotenus (C) repræsenterer ikke injektionsdybden, men vil være nyttig til bestemmelse af D/V-koordinaten, som muligvis skal justeres for at tage højde for den øgede længde vs. side B for straight-in injektioner. Det anbefales derfor at udføre testinjektioner for at optimere D/V-koordinaten. 2) I dette eksempel rettet mod VMN opnås der to sæt koordinater: et for mikroinjektionen, der er ikke-vinklet (A/P = -1,4, R/L = 0,4 ved 0°, D/V = -5,7) og et for den vinklede fiberoptiske implantation (A/P = -1,4, R/L = 0,0 ved 15°, D/V = -5,4).

2. Udarbejdelse af stereotax til vinklet procedure

1. Bekræft, at den stereotaktiske ramme og mikromanipulatoren er kalibreret (se Kopf-manualen for fuld protokol).
2. Placer midterhøjdemåleren i hovedholderens bundplade.
3. Fastgør centreringsområdet i værktøjsholderen, og syn derefter ned i anvendelsesområdet. Juster mikromanipulatorens position, indtil sigtekornet er justeret og fokuseret på målerens sigtekorn.
   BEMÆRK: I løbet af dette trin placeres anvendelsesområdet i hovedholderens rotationscenter. Når mikromanipulatoren er etableret, bør den ikke flyttes under de resterende trin.
4. Placer ørestængerne i holderne, og centrer dem, så indikatorlinjerne på begge sider er ved 0 (Figur 3A).
5. Brug de mediale og forreste posteriorknapper på hovedholderen (figur 2) til at centrere ørestængerne i x- og y-flyene over sigtekornet på midterhøjdemåleren (Figur 3A).
6. Hvis du vil justere ørestangens position i z-aksen, skal du fjerne ørestængerne fra holderen og fjerne midterhøjdemåleren. Udskift ørestængerne, og centrer dem igen kl.
7. Syn ned i kikkerten. Brug henholdsvis den lodrette drejeknap (Figur 3B) og koronar tilt-knappen til at sænke og dreje ørestængerne, indtil anvendelsesområdets sigtekorn forbliver centreret mellem ørestængerne under hele koronarrotationen.
8. Stereotaxen er nu kalibreret og klar. Foretag ikke yderligere justeringer af hovedholderens position.

3. Fremstilling af materialer til injektion/implantation

1. Sørg for, at alle instrumenter, kirurgiske værktøjer og materialer steriliseres og placeres i et sterilt kirurgisk felt ved siden af stereotaxen.
2. Håndtere og opbevare virale konstruktioner i henhold til deres biosikkerhedsniveau og relevante institutionelle biosikkerhedskrav.
3. Træk virussen op i sprøjten, og pas på at bruge korrekt håndteringspraksis og personlige værnemidler.

4. Anæstesi

1. Optag musens kropsvægt før operationen.
2. Dybt bedøve musen ved hjælp af isoflurane.
3. Sørg for, at musen er dybt bedøvet ved at udføre en tå knivspids test, indtil den blinkende svar er fraværende. Hvis dyret fortsætter med at vise stærke reflekser, øge koncentrationen og / eller varigheden af anæstesi.
4. Påfør øjensalt på hvert øje for at holde dem fugtige under operationen.
5. Barber hovedbunden fra lige bag ørerne til lige bag øjnene med en hårklipper.
6. Giv musen IACUC-godkendt smertestillende.
7. Løbende overvåge dyret i hele den kirurgiske procedure og yde termisk støtte.

