Neuroscience

बहुमुखी तंत्रिका विज्ञान तकनीकों के लिए अनुकूलनीय कोणीय स्टीरियोटाटिक दृष्टिकोण

Published: May 7, 2020 doi: 10.3791/60965

Chelsea L. Faber¹, Miles E. Matsen¹, Thomas H. Meek¹, Jordan E. Krull¹, Gregory J. Morton¹

¹Department of Medicine, University of Washington

Summary

यहां वर्णित एक स्टीरियोटैक्टिक प्रक्रिया है जो कोण वाले कोरोनल दृष्टिकोण का उपयोग करके चुनौतीपूर्ण और मुश्किल से पहुंचने वाले मस्तिष्क क्षेत्रों (स्थानिक सीमाओं के कारण) को लक्षित कर सकती है। यह प्रोटोकॉल माउस और चूहा मॉडल दोनों के लिए अनुकूलनीय है और कैनुला प्रत्यारोपण और वायरल निर्माणों के माइक्रोइंजेक्शन सहित विविध न्यूरोसाइंटिफिक अनुप्रयोगों पर लागू किया जा सकता है।

Abstract

स्टीरियोटाैक्टिक सर्जरी आधुनिक न्यूरोसाइंस लैब में एक आवश्यक उपकरण है। हालांकि, ठीक है और सही मुश्किल से लक्षित करने के लिए मस्तिष्क क्षेत्रों तक पहुंचने की क्षमता अभी भी एक चुनौती प्रस्तुत करता है, खासकर जब मिडलाइन के साथ मस्तिष्क संरचनाओं को लक्षित । इन चुनौतियों में बेहतर सगितीय साइनस और तीसरे वेंट्रिकल से बचना और चयनात्मक और असतत मस्तिष्क नाभिक को लगातार लक्षित करने की क्षमता शामिल है। इसके अलावा, अधिक उन्नत तंत्रिका विज्ञान तकनीक (जैसे, ऑप्टोजेनेटिक्स, फाइबर फोटोमेट्री, और दो-फोटॉन इमेजिंग) मस्तिष्क के लिए महत्वपूर्ण हार्डवेयर के लक्षित प्रत्यारोपण पर भरोसा करते हैं, और स्थानिक सीमाएं एक आम बाधा हैं। यहां प्रस्तुत एक कोण कोरोनल दृष्टिकोण का उपयोग कर कृंतक मस्तिष्क संरचनाओं के स्टीरियोटाटिक लक्ष्यीकरण के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल है। इसे 1) माउस या चूहा मॉडल, 2) विभिन्न तंत्रिका विज्ञान तकनीकों और 3) कई मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में, इसमें ऑप्टोजेनेटिक अवरोध प्रयोग के लिए माउस हाइपोथैलेमिक वेंट्रोमेडियल न्यूक्लियस (वीएमएन) को लक्षित करने के लिए स्टीरियोटाटिक निर्देशांक की गणना शामिल है। यह प्रक्रिया एक एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) के द्विपक्षीय माइक्रोइंजेक्शन के साथ शुरू होती है, जो एक हल्के-संवेदनशील क्लोराइड चैनल (SwiChR +++) को क्रे-निर्भर माउस मॉडल में एन्कोडिंग करता है, जिसके बाद फाइबरोप्टिक कैनुला के कोण द्विपक्षीय प्रत्यारोपण होते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, निष्कर्ष ों से पता चलता है कि इंसुलिन-प्रेरित हाइपोग्लाइसीमिया के लिए बरकरार ग्लूकोज काउंटररेगुलेटरी प्रतिक्रियाओं के लिए वीएमएन न्यूरॉन्स के सबसेट की सक्रियता की आवश्यकता होती है।

Introduction

व्यवहार, भोजन और चयापचय के तंत्रिका नियंत्रण में अत्यधिक जटिल, एकीकृत और अनावश्यक न्यूरोसर्किट का समन्वय शामिल है। तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र का एक ड्राइविंग लक्ष्य न्यूरोनल सर्किट संरचना और कार्य के बीच संबंधों को विच्छेदन करना है। यद्यपि शास्त्रीय तंत्रिका विज्ञान उपकरण (यानी, घाव, स्थानीय औषधीय इंजेक्शन, और विद्युत उत्तेजना) ने विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों की भूमिका के बारे में महत्वपूर्ण ज्ञान का पर्दाफाश किया है जो व्यवहार और चयापचय को नियंत्रित करते हैं, ये उपकरण विशिष्टता और रिवर्सिबिलिटी¹की कमी से सीमित हैं।

तंत्रिका विज्ञान के क्षेत्र में हाल ही में प्रगति ने उच्च स्थानिक संकल्प के साथ सेल-प्रकार विशिष्ट तरीके से सर्किट फ़ंक्शन से पूछताछ करने और हेरफेर करने की क्षमता में काफी सुधार किया है। उदाहरण के लिए, ऑप्टोजेनेटिक² और केमोजेनेटिक³ दृष्टिकोण, आनुवंशिक रूप से परिभाषित सेल प्रकार के स्वतंत्र रूप से चलने वाले जानवरों में गतिविधि के तेजी से और प्रतिवर्ती हेरफेर की अनुमति देते हैं। ऑप्टोजेनेटिक्स में न्यूरोनल गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए हल्के-संवेदनशील आयन चैनलों का उपयोग शामिल है, जो चैनलरोडोप्सिन कहा जाता है। इस तकनीक की कुंजी चैनलरोडोप्सिन की जीन डिलीवरी और ऑप्सिन को सक्रिय करने के लिए प्रकाश का स्रोत है। जीन वितरण के लिए एक आम रणनीति 1 के संयोजन के माध्यम से है) आनुवंशिक रूप से इंजीनियर चूहों असतत न्यूरॉन्स में क्रे-रिकॉम्बिनेंट व्यक्त करते हैं, और 2) क्रे-निर्भर वायरल वैक्टर चैनलररोडोसिन को एन्कोडिंग करते हैं।