5. Kirurgisk indgreb

1. Placer hovedet i hovedholderen ved at placere de øverste snit i hullet i bidstangen, og sørg for, at tungen er under bidstangen.
2. Fastgør hovedet i ørestængerne ved forsigtigt at sætte ørestængerne i den eksterne auditive meatus, hvilket sikrer, at ørestængerne er symmetrisk placeret (typisk mellem tre og fire for en voksen mus). Dette trin er afgørende for at sikre, at hovedet er stabilt og centreret til rotation.
3. Aseptisk forberede barberet snit område med tre vekslende scrubs af betadin og alkohol podninger, eller med alternative institutionelt godkendt kirurgiske site forberedelse.
4. Placer en kirurgisk drapering over dyret for at opretholde et sterilt kirurgisk felt og for at reducere risikoen for postoperativ infektion.
5. Eksponer kraniet ved at lave et snit langs den sagittale midterlinje i hovedbunden. Skrab forsigtigt overfladen af kraniet for at fjerne enhver fascia og udsætte suturerne.
   BEMÆRK: Hvis suturlinjer er vanskelige at visualisere, kan hydrogenperoxid påføres kraniet ved hjælp af en steril bomuldspidsapplikator for at forbedre suturvisualisering.
6. Placer centreringsområdet i holderen, og centrer sigtekornet på bregma(figur 4,venstre panel). Nul mikromanipulatoren.
7. Flyt sigtekornet caudally til lambda, bemærke bregma-lambda (B-L) afstand.
   BEMÆRK: Hvis suturlinjerne ikke følger en lige linje langs midterlinjen, anbefales det at etablere midterlinjen ved hjælp af "linjen af bedste pasform" gennem både bregma og lambda. Hvis ovenstående trin følges, bør den oprindelige placering af anvendelsesområdets reticle dog være halvvejs mellem ørestængerne og nøje tilnærme B-L midline suturen.
8. Hvis B-L-afstanden er betydeligt mindre eller større end 4,21 mm, justeres den tildelte bregma gradvist for at opnå en B-L-afstand på 4,21 mm ± 0,2 mm.
9. Erstat centreringsområdet med justeringsindikatoren. Placer sonderne på lambda og bregma og juster rygstødsknappen på hovedholderen til niveau i sagittalplanet (næsen vender op eller ned), og brug derefter centreringsområdet til at omfordele bregma.
10. Brug justeringsindikatoren til at udjævne i koronarplanet ved hjælp af koronar tilt-knappen. Mål på flere punkter i hele rostral / caudal akse for at tage højde for overflade deformationer i kraniet.
11. Bemærk placeringen på skiven på koronar tilt drejeknap, da dette er 0 ° rotation position.

6. Justering af de centrale akser af rotation for vinklede koordinater

1. Fastgør centreringsområdet i værktøjsholderen, og placer mikromanipulatoren på den beregnede koordinat fra afsnit 1. Bemærk, at R/L-koordinaten for den vinklede implantation svarer til længden af side A.
   1. I eksemplet i figur 1er de vinklede koordinater for fiberoptisk placering rettet mod VMN (A/P = -1,4, R/L = [2,03] ved 0° koronar rotation, [0,00] ved 15° koronar rotation, D/V = -5,4).
2. Observation ned omfanget og markere denne koordinat (R / L 2,03 mm fra midterlinjen pr VMN eksempel; Figur 4, mellempanelet). Dette mærke repræsenterer det punkt, hvor kanylen kommer ind i hjernen, når hovedet roteres.
3. Flyt mikromanipulatoren hen over midterlinjen (R/L = 0,00). Brug koronar tilt drejeknappen til at dreje hovedet til den vinkel, der er beregnet i afsnit 1.
   1. Hvis anvendelsesområdets sigtekorn allerede er i overensstemmelse med mærket, skal du gå videre til afsnit 7.
   2. Hvis anvendelsesområdets sigtekorn ikke er på linje med referencemærket, skal du justere hovedpositionen i z-aksen ved hjælp af den lodrette skiftknap (Figur 2), indtil sigtekornet er så tæt som muligt på mærket.
4. Drej hovedet tilbage til 0° koronar position. Hvis det lodrette skift blev justeret i trin 6.3, skal du gentildele bregma ved hjælp af centreringsområdet.
5. Gentag trin 6.3 og 6.4, indtil sigtekornet konsekvent rammer referencemærket, når hovedet roteres (Figur 4C).
6. På dette tidspunkt bør det vilkårlige rotationspunkt, der er etableret i afsnit 1, nu justeres med det stereotaktiske rotationscenter.

7. Mikroinjektion

1. Placer den stereotaktiske boremaskine i holderen og manøvrer mikromanipulatoren til den første injektionskoordinat.
   1. I henhold til eksemplet til målretning af VMN skal du bore ved A/P = -1,4 og R/L = 0,4, mens hovedet er i niveau.
2. Sænk boret, indtil boret er lige over kraniet. Tænd boret, og sænk forsigtigt, indtil boret lige er boret gennem kraniet (ikke duraen).
3. Gentag for det kontralaterale injektionssted.
4. Brug en steril nåledriver til at indføre en 90° bøjning i en 27-30G nål (f.eks. af en steril insulinsprøjte på 0,5 mL), og brug den bøjede nål til forsigtigt at stikke gennem dura-materen.
5. BEMÆRK: Hvis blødningen opstår, skal du lægge pres på en steril applikator med bomuldspids og rengøres med sterilt vand, indtil blødningen er stoppet.
6. Når du er klar til at injicere, skal du forsigtigt placere en fyldt Hamilton-sprøjte i den stereotaktiske holder.
   BEMÆRK: Koordinaterne på mikromanipulatoren gælder ikke længere, når der er skiftet til et nyt værktøj. Brug midten af burrhullet som det nye mål for injektion.
7. Anbring forsigtigt nålen over burrhullet.
8. Sænk nålen, indtil den rører duraen lidt i midten af burrhullet. KRITISK: Nul mikromanipulatoren kun i z-aksen, således at koordinaterne på mikromanipulatoren til det stereotaktiske centreringsområde og boremaskine opretholdes.
9. Sænk langsomt nålen ind i hjernen, og se nøje for at sikre, at nålen ikke afbøjes på kanten af burrhullet. Fortsæt med at sænke indtil 0,05 mm ventral til D/V-injektionskoordinaten og vent 1 min. Dette ekstra trin skaber en lille "lomme" for at minimere viral tilbageløb på nålefjernelse.
10. Løft langsomt nålen til D/V-koordinaten, og start injektionen.
    BEMÆRK: Flowhastighed og volumen varierer afhængigt af målområdet og eksperimentelt design. For optogenetisk lyddæmpning af VMN-neuroner ønskes tilstrækkelig dækning, så 200 nL virus injiceres med en hastighed på 1 nL / s.
11. Efter mikroinjektion skal du vente 10 min på injektionsstedet for at minimere efflux af virus under tilbagetrækning.
12. Træk langsomt mikropipetten ud af hjernen med en omtrentlig hastighed på 1 mm/min.
13. Når nålen er fri for kraniet, skubbe en lille mængde virus for at sikre nålen ikke har tilstoppet med blod eller væv. Brug en steril applikator med bomuldsspidser til at fjerne virussen, før du fortsætter.
14. Gentag trin 7.6-7.12 for den kontralaterale side.
15. Forsegl mikroinjektionsborene med knoglevoks for at forbedre helingen (Figur 5B).

8. Fiberoptisk implantation

BEMÆRK: Efter virusinjektion implanteres bilaterale fiberoptiske kanyler i den beregnede vinkel pr. afsnit 1. Bemærk, at disse koordinater allerede skal mærkes på kraniet fra afsnit 6.

1. Gentag trin 7.1 –7.4 for de vinklede koordinater.
2. Sæt hovedet tilbage til niveau 0°-positionen.
3. Brug derefter håndboret til at producere yderligere fire huller til knogleskruerne: to skal placeres forteriorly og to posteriorly (Figur 5A). Disse vil tjene som ankre til at anbringe fiberoptik til kraniet (Figur 5D).
   BEMÆRK: Sørg for at placere hullerne langt nok væk fra de vinklede koordinatbor til at rumme den jernlevende del af fiberoptik, der sidder over kraniet.
4. Så forsigtigt som muligt skal du bruge den lille flathead skruetrækker til at indstille knogleskruerne, så de sidder fast i kraniet, men ikke trænger ind i hjernen.
5. Fastgør en fiberoptisk kanyle ind i kanyleholderen, og læg den i den stereotaktiske holder.
6. Roter hovedet til den beregnede vinkel, idet det igen bemærkes, at koordinaterne på mikromanipulatoren ikke gælder for det nye værktøj. Brug midten af de vinklede burr huller som implantation mål.
7. Sænk fiberoptisk, indtil det bare rører duraen i midten af burrhullet (Figur 5C). Nul mikromanipulatoren i z-aksen, og langsomt langsommere fiberoptisk til D / V vinklet koordinat (-5,4 pr VMN eksempel).
8. Brug cyanoacrylatgel til at forbinde den fiberoptiske ferrule til de ipsilaterale ankerskruer, og påfør derefter et accelerant med en mikropipetspids (Figur 5D).
9. Når cyanoacrylatgelen er helt hærdet, løsnes kanyleholderen forsigtigt og hæves, indtil den er fri for den fiberoptiske ferrule.
10. Gentag trin 8.5-8.9 for den kontralaterale vinklede koordinat, og niveau derefter hovedet. For ekstra sikkerhed skal du oprette en ekstra forbindelse mellem de to vinklede fiberoptiske kanyler med cyanoacrylatgelen og accelerant (Figur 5D).
11. Forbered en lille, relativt tynd mængde dental cement. Påfør på overfladen af kraniet, og sørg for grundigt at dække ankerskruerne og bunden af de fiberoptiske kanyler. Lad nok af ferrule ren til efterfølgende parring med fiberoptiske patch kabler.
12. Når cementen er færdig med at tørre, skal du fjerne musen fra det stereotaktiske apparat.
13. Placer musen i et genopretningsbur med termisk støtte. Lad det komme sig og overføre til hjemmeburet, når det ser ud til at være opmærksomt, mobilt og er ved at pleje.