जबकि ऑप्टोजेनेटिक्स न्यूरोनल गतिविधि को नियंत्रित करने के लिए एक सुरुचिपूर्ण, अत्यधिक सटीक साधन प्रदान करता है, विधि एक परिभाषित मस्तिष्क क्षेत्र में वायरल वेक्टर और फाइबरऑप्टिक प्लेसमेंट के सफल स्टीरियोटैक्टिक माइक्रोइंजेक्शन पर निर्भर है। यद्यपि आधुनिक तंत्रिका विज्ञान प्रयोगशाला के भीतर स्टीरियोटैक्टिक प्रक्रियाएं आम हैं (और इस प्रक्रिया का वर्णन करने वाले कई उत्कृष्ट प्रोटोकॉल हैं)^4,^5,^6,मिडलाइन के साथ असतत मस्तिष्क क्षेत्रों को लगातार और पुन: उत्पन्न करने में सक्षम होने के नाते (यानी, मेडियोबेसल हाइपोथैलेमस, होमओस्टेटिक कार्यों के नियमन के लिए महत्वपूर्ण मस्तिष्क क्षेत्र⁷⁾अतिरिक्त चुनौतियां प्रस्तुत करता है। इन चुनौतियों में सुपीरियर सैगिटल साइनस, तीसरा वेंट्रिकल और आसन्न हाइपोथैलेमिक न्यूक्लियी से बचना शामिल है । इसके अलावा, हार्डवेयर के द्विपक्षीय प्रत्यारोपण के लिए महत्वपूर्ण स्थानिक सीमाएं हैं जो अवरोध अध्ययन के लिए आवश्यक हैं। इन चुनौतियों को ध्यान में रखते हुए, यह प्रोटोकॉल एक कोणीय स्टीरियोटैक्टिक दृष्टिकोण के माध्यम से असतत मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए एक संशोधित प्रक्रिया प्रस्तुत करता है।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं को स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों, जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के अनुसार मंजूरी दे दी गई थी और वाशिंगटन विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) और पर्यावरण स्वास्थ्य और सुरक्षा दोनों द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. कोण निर्देशांक की गणना

एक कोरोनल मस्तिष्क एटलस का उपयोग करना, एक सही त्रिकोण चिह्नित इतना है कि हाइपोटेनस ब्याज के लक्ष्य क्षेत्र के माध्यम से गुजरता है । प्रतिनिधि उदाहरण में(चित्रा 1),हाइपोथैलेमिक वेंट्रोमेडियल न्यूक्लियस (वीएमएन) कोरोनल मिडलाइन से 15 डिग्री कोण पर लक्षित है।
नोट: चित्रा 1 में चित्रित रोटेशन की धुरी की नियुक्ति (और इस प्रकार, पक्ष सी की लंबाई) मनमाना है और किसी भी मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । हालांकि यह प्रतिसहज लग सकता है, प्रोटोकॉल में बाद के कदम जेड-एक्सिस में सिर की स्थिति को समायोजित करेंगे जैसे कि यह बिंदु रोटेशन के स्टीरियोटैक्टिक केंद्र के साथ संरेखित होता है (धारा 6 देखें)। हालांकि, हेड होल्डर उपकरण की शारीरिक बाधाओं के कारण 15 डिग्री के कोरोनल रोटेशन कोण से अधिक नहीं होने की सिफारिश की जाती है।
साइड बी के वांछित कोण (ए) और अनुमानित लंबाई की स्थापना करें और पक्ष ए और सी की लंबाई की गणना करने के लिए त्रिकोणमिति का उपयोग करें। रोटेशन के दौरान सिर को ठीक से पोजिशनिंग के लिए यह कदम महत्वपूर्ण है।
नोट: चित्रा 1में उदाहरण में, एटलस ग्रिडलाइन का उपयोग साइड बी की लंबाई के अनुमानित करने के लिए किया जाता है, जो 7.576 मिमी की लंबाई देता है। इस जानकारी का उपयोग साइड ए की लंबाई की गणना करने के लिए किया जाता है:

इस उदाहरण में, 2.03 मिमी मिडलाइन से आर/एल दूरी को इंगित करता है जिस पर सिर को 15 डिग्री तक घुमाए जाने पर फाइबरऑप्टिक कैनुला मस्तिष्क में प्रवेश करता है।
1. वैकल्पिक रूप से, डी/वी समन्वय का अनुमान लगाने के लिए साइड सी की लंबाई की गणना करें:
  
  नोट: 1) हाइपोटेन्यूज़ (सी) की लंबाई इंजेक्शन की गहराई का प्रतिनिधित्व नहीं करती है, लेकिन डी/वी समन्वय का निर्धारण करने में सहायक होगी, जिसे सीधे इंजेक्शन के लिए बढ़ी हुई लंबाई बनाम साइड बी के लिए समायोजित करने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । इसलिए डी/वी समन्वय को अनुकूलित करने के लिए परीक्षण इंजेक्शन करने की सिफारिश की जाती है । 2) वीएमएन को लक्षित करने वाले इस उदाहरण में, निर्देशांक के दो सेट प्राप्त किए जाते हैं: एक माइक्रोइंजेक्शन के लिए जो गैर-कोण (ए/पी = -1.4, आर/एल = 0.4 पर 0 डिग्री, D/V =-5.7) और कोण फाइबरऑप्टिक प्रत्यारोपण के लिए एक (A/P =-1.4, आर/एल = 0.0 पर 15 डिग्री, D/V =-5.4) ।

2. कोण प्रक्रिया के लिए स्टीरियोकर की तैयारी

पुष्टि करें कि स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम और माइक्रोमैनीपुलेटर को कैलिब्रेट किया गया है (पूर्ण प्रोटोकॉल के लिए कोफ मैनुअल देखें)।
हेड होल्डर बेस प्लेट के सॉकेट में सेंटर हाइट गेज रखें।
उपकरण धारक में केंद्रित गुंजाइश को सुरक्षित करें, फिर दायरे को नीचे रखें। माइक्रोमैनीपुलेटर की स्थिति को तब तक समायोजित करें जब तक कि क्रॉसहेयर गठबंधन न हों और गेज क्रॉसहेयर पर केंद्रित न हों।
नोट: इस कदम के दौरान, गुंजाइश रोटेशन के प्रमुख धारक के केंद्र के फोकल विमान में तैनात किया जा रहा है । एक बार स्थापित होने के बाद, शेष चरणों के दौरान माइक्रोमैनीपुलेटर को स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए।
कान की सलाखों को धारकों में रखें और उन्हें इस तरह केंद्रित करें कि दोनों तरफ संकेतक रेखाएं 0(चित्रा 3 ए)पर हों।
केंद्र ऊंचाई गेज(चित्रा 3A)के क्रॉसहेयर के ऊपर एक्स-और वाई-प्लेन में कान की सलाखों को केंद्र-संरेखित करने के लिए हेड होल्डर(चित्रा 2)पर मध्य-पार्श्व और पूर्वकाल-पीछे घुंडी का उपयोग करें।
जेड-एक्सिस में कान बार की स्थिति को संरेखित करने के लिए, धारक से कान की सलाखों को हटा दें और केंद्र ऊंचाई गेज को हटा दें। कान सलाखों को बदलें और उन्हें फिर से 0 पर केंद्र।
गुंजाइश नीचे दृष्टि । ऊर्ध्वाधर बदलाव घुंडी(चित्रा 3B)और कोरोनल झुकाव घुंडी का उपयोग करें, क्रमशः, कम करने के लिए और कान सलाखों को घुमाने जब तक गुंजाइश क्रॉसहेयर कोरोनल रोटेशन भर में कान सलाखों के बीच केंद्रित रहते हैं ।
स्टीरियोकर अब कैलिब्रेट और तैयार है। हेड होल्डर की स्थिति में कोई और फेरबदल न करें।

3. इंजेक्शन/प्रत्यारोपण के लिए सामग्री की तैयारी

सुनिश्चित करें कि सभी उपकरणों, सर्जिकल उपकरणों, और सामग्रियों को निष्फल किया गया है और स्टीरियोकर के बगल में एक बाँझ शल्य क्षेत्र में रखा गया है।
उनके जैवसेफ्टी स्तर और प्रासंगिक संस्थागत जैवसेफ्टी नियामक आवश्यकताओं के अनुसार वायरल निर्माणों को संभालें और स्टोर करें।
वायरस को सिरिंज में खींचें, उचित हैंडलिंग प्रथाओं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरणों का उपयोग करने के लिए देखभाल कर रहे हैं।

4. एनेस्थीसिया

सर्जरी से पहले माउस के शरीर के वजन को रिकॉर्ड करें।
आइसोफ्लुनाणे का उपयोग करके माउस को गहराई से एनेस्थेटाइज करें।
सुनिश्चित करें कि माउस को एक टो चुटकी परीक्षण करके गहराई से एनेस्थेटाइज्ड किया गया है जब तक कि फ्लिंचिंग प्रतिक्रिया अनुपस्थित न हो जाए। यदि जानवर मजबूत सजगता दिखाना जारी रखता है, तो संज्ञाहरण की एकाग्रता और/या अवधि में वृद्धि करें ।
सर्जरी के दौरान उन्हें नम रखने के लिए प्रत्येक आंख में आंखों का मरहम लगाएं।
एक बाल क्लिपर के साथ आंखों के ठीक पीछे करने के लिए कान के ठीक पीछे से खोपड़ी दाढ़ी।
आईएसीयूसी-अनुमोदित एनाल्जेसिक के साथ माउस प्रदान करें।
लगातार शल्य चिकित्सा प्रक्रिया के दौरान जानवर की निगरानी और थर्मल समर्थन प्रदान करते हैं।