9. Post-kirurgisk pleje

1. Overvåg dyr dagligt i 3 dage postoperativt for adfærd, kropsholdning, aktivitet og pleje, og hold optegnelser over fødeindtagelse og kropsvægt.
2. Hvis dyr udviser generelle indikatorer for smerte eller dårligt helbred, skal du rådføre sig med dyrlægetjenester.
3. Tillad mus mindst 2 uger til genopretning og for virale udtryk, før du starter adfærdsmæssige undersøgelser.

10. Optogenetik

1. For udførelsen af optogenetiske undersøgelser henvises til Sidor et al.⁸.
2. Valider virale udtryk og fiber placering ved afslutningen af undersøgelser.

Representative Results

Denne protokol beskriver en kirurgisk procedure for udførelse af optogenetiske undersøgelser for at afhøre den rolle, hypothalamus VMN neuroner i glykæmisk kontrol⁹. Først udnyttet var en standard (ikke-vinklet) stereotaktisk tilgang til bilateral mikroinjektion af en hæmmende channelrhodopsin virus til VMN. Mens en vinklet tilgang også ville være egnet, standard (ikke-vinklet) tilgang blev valgt, fordi det er tilstrækkeligt at målrette hjernen region af interesse og er en nem, pålidelig og konsekvent tilgang. Men i betragtning af VMN's nærhed til midterlinjen, plads begrænsninger ikke tillader ikke-vinklet implantation af bilaterale fiberoptik, nødvendiggør udviklingen af en kirurgisk strategi for præcist implantering fiberoptik i en vinkel (Figur 6).

Ved hjælp af denne kirurgiske strategi, vi microinjected en Cre-afhængige AAV udtrykker en modificeret channelrhodopsin anion-ledende kanal fusioneret med fluorescerende reporter, benævnt en "SwiChR ++" virus¹⁰, bilateralt til VMN af Nos1-cre mus. Dette blev efterfulgt af implantation af en optisk fiber dorsolateral til hvert injektionssted i en 15 ° vinkel fra midterlinjen. Som forventet var viralt udtryk begrænset til VMN og blev ikke opdaget i andre hjerneområder.

Figur 1: Repræsentativt eksempel på beregning af vinklede koordinater rettet mod den hypothalamus ventromediale kerne. Vinkler og stregsegmenter tegnes ikke til skalering. (A) Denne længde skal beregnes ved hjælp af grundlæggende trigonometri. I dette eksempel A = 2,03 mm. (B) Anslået længde baseret på tildeling af vilkårlig rotationsakse. I dette eksempel B = 7,576 mm. (C) Beregnet hypotenus. Det skal bemærkes, at dybden af fiberoptisk / nål indsættelse afhænger af den ønskede nærhed til målområdet, som kræver optimering. Dette tal er ændret fra Faber et al. 2019¹¹. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: Justeringsknapper til det stereotaktiske hovedholderapparat. Dette tal er ændret fra Faber et al. 2019¹¹. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: Justering af hovedholderens rotationscenter. (A) Placering af ørestængerne. (B) Observation ned anvendelsesområdet under 0 ° niveau koronar rotation (venstre), under 15 ° rotation før justering af den lodrette skift, og midten af rotation er forkert justeret (midten), og under 15 ° rotation efter justering af lodret skift, og midten af rotation er korrekt justeret (højre). Dette tal er ændret fra Faber et al. 2019¹¹. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: Tildeling af bregma og justering af dyrehovedet med centrale akser af rotation. (A) Repræsentativt billede, der angiver typisk bregmaplacering. (B) Tegne et referencetegn, mens hovedet er niveau, før justering. (C) Korrekt justeret rotationsakse efter justering af det lodrette skift og justering af bregma. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: Fiberoptisk implantationsprocedure. (A) Centreringsudseende udsyn af pilothuller til mikroinjektion (m), fiberoptisk (f) og ankerskruer (*). (B) Centering omfang visning af implanterede anker skruer, og knogle voks dækket mikroinjection borehuller. (C) Placering af fiberoptik på plads under vinklet implantation. (D) Repræsentativ bilateral vinklet fiberoptisk placering. Stiplede sorte pile angiver områder, hvor superlim bruges til at forankre fiberoptisk til ankerskruerne og ipsilateral fiberoptisk. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: Repræsentative resultater for bilateral målretning af ventromediale hypothalamus. (A) Skematisk repræsenterer bilateral mikroinjektion og vinklet fiberoptisk strategi for målretning af VMN. (B) Repræsentativt billede, der viser bilateralt udtryk for SwiChR-GFP og vævsskader fra vinklede fiberoptiske tarmkanale. 3V = tredje ventrikel, ARC = arcuate kerne, og VMN = ventromedial kerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Nylige fremskridt inden for neurovidenskab har understøttet avanceret indsigt og forståelse i aktiviteten og funktionen af hjerne neurokredsløb. Dette omfatter anvendelse af optogenetiske og kemiske teknologier til at aktivere eller lukke munden diskrete neuronale populationer og deres projektion sites in vivo. På det seneste har dette omfattet udvikling af genetisk kodede calciumindikatorer (f.eks. GCaMP, RCaMP) og andre fluorometriske biosensorer (f.eks. dopamin, noradrenalin) til in vivo-registrering af neuronal aktivitet i en defineret celletype hos frit bevægende dyr. Men effektiv beskæftigelse af disse teknologier er afhængig af en vellykket stereotaktisk kirurgi til at målrette regionen af interesse. Mens der er flere etablerede protokoller, der beskriver disse metoder, som er egnede til at målrette mange hjerneområder, repræsenterer målretning af dybe hjerneområder langs midterlinjen betydelige yderligere udfordringer. Demonstreret her er en detaljeret kirurgisk teknik til målretning diskrete hjerneområder via en vinklet stereotaktisk tilgang. Vigtigere er det, at denne teknik kan tilpasses og anvendes til en bred vifte af neurovidenskabsteknikker (dvs. optogenetik, chemogenetik og fiberfotometritilgange).