5. सर्जिकल प्रक्रिया

काटने के बार में अंतर में ऊपरी छेदियों को रखकर सिर को सिर धारक में रखें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि जीभ काटने की पट्टी से नीचे है।
कान की सलाखों में धीरे-धीरे कान की सलाखों को बाहरी श्रवण मीटस में डालकर सिर को सुरक्षित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कान की सलाखों को सममित रखा जाता है (आमतौर पर वयस्क माउस के लिए तीन और चार के बीच)। यह कदम यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सिर स्थिर है और रोटेशन के लिए केंद्रित है।
असेप्टिक रूप से मुंडा चीरा क्षेत्र को बीटाडीन और अल्कोहल झाड़ू के तीन वैकल्पिक स्क्रब के साथ तैयार करें, या वैकल्पिक संस्थागत रूप से अनुमोदित सर्जिकल साइट तैयार करने के साथ।
एक बाँझ सर्जिकल क्षेत्र को बनाए रखने और पोस्ट-ऑपरेटिव संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए जानवर के ऊपर एक सर्जिकल ड्रेप रखें।
खोपड़ी के धनुन मिडलाइन के साथ एक चीरा बनाकर खोपड़ी का पर्दाफाश करें। किसी भी प्रावरणी को हटाने और टांके का पर्दाफाश करने के लिए खोपड़ी की सतह को धीरे-धीरे परिमार्जन करें।
नोट: यदि सीवन लाइनों की कल्पना करना मुश्किल है, तो हाइड्रोजन पेरोक्साइड को सीवन दृश्य में सुधार करने के लिए बाँझ कपास-इत्तला देने वाले एप्लिकेटर का उपयोग करके खोपड़ी पर लागू किया जा सकता है।
धारक में केंद्रित गुंजाइश रखें और ब्रेग्मा(चित्रा 4, बाएंपैनल) पर क्रॉसहेयर केंद्र करें। माइक्रोमैनीपुलेटर को शून्य करें।
क्रॉसहेयर को लैम्ब्डा में ले जाएं, ब्रेग्मा-लैम्ब्डा (बी-एल) दूरी को नोट करते हुए।
नोट: यदि सीवन लाइनें मिडलाइन के साथ एक सीधी रेखा का पालन नहीं करती हैं, तो ब्रेग्मा और लैम्ब्डा दोनों के माध्यम से "सर्वश्रेष्ठ फिट की रेखा" का उपयोग करके मिडलाइन स्थापित करने की सिफारिश की जाती है। हालांकि, यदि उपरोक्त चरणों का पालन किया जाता है, तो स्कोप रेटिकल का प्रारंभिक प्लेसमेंट कान की सलाखों के बीच आधे रास्ते होना चाहिए और बी-एल मिडलाइन सीवन को बारीकी से अनुमानित करना चाहिए।
यदि बी-एल दूरी 4.21 मिमी से काफी कम या अधिक है, तो 0.2 मिमी ± 4.21 मिमी की बी-एल दूरी प्राप्त करने के लिए सौंपे गए ब्रेग्मा को संवर्द्धित रूप से समायोजित करें।
संरेखण संकेतक के साथ केंद्रित दायरे को बदलें। लैम्ब्डा और ब्रेग्मा पर जांच रखें और हेड होल्डर पर पृष्ठीय झुकाव घुंडी को सगिटल विमान (नाक ऊपर या नीचे का सामना करना पड़ रहा है) में स्तर पर समायोजित करें, फिर ब्रीग्मा को फिर से असाइन करने के लिए केंद्र की गुंजाइश का उपयोग करें।
कोरोनल झुकाव घुंडी का उपयोग कर कोरोनल विमान में स्तर के लिए संरेखण संकेतक का उपयोग करें। खोपड़ी में सतह विरूपण के लिए खाते में रोस्ट्रल/कौडल धुरी भर में कई बिंदुओं पर उपाय ।
कोरोनल झुकाव घुंडी के डायल पर स्थिति पर ध्यान दें, क्योंकि यह 0° रोटेशन स्थिति है।

6. कोण निर्देशांक के लिए रोटेशन के केंद्रीय कुल्हाड़ियों को संरेखित करना

टूल धारक में केंद्रित दायरे को सुरक्षित करें और माइक्रोमैनीपुलेटर को धारा 1 से गणना किए गए समन्वय के लिए स्थिति में रखें। ध्यान दें कि कोण प्रत्यारोपण के लिए आर/एल समन्वय पक्ष ए की लंबाई से मेल खाती है ।
1. चित्रा 1में उदाहरण में, वीएमएन को लक्षित करने वाले फाइबरऑप्टिक प्लेसमेंट के लिए कोणीय निर्देशांक (ए/पी =-1.4, आर/एल = [2.03] 0 डिग्री कोरोनल रोटेशन पर, [0.00] 15 डिग्री कोरोनल रोटेशन, डी/वी = -5.4) पर हैं।
गुंजाइश नीचे sighting और इस समन्वय (आर/एल २.०३ मिमी VMN उदाहरण के अनुसार मिडलाइन से चिह्नित; चित्रा 4,मध्य पैनल) । यह निशान उस बिंदु का प्रतिनिधित्व करता है जिस पर सिर घुमाए जाने के बाद कैनुला मस्तिष्क में प्रवेश करेगा।
मिडलाइन (आर/एल = 0.00) पर माइक्रोमैनीपुलेटर को फिर से स्थान दिया। धारा 1 में गणना कोण के लिए सिर को घुमाने के लिए कोरोनल झुकाव घुंडी का प्रयोग करें।
1. यदि दायरा क्रॉसहेयर पहले से ही निशान के साथ लाइन करते हैं, तो धारा 7 पर आगे बढ़ें।
2. यदि स्कोप क्रॉसहेयर संदर्भ चिह्न के साथ लाइन नहीं करते हैं, तो ऊर्ध्वाधर बदलाव घुंडी(चित्रा 2)का उपयोग करके जेड-एक्सिस में सिर की स्थिति को समायोजित करें जब तक कि क्रॉसहेयर लाइन को निशान के यथासंभव करीब न जाए।
सिर को 0° कोरोनल स्थिति में वापस घुमाएं। यदि ऊर्ध्वाधर बदलाव को चरण 6.3 में समायोजित किया गया था, तो केंद्रित दायरे का उपयोग करके ब्रेग्मा को पुनः असाइन करें।
जब तक सिर घुमाया जाता है तो क्रॉसहेयर लगातार संदर्भ चिह्न को हिट नहीं करते हैं(चित्र 4सी) तक चरण 6.3 और 6.4 दोहराएं।
इस बिंदु पर, धारा 1 में स्थापित रोटेशन के मनमाने बिंदु को अब रोटेशन के स्टीरियोटाटिक केंद्र के साथ गठबंधन किया जाना चाहिए।

7. माइक्रोइंजेक्शन

धारक में स्टीरियोटैक्टिक ड्रिल रखें और पहले इंजेक्शन समन्वय के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर को पैंतरेबाज़ी करें।
1. वीएमएन को लक्षित करने के लिए उदाहरण के अनुसार, ए/पी = -1.4 और आर/एल = 0.4 पर ड्रिल करें जबकि सिर स्तर का है।
ड्रिल को तब तक कम करें जब तक कि थोड़ा खोपड़ी के ठीक ऊपर न हो जाए। ड्रिल चालू करें, और धीरे-धीरे कम करें जब तक कि बिट खोपड़ी (ड्यूरा नहीं) के माध्यम से ड्रिल नहीं किया जाता है।
कॉन्ट्रालेट्रल इंजेक्शन साइट के लिए दोहराएं।
एक बाँझ सुई-ड्राइवर का उपयोग करें एक 27-30G सुई में एक 90 ° मोड़ शुरू करने के लिए (उदाहरण के लिए, एक बाँझ 0.5 एमएल इंसुलिन सिरिंज की), और तुला सुई का उपयोग करने के लिए धीरे ड्यूरा मेटर के माध्यम से प्रहार।
नोट: यदि रक्तस्राव होता है, तो बाँझ कपास-इत्तला देने वाले एप्लिकेटर के साथ दबाव लागू करें और बाँझ पानी से साफ करें जब तक कि रक्तस्राव बंद न हो जाए।
जब इंजेक्शन के लिए तैयार है, ध्यान से स्टीरियोटिक धारक में एक भरा हैमिल्टन सिरिंज जगह है ।
नोट: माइक्रोमैनीपुलेटर पर निर्देशांक अब एक नए उपकरण पर स्विच करने के बाद लागू नहीं होते हैं। इंजेक्शन के लिए नए लक्ष्य के रूप में बर्र छेद के केंद्र का उपयोग करें।
सावधानी से बर्र छेद के ऊपर सुई की स्थिति।
सुई को तब तक कम करें जब तक कि यह बर्र छेद के केंद्र के भीतर ड्यूरा को थोड़ा छू न जाए। क्रिटिकल: केवल जेड-एक्सिस में माइक्रोमैनिपुलेटर को शून्य करें, जैसे कि स्टीरियोटैक्टिक सेंटरिंग स्कोप और ड्रिल के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर पर निर्देशांक बनाए रखे जाते हैं।
धीरे-धीरे सुई को मस्तिष्क में कम करें, यह सुनिश्चित करने के लिए बारीकी से देखते हैं कि सुई बर्र छेद के किनारे पर विक्षेपित नहीं होती है। डी/वी इंजेक्शन समन्वय करने के लिए 0.05 मिमी वेंट्रल तक कम करना जारी रखें और 1 मिनट इंतजार करें। यह अतिरिक्त कदम सुई हटाने पर वायरल बैकफ्लो को कम करने के लिए एक छोटा "जेब" बनाता है।
धीरे-धीरे सुई को डी/वी समन्वय के लिए उठाएं और इंजेक्शन शुरू करें।
नोट: प्रवाह दर और मात्रा लक्ष्य क्षेत्र और प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर अलग-अलग होगी। वीएमएन न्यूरॉन्स के ऑप्टोजेनेटिक सिलने के लिए पर्याप्त कवरेज वांछित है, इसलिए 200 एनएल वायरस को 1 एनएल/एस की दर से इंजेक्ट किया जाता है ।
माइक्रोइंजेक्शन के बाद, वापसी के दौरान वायरस के efflux को कम करने के लिए इंजेक्शन साइट पर 10 मिनट रुको ।
धीरे-धीरे 1 मिमी/मिनट की अनुमानित दर पर मस्तिष्क से माइक्रोपिपेट वापस लें।
एक बार सुई खोपड़ी के स्पष्ट है, वायरस की एक छोटी मात्रा को बाहर निकालने के लिए सुनिश्चित करें कि सुई रक्त या ऊतक के साथ भरा नहीं है । जारी रखने से पहले वायरस को दूर करने के लिए एक बाँझ कपास इत्तला दे दी applicator का प्रयोग करें ।
कॉन्ट्रालेट्रल साइड के लिए 7.6-7.12 कदम दोहराएं।
उपचार(चित्रा 5B)में सुधार करने के लिए हड्डी मोम के साथ माइक्रोइंजेक्शन बर्र छेद सील करें।

8. फाइबरऑप्टिक प्रत्यारोपण

नोट: वायरल इंजेक्शन के बाद, द्विपक्षीय फाइबरऑप्टिक कैनुलास को प्रति सेक्शन 1 गणना कोण पर प्रत्यारोपित किया जाता है। ध्यान दें कि इन निर्देशांक पहले से ही धारा 6 से खोपड़ी पर चिह्नित किया जाना चाहिए ।

कोण वाले निर्देशांक के लिए चरण 7.1 -7.4 दोहराएं।
सिर को 0 डिग्री की स्थिति के स्तर पर वापस करें।
इसके बाद, हड्डी शिकंजा के लिए चार अतिरिक्त छेद का उत्पादन करने के लिए हाथ ड्रिल का उपयोग करें: दो पूर्वकाल और दो पीछे रखा जाना चाहिए(चित्रा 5A)। ये खोपड़ी(चित्रा 5D)के लिए फाइबरऑप्टिक्स प्रत्यय करने के लिए लंगर के रूप में काम करेंगे ।
नोट: खोपड़ी के ऊपर बैठने वाले फाइबरऑप्टिक के फेरुल हिस्से को समायोजित करने के लिए कोणीय समन्वय बर्र छेद से काफी दूर छेद को अंतरिक्ष में सुनिश्चित करें।
जितना संभव हो धीरे-धीरे, हड्डी शिकंजा सेट करने के लिए छोटे फ्लैटहेड पेचकश का उपयोग करें ताकि वे खोपड़ी में दृढ़ता से बैठते हैं लेकिन मस्तिष्क में प्रवेश नहीं करते हैं।
कैनुला धारक में एक फाइबरोप्टिक कैनुला क्लैंप करें और इसे स्टीरियोटैक्टिक धारक में रखें।
सिर को गणना कोण पर घुमाएं, फिर से यह देखते हुए कि माइक्रोमैनीपुलेटर पर निर्देशांक नए उपकरण पर लागू नहीं होते हैं। प्रत्यारोपण लक्ष्य के रूप में कोण burr छेद के केंद्र का प्रयोग करें।
फाइबरऑप्टिक को तब तक कम करें जब तक कि यह बर्र होल(चित्रा 5C)के केंद्र के भीतर ड्यूरा को छूता है। जेड-एक्सिस में माइक्रोमैनिपलेटर को शून्य करें, फिर धीरे-धीरे फाइबरऑप्टिक को डी/वी कोण वाले समन्वय (-5.4 प्रति वीएमएन उदाहरण) में धीमी करें।
फाइबरऑप्टिक फेरुल को इप्सिलाटेरल एंकर शिकंजा से जोड़ने के लिए साइनोएक्रिलेट जेल का उपयोग करें, फिर माइक्रोपिपेट टिप(चित्रा 5D)के साथ एक एक्सीलेंट लागू करें।
एक बार जब साइनोएक्रिलेट जेल पूरी तरह से कठोर हो जाता है, तो कैनुला धारक को धीरे-धीरे ढीला कर दें और फाइबरऑप्टिक फेरुले के स्पष्ट होने तक उठाएं।
कॉन्ट्रालेट्रल एंगल्ड समन्वय के लिए चरण 8.5-8.9 दोहराएं, फिर सिर को स्तर दें। अतिरिक्त सुरक्षा के लिए, साइनोएक्रिलेट जेल और एक्सीलेंट(चित्रा 5डी)के साथ दो कोण वाले फाइबरऑप्टिक कैनुलास के बीच एक अतिरिक्त संबंध बनाएं।
दंत सीमेंट की एक छोटी, अपेक्षाकृत पतली मात्रा तैयार करें। खोपड़ी की सतह पर लागू करें, अच्छी तरह से लंगर शिकंजा और फाइबरऑप्टिक कैनुलास के आधार को कवर करने के लिए सुनिश्चित कर रही है। फाइबरऑप्टिक पैच केबल के साथ बाद में संभोग के लिए फेरुल साफ करने के लिए पर्याप्त छोड़ दें।
एक बार सीमेंट सूखी पूरा हो जाने के बाद, माउस को स्टीरियोटैक्टिक उपकरण से हटा दें।
थर्मल समर्थन के साथ एक वसूली पिंजरे में माउस रखें। इसे ठीक करने और घर के पिंजरे में स्थानांतरित करने की अनुमति दें एक बार यह सतर्क, मोबाइल दिखाई देता है, और सजने लगा रहा है।

9. शल्य चिकित्सा के बाद की देखभाल

व्यवहार, मुद्रा, गतिविधि और सौंदर्य के लिए 3 दिनों के बाद ऑपरेटिव के लिए दैनिक जानवरों की निगरानी करें, और भोजन के सेवन और शरीर के वजन के रिकॉर्ड रखें।
यदि पशु दर्द या खराब स्वास्थ्य के किसी भी सामान्य संकेतक प्रदर्शित करते हैं, तो पशुचिकित्सा सेवाओं से परामर्श करें।
चूहों को व्यवहार अध्ययन शुरू करने से पहले वसूली के लिए और वायरल अभिव्यक्ति के लिए कम से कम 2 सप्ताह की अनुमति दें।

10. ऑप्टोजेनेटिक्स

ऑप्टोजेनेटिक्स अध्ययन के प्रदर्शन के लिए, सिडोर एट अल⁸का उल्लेख करें।
अध्ययन के पूरा होने पर वायरल अभिव्यक्ति और फाइबर प्लेसमेंट मान्य करें।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल ग्लाइसेमिक नियंत्रण⁹में हाइपोथैलेमिक वीएमएन न्यूरॉन्स की भूमिका से पूछताछ करने के लिए ऑप्टोजेनेटिक्स अध्ययन करने के लिए एक शल्य प्रक्रिया का वर्णन करता है। पहला उपयोग वीएमएन को एक निरोधात्मक चैनलरोडोसिन वायरस के द्विपक्षीय माइक्रोइंजेक्शन के लिए एक मानक (गैर-कोण) स्टीरियोटैक्टिक दृष्टिकोण था। जबकि एक कोण दृष्टिकोण भी उपयुक्त होगा, मानक (गैर-कोण) दृष्टिकोण का चयन किया गया था क्योंकि यह ब्याज के मस्तिष्क क्षेत्र को लक्षित करने के लिए पर्याप्त है और एक आसान, विश्वसनीय और सुसंगत दृष्टिकोण है। हालांकि, मिडलाइन के लिए वीएमएन की निकटता को देखते हुए, अंतरिक्ष की कमी ने द्विपक्षीय फाइबरऑप्टिक्स के गैर-कोण प्रत्यारोपण की अनुमति नहीं दी, जिससे एक कोण(चित्र 6)पर फाइबरऑप्टिक्स को ठीक से प्रत्यारोपित करने के लिए एक शल्य रणनीति के विकास की आवश्यकता हुई।

इस सर्जिकल रणनीति का उपयोग करते हुए, हमने फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के साथ जुड़े एक संशोधित चैनलरोडोप्सिन एनियन-कंडक्टिंग चैनल को व्यक्त करते हुए एक क्रे-निर्भर एएवी को माइक्रोजेक्ट किया, जिसे "SwiChR ++" वायरस¹⁰के रूप में संदर्भित किया गया है, जो द्विपक्षीय रूप से Nos1-cre चूहों के वीएमएन के लिए है। इसके बाद मिडलाइन से 15 डिग्री कोण पर प्रत्येक इंजेक्शन साइट पर ऑप्टिक फाइबर डोरसोलेट्रल का प्रत्यारोपण किया गया। जैसा कि अपेक्षित था, वायरल अभिव्यक्ति वीएमएन तक सीमित थी और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों में नहीं पाई गई थी।

चित्र 1: कोणीय निर्देशांक की गणना का प्रतिनिधि उदाहरण हाइपोथैलेमिक वेंट्रोमेडियल नाभिक को लक्षित करता है। कोण और लाइन सेगमेंट पैमाने पर तैयार नहीं किए जाते हैं। (क)इस लंबाई की गणना बुनियादी त्रिकोणमिति का उपयोग करके की जानी चाहिए । इस उदाहरण में, रोटेशन की मनमानी धुरी के असाइनमेंट के आधार पर ए = 2.03 मिमी(बी)अनुमानित लंबाई। इस उदाहरण में, बी = 7.576 मिमी(C)गणना हाइपोटेनयूज। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि फाइबरऑप्टिक/सुई सम्मिलन की गहराई लक्ष्य क्षेत्र के वांछित निकटता पर निर्भर करती है, जिसके लिए अनुकूलन की आवश्यकता होती है । इस आंकड़े को फेबर एट अल 2019¹¹से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 2: स्टीरियोटैक्टिक हेड होल्डर उपकरण के लिए समायोजन घुंडी। इस आंकड़े को फेबर एट अल 2019¹¹से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 3: रोटेशन के हेड होल्डर सेंटर को संरेखित करना। (क)कान की सलाखों को पोजिशनिंग करना। (ख)ऊर्ध्वाधर बदलाव को समायोजित करने से पहले 15 डिग्री रोटेशन के दौरान 0 डिग्री स्तर कोरोनल रोटेशन (बाएं) के दौरान दायरे को देखना, और रोटेशन का केंद्र गलत (मध्य) है, और ऊर्ध्वाधर बदलाव को समायोजित करने के बाद 15 डिग्री रोटेशन के दौरान, और रोटेशन का केंद्र ठीक से गठबंधन किया जाता है (दाएं)। इस आंकड़े को फेबर एट अल 2019¹¹से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 4: ब्रेग्मा को निर्दिष्ट करना और रोटेशन के केंद्रीय कुल्हाड़ियों के साथ पशु सिर को संरेखित करना। (क) विशिष्ट ब्रेग्मा प्लेसमेंट का संकेत देने वाली प्रतिनिधि छवि। (ख)संरेखण से पहले सिर के स्तर के समय संदर्भ चिह्न खींचते हुए। (ग)ऊर्ध्वाधर बदलाव को समायोजित करने और ब्रेग्मा को पुनः समायोजित करने के बाद, रोटेशन की ठीक से गठबंधन धुरी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्रा 5: फाइबरऑप्टिक प्रत्यारोपण प्रक्रिया। (A)माइक्रोइंजेक्शन (एम), फाइबरऑप्टिक (एफ), और एंकर शिकंजा (*) के लिए पायलट छेद का केंद्रित स्कोप दृश्य। (ख)प्रत्यारोपित लंगर शिकंजा के केंद्र गुंजाइश दृश्य, और हड्डी मोम कवर माइक्रोइंजेक्शन ड्रिल छेद । (ग)कोण प्रत्यारोपण के दौरान फाइबरऑप्टिक को जगह में डालने की स्थिति। (घ)प्रतिनिधि द्विपक्षीय कोण फाइबरऑप्टिक प्लेसमेंट । बिंदीदार काले तीर क्षेत्रों में सुपर गोंद लंगर शिकंजा और ipsilateral फाइबरऑप्टिक के लिए फाइबरऑप्टिक लंगर के लिए प्रयोग किया जाता है संकेत मिलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

चित्र 6: वेंट्रोमेडियल हाइपोथैलेमस के द्विपक्षीय लक्ष्यीकरण के लिए प्रतिनिधि परिणाम। (क)वीएमएन को लक्षित करने के लिए द्विपक्षीय माइक्रोइंजेक्शन और कोणीय फाइबरऑप्टिक रणनीति का प्रतिनिधित्व करने वाला योजनाबद्ध । (ख)प्रतिनिधि छवि जो स्वीचआर-जीएफपी की द्विपक्षीय अभिव्यक्ति और कोणीय फाइबरोप्टिक ट्रैक्ट से ऊतक क्षति दिखाती है । 3V = तीसरा वेंट्रिकल, एआरसी = आर्कुएट न्यूक्लियस, और वीएमएन = वेंट्रोमेडियल न्यूक्लियस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

तंत्रिका विज्ञान में हाल ही में प्रगति ने मस्तिष्क न्यूरोसर्किट की गतिविधि और कार्य में उन्नत अंतर्दृष्टि और समझ का समर्थन किया है। इसमें विवो में असतत न्यूरोनल आबादी और उनके प्रक्षेपण स्थलों को सक्रिय या मौन करने के लिए ऑप्टोजेटिक और केमोजेनेटिक प्रौद्योगिकियों का अनुप्रयोग शामिल है। हाल ही में, इसमें आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम संकेतकों (जैसे, जीसीएएमपी, आरपीएमपी) और अन्य फ्लोरोमेट्रिक बायोसेंसर (जैसे, डोपामाइन, नोरेपिनेफ्रीन) के विकास को स्वतंत्र रूप से चलती जानवरों में एक परिभाषित सेल प्रकार में न्यूरोनल गतिविधि की वीवो रिकॉर्डिंग में शामिल किया गया है। हालांकि, इन प्रौद्योगिकियों का प्रभावी रोजगार ब्याज के क्षेत्र को लक्षित करने के लिए सफल स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी पर निर्भर करता है । जबकि इन तरीकों का वर्णन करने वाले कई स्थापित प्रोटोकॉल हैं, जो कई मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए उपयुक्त हैं, मिडलाइन के साथ गहरे मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करना महत्वपूर्ण अतिरिक्त चुनौतियों का प्रतिनिधित्व करता है। यहां प्रदर्शित एक कोण स्टीरियोटैक्टिक दृष्टिकोण के माध्यम से असतत मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए एक विस्तृत शल्य चिकित्सा तकनीक है। महत्वपूर्ण बात यह है कि इस तकनीक को न्यूरोसाइंस तकनीकों (यानी ऑप्टोजेनेटिक्स, केमोजेनेटिक्स और फाइबर फोटोमेट्री दृष्टिकोण) की विविध श्रृंखला पर अनुकूलित और लागू किया जा सकता है।

इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, यह दिखाया गया है कि वीएमएन न्यूरॉन्स की तीव्र ऑप्टोजेनेटिक साइलेंसिंग न्यूरोनल नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस (वीएमएन^{एनओएस 1} न्यूरॉन्स) को व्यक्त करने से चूहों⁹में इंसुलिन-प्रेरित हाइपोग्लाइसीमिया के लिए ग्लूकागन प्रतिक्रियाएं कुंद होती हैं। थोड़ा संशोधित दृष्टिकोण का उपयोग करके, यह आगे प्रदर्शित किया जाता है कि वीएमएन^{एनओएस 1} न्यूरॉन्स 1 की एकतरफा सक्रियता) मजबूत हाइपरग्लाइसेमिया को प्रकाश में डालती है जो सामान्य रूप से हाइपोग्लाइसीमिया की प्रतिक्रिया के लिए आरक्षित प्रतिक्रियाओं से प्रेरित होती है, और 2) रक्षात्मक गतिशीलता व्यवहार को प्रकाश में डालती है। इसके अलावा, इन व्यवहार और मेटाबोलिक प्रतिक्रियाओं में मस्तिष्क के अलग-अलग क्षेत्रों में न्यूरोनल अनुमान शामिल हैं। विशेष रूप से, स्ट्रारिया टर्मिनलिस के पूर्वकाल बिस्तर नाभिक के लिए पेश VMN^NOS1 न्यूरॉन्स की सक्रियता ग्लाइसेमिक प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं, जबकि वीएमएन^{एनओएस 1} न्यूरॉन्स पेरिआक्विक्टल ग्रे से पेश डर प्रेरित व्यवहार प्रतिक्रियाओं से जुड़े हुए हैं⁹।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रोटोकॉल Kopf मॉडल 1900 स्टीरियोकर और साथ सामान के लिए अत्यधिक विशिष्ट है। हालांकि यह प्रणाली मस्तिष्क क्षेत्रों (कई उपकरणों में एक सामान्य सेंटरलाइन स्थिति के साथ) को असतत करने के लिए सटीक, प्रजनन प्रत्यारोपण के साथ-साथ माइक्रोइंजेक्शन को सक्षम बनाती है, रणनीति और दृष्टिकोण को अन्य स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम के अनुरूप अनुकूलित किया जा सकता है। विशेष रूप से, कोण वाले माइक्रोइंजेक्शन और प्रत्यारोपण करने के लिए सिर को घुमाने के बजाय, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण एक ही सिद्धांतों का उपयोग करना और इसके बजाय पृष्ठीय-वेंट्रल जोड़तोड़ को घुमाना है (कोरिया एट अल¹²देखें)।

किसी भी नई विधि के साथ, व्यक्तियों के लिए प्रयोग की विश्वसनीयता, स्थिरता और सटीकता में सुधार करने के लिए तकनीक का अनुकूलन करना महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, डेटा के उचित विश्लेषण और व्याख्या के लिए आवश्यक उपयुक्त नियंत्रण शामिल करना महत्वपूर्ण है। इनमें क्रे-निगेटिव लिटरमेट कंट्रोल्स का उपयोग, वायरल रिपोर्टर कंट्रोल (यानी एएवी-जीएफपी), इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग करके प्रकाश पर निर्भर न्यूरोनल फायरिंग मॉड्यूलेशन का सत्यापन, और (अध्ययन पूरा होने पर) ब्याज के क्षेत्र में वायरल टार्गेटिंग और फाइबरऑप्टिक प्लेसमेंट का सत्यापन शामिल है। तकनीकी विचारों और सुझाए गए नियंत्रणों की विस्तृत समीक्षा के लिए कार्डोज़ो और लैमेल¹³ द्वारा प्रकाशन का उल्लेख करने की सिफारिश की जाती है।

संक्षेप में, अधिक उन्नत और सटीक तंत्रिका विज्ञान तकनीकों की शुरूआत ने व्यवहार, अनुभूति और शरीर विज्ञान में मस्तिष्क की भूमिका की एक महत्वपूर्ण उन्नति और समझ का समर्थन किया है, और ये प्रगति सीएनएस से संबंधित विकारों के लिए संभावित उपचारों का कारण बन सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डायबिटीज एंड डाइजेस्टिव एंड किडनी डिजीज (एनआईडीके) ग्रांट F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (जीजे.M.), एक अमेरिकन डायबिटीज एसोसिएशन अभिनव बुनियादी विज्ञान पुरस्कार (#1-19-IBS-१९२ जीजे.M.) और NIDDK वित्त पोषित पोषण मोटापा अनुसंधान केंद्र (डीके-035816), मधुमेह अनुसंधान केंद्र (डीके-017047) और मधुमेह, मोटापा और चयापचय प्रशिक्षण अनुदान T32 DK0007247 (T.H.M) वाशिंगटन विश्वविद्यालय में ।

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiberoptic Cannulae	Doric Lenses	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Customizable
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System	Kopf	Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge	Kopf	Model 1900-51
Kopf Model 1905 Alignment Indicator	Kopf	Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1911
Kopf Model 1915 Centering Scope	Kopf	Model 1915
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 1922
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator	Kopf	Model 1940
Micro4 Microinjection System	World Precision Instruments	--
Mouse bone screws	Plastics One	00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule	Thor Labs	XCL
Surgical Drill	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill

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References

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Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).

Neuroscience

बहुमुखी तंत्रिका विज्ञान तकनीकों के लिए अनुकूलनीय कोणीय स्टीरियोटाटिक दृष्टिकोण

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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