Ved hjælp af denne tilgang, Det er vist, at akut optogenetisk lyddæmpning af VMN neuroner udtrykker neuronal nitrogenoxidsyntase (VMN^NOS1 neuroner) blunts glukagon reaktioner på insulin-induceret hypoglykæmi i mus⁹. Ved hjælp af en lidt modificeret tilgang, er det yderligere påvist, at ensidig aktivering af VMN^NOS1 neuroner 1) fremkalder robust hyperglykæmi, der er drevet af kontraregulatoriske reaktioner, der normalt er forbeholdt reaktion på hypoglykæmi, og 2) fremkalder defensiv immobilitet adfærd. Desuden involverer disse adfærdsmæssige og metaboliske reaktioner neuronale fremskrivninger til forskellige hjerneområder. Specifikt er aktiveringen af VMN^NOS1 neuroner, der projicerer til stria terminalis forreste seng, involveret i glykæmiske reaktioner, mens VMN^NOS1 neuroner, der projicerer til periaqueductal grå, er knyttet til frygt-inducerede adfærdsresponser⁹.

Det skal bemærkes, at protokollen er meget specifik for Kopf Model 1900 stereotax og ledsagende tilbehør. Mens dette system muliggør præcis, reproducerbar implantation samt mikroinjektion til diskrete hjerneområder (med en fælles centerlinjeposition på tværs af flere værktøjer), kan strategien og tilgangen tilpasses til andre stereotaxiske rammer. Specifikt, i stedet for at dreje hovedet til at udføre vinklede mikroinjections og implantationer, en alternativ tilgang er at udnytte de samme principper og rotere ryg-ventral manipulator i stedet (se Correia et al.¹²).

Som med enhver ny metode er det afgørende for enkeltpersoner at optimere teknikken til at forbedre et eksperiments pålidelighed, konsistens og nøjagtighed. Desuden er det vigtigt at medtage den nødvendige passende kontrol for korrekt analyse og fortolkning af data. Disse omfatter brugen af Cre-negative littermate kontrol, viral reporter kontrol (dvs. AAV-GFP), verifikation af lys-afhængige neuronal fyring graduering ved hjælp af elektrofysiologi, og (efter undersøgelsens afslutning) validering af viral målretning og fiberoptisk placering i området af interesse. Det anbefales at henvise til Cardozos og Lammel^13's offentliggørelse for at få en detaljeret gennemgang af tekniske overvejelser og foreslåede kontroller.

Sammenfattende har indførelsen af mere avancerede og præcise neurovidenskabsteknikker understøttet en betydelig fremskridt og forståelse af hjernens rolle i adfærd, kognition og fysiologi, og disse fremskridt kan føre til potentielle terapier for CNS-relaterede lidelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiberoptic Cannulae	Doric Lenses	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Customizable
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System	Kopf	Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge	Kopf	Model 1900-51
Kopf Model 1905 Alignment Indicator	Kopf	Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1911
Kopf Model 1915 Centering Scope	Kopf	Model 1915
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 1922
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator	Kopf	Model 1940
Micro4 Microinjection System	World Precision Instruments	--
Mouse bone screws	Plastics One	00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule	Thor Labs	XCL
Surgical Drill	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill