Tilpasningsdyktig vinklet stereotaktisk tilnærming for allsidige nevrovitenskapsteknikker

Summary

Beskrevet her er en stereotaktisk prosedyre som kan målrette utfordrende og vanskelig tilgjengelige hjerneregioner (på grunn av romlige begrensninger) ved hjelp av en vinklet koronar tilnærming. Denne protokollen er tilpasningsdyktig til både mus- og rottemodeller og kan brukes på forskjellige nevrovitenskapelige applikasjoner, inkludert kanyleimplantasjon og mikroinjeksjoner av virale konstruksjoner.

Abstract

Stereotaktisk kirurgi er et viktig verktøy i det moderne nevrovitenskapslaboratoriet. Evnen til å målrette mot vanskelige hjerneregioner er imidlertid fortsatt en utfordring, spesielt når man retter seg mot hjernestrukturer langs midtlinjen. Disse utfordringene inkluderer å unngå den overlegne skytten sinus og tredje ventrikel og evnen til konsekvent å målrette selektive og diskrete hjernekjerner. I tillegg er mer avanserte nevrovitenskapelige teknikker (f.eks. optogenetikk, fiberfotometri og to-fotonavbildning) avhengige av målrettet implantasjon av betydelig maskinvare til hjernen, og romlige begrensninger er en vanlig hindring. Presentert her er en modifiserbar protokoll for stereotaktisk målretting av gnagerhjernestrukturer ved hjelp av en vinklet koronal tilnærming. Det kan tilpasses 1) mus- eller rottemodeller, 2) ulike nevrovitenskapsteknikker og 3) flere hjerneregioner. Som et representativt eksempel inkluderer det beregning av stereotaktiske koordinater for målretting av musen hypothalamus ventromedial kjerne (VMN) for et optogenetisk hemmingseksperiment. Denne prosedyren begynner med bilateral mikroinjeksjon av et adeno-assosiert virus (AAV) som koder en lysfølsom kloridkanal (SwiChR ++) til en Cre-avhengig musemodell, etterfulgt av vinklet bilateral implantasjon av fiberoptisk kanyle. Ved hjelp av denne tilnærmingen viser funn at aktivering av en undergruppe av VMN-nevroner er nødvendig for intakt glukose kontraregulatorisk respons på insulinindusert hypoglykemi.

Introduction

Nevral kontroll av atferd, fôring og metabolisme innebærer koordinering av svært komplekse, integrative og overflødige nevrokretser. Et drivende mål for nevrovitenskapsfeltet er å dissekere forholdet mellom nevronal kretsstruktur og funksjon. Selv om klassiske nevrovitenskapelige verktøy (dvs. lesjon, lokale farmakologiske injeksjoner og elektrisk stimulering) har avdekket viktig kunnskap om rollen til spesifikke hjerneregioner som kontrollerer atferd og metabolisme, er disse verktøyene begrenset av deres mangel på spesifisitet og reversibilitet¹.

Nylige fremskritt innen nevrovitenskap har forbedret evnen til å forhøre og manipulere kretsfunksjonen på en cellespesifikk måte med høy romlig oppløsning. Optogenetiske^2- og kjemogenetiske^{3-tilnærminger,} for eksempel, tillater rask og reversibel manipulering av aktivitet i genetisk definerte celletyper av fritt bevegelige dyr. Optogenetikk innebærer bruk av lysfølsomme ionkanaler, kalt channelrhodopsins, for å kontrollere nevronaktivitet. Nøkkelen til denne teknikken er genlevering av channelrhodopsin og en lyskilde for å aktivere opsin. En vanlig strategi for genlevering er gjennom en kombinasjon av 1) genmodifiserte mus som uttrykker Cre-rekombininase i diskrete nevroner, og 2) Cre-avhengige virale vektorer som koder channelrhodopsin.

Mens optogenetikk gir en elegant, svært presis måte å kontrollere nevronaktivitet, metoden er betinget av vellykket stereotaktisk mikroinjeksjon av viral vektor og fiberoptisk plassering i en definert hjerneregion. Selv om stereotaktiske prosedyrer er vanlig i det moderne nevrovitenskapslaboratoriet (og det er flere gode protokoller som beskriver denne prosedyren)^4,5,6, å kunne konsekvent og reprodusere diskrete hjerneregioner langs midtlinjen (dvs. middelmådig hypothalamus, et hjerneområde som er kritisk for reguleringen av homeostatiske funksjoner⁷) gir ytterligere utfordringer. Disse utfordringene inkluderer å unngå den overlegne skytten sinus, tredje ventrikel og tilstøtende hypothalamuskjerner. I tillegg er det betydelige romlige begrensninger for bilateral implantasjon av maskinvare som kreves for hemmingsstudier. Med disse utfordringene i tankene presenterer denne protokollen heri en modifiserbar prosedyre for å målrette diskrete hjerneregioner via en vinklet stereotaktisk tilnærming.

Protocol

Alle prosedyrer ble godkjent i samsvar med National Institutes of Health, Guide for the Care and Use of Animals og ble godkjent av både Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og Environmental Health and Safety ved University of Washington.

1. Beregning av vinklede koordinater

1. Bruk et koronal hjerneatlas, merk en høyre trekant slik at hypotenusen passerer gjennom målområdet av interesse. I det representative eksemplet (figur 1) er den hypothalamus ventromediale kjernen (VMN) rettet mot en 15° vinkel fra koronal midtlinjen.
   MERK: Plasseringen av rotasjonsaksen som er avbildet i figur 1 (og dermed lengden på side C) er vilkårlig og kan endres for å målrette mot ethvert hjerneområde. Selv om dette kan virke kontraintuitivt, vil senere trinn i protokollen justere posisjonen til hodet i z-aksen slik at dette punktet stemmer overens med det stereotaktiske rotasjonssenteret (se avsnitt 6). Det anbefales imidlertid ikke å overskride en koronarrotasjonsvinkel på 15° på grunn av fysiske begrensninger i hodeholderapparatet.
2. Etablere ønsket vinkel (a) og estimert lengde på side B og bruke trigonometri for å beregne lengden på side A og C. Dette trinnet er viktig for riktig plassering av hodet under rotasjon.
   MERK: I eksemplet i figur 1brukes atlasstøttelinjer til å anslå lengden på side B, noe som gir en lengde på 7,576 mm. Denne informasjonen brukes til å beregne lengden på side A:
   
   I dette eksemplet indikerer 2,03 mm R/L-avstanden fra midtlinjen der den fiberoptiske kanylen kommer inn i hjernen når hodet roteres med 15°.
   1. Du kan eventuelt beregne lengden på side C for å anslå D/V-koordinaten:
      
      MERK: 1) Lengden på hypotenusen (C) representerer ikke injeksjonsdybden, men vil være nyttig for å bestemme D/V-koordinaten, som kanskje må justeres for å imøtekomme den økte lengden vs. side B for rett inn injeksjoner. Det anbefales derfor å utføre testinjeksjoner for å optimalisere D/V-koordinaten. 2) I dette eksemplet rettet mot VMN oppnås to sett med koordinater: ett for mikroinjeksjonen som ikke er vinklet (A/P = -1,4, R/L = 0,4 ved 0°, D/V = -5,7) og en for vinklet fiberoptisk implantasjon (A/P = -1,4, R/L = 0,0 ved 15°, D/V = -5,4).

2. Klargjøring av stereotaxen for vinklet prosedyre

1. Kontroller at den stereotaktiske rammen og mikromanipulatoren er kalibrert (se Kopf manual for full protokoll).
2. Plasser den midterste høydemåleren i kontakten på hodeholderens bunnplate.
3. Fest sentreringsomfanget i verktøyholderen, og se deretter ned i omfanget. Juster mikromanipulatorens posisjon til trådkorset er justert og fokusert på målkorset.
   MERK: I løpet av dette trinnet plasseres omfanget i fokusplanet til hodeholderens rotasjonssenter. Når den er etablert, bør mikromanipulatoren ikke flyttes under de resterende trinnene.
4. Plasser ørestengene i holderne og midtstill dem slik at indikatorlinjene på begge sider er på 0 (Figur 3A).
5. Bruk medial-laterale og fremre-bakre knotter på hodeholderen (Figur 2) til å midtstille ørestengene i x- og y-plan over trådkorset på senterhøydemåleren (Figur 3A).
6. For å justere ørestangposisjonen i z-aksen, fjern ørestengene fra holderen og fjern senterhøydemåleren. Sett på plass ørestengene og midtstill dem igjen kl. 0.
7. Se ned i omfanget. Bruk den vertikale skiftknappen (figur 3B) og koronarvinkelknappen til å senke og rotere ørestengene til trådkorset forblir sentrert mellom ørestengene gjennom koronalrotasjon.
8. Stereotaxen er nå kalibrert og klar. Ikke foreta ytterligere justeringer av posisjonen til hodeholderen.

3. Fremstilling av materialer for injeksjon/implantasjon

1. Sørg for at alle instrumenter, kirurgiske verktøy og materialer steriliseres og plasseres i et sterilt kirurgisk felt ved siden av stereotaxen.
2. Håndtere og lagre virale konstruksjoner i henhold til deres biosikkerhetsnivå og relevante institusjonelle biosikkerhetsregulatoriske krav.
3. Trekk viruset inn i sprøyten, pass på å bruke riktig håndteringspraksis og personlig verneutstyr.

4. Anestesi

1. Registrer musens kroppsvekt før operasjonen.
2. Bedøv musen dypt ved hjelp av isofluran.
3. Forsikre deg om at musen er dypt bedøvet ved å utføre en tåklemmetest til den flinching responsen er fraværende. Hvis dyret fortsetter å vise sterke reflekser, øker konsentrasjonen og / eller varigheten av anestesi.
4. Påfør øyesalve på hvert øye for å holde dem fuktige under operasjonen.
5. Barber hodebunnen fra like bak ørene til rett bak øynene med en hårklipper.
6. Gi musen IACUC-godkjent smertestillende.
7. Overvåk dyret kontinuerlig gjennom hele den kirurgiske prosedyren og gi termisk støtte.

5. Kirurgisk prosedyre

1. Plasser hodet i hodeholderen ved å plassere de øvre snittene i gapet i bitebaren, og sørg for at tungen er under bitebaren.
2. Fest hodet i ørestengene ved å forsiktig sette ørestengene inn i den eksterne hørbare meatusen, og sørg for at ørestengene er symmetrisk plassert (vanligvis mellom tre og fire for en voksen mus). Dette trinnet er avgjørende for å sikre at hodet er stabilt og sentrert for rotasjon.
3. Aseptisk forberede barbert snittområde med tre vekslende skrubber av betadine og alkohol vattpinner, eller med alternativ institusjonelt godkjent kirurgisk sted forberedelse.
4. Plasser en kirurgisk gardin over dyret for å opprettholde et sterilt kirurgisk felt og for å redusere risikoen for postoperativ infeksjon.
5. Utsett skallen ved å lage et snitt langs den sagittale midtlinjen i hodebunnen. Skrap forsiktig overflaten av skallen for å fjerne fascia og eksponere suturene.
   MERK: Hvis suturlinjer er vanskelige å visualisere, kan hydrogenperoksid påføres skallen ved hjelp av en steril bomullsspisset applikator for å forbedre suturvisualiseringen.
6. Plasser midtpunktet i holderen og midtstill trådkorset på bregma (Figur 4, venstre panel). Null mikromanipulatoren.
7. Flytt trådkorset årsaksmessig til lambda, og legg merke til bregma-lambda (B-L) avstand.
   MERK: Hvis suturlinjene ikke følger en rett linje langs midtlinjen, anbefales det å etablere midtlinjen ved hjelp av "linjen med best passform" gjennom både bregma og lambda. Imidlertid, hvis trinnene ovenfor følges, bør den første plasseringen av omfangssekken være halvveis mellom ørestengene og nært omtrentlig B-L midtlinje sutur.
8. Hvis B-L-avstanden er betydelig mindre eller større enn 4,21 mm, justerer du den tilordnede bregmaen trinnvis for å oppnå en B-L-avstand på 4,21 mm ± 0,2 mm.
9. Erstatt midtstillingsområdet med justeringsindikatoren. Plasser sondene på lambda og bregma og juster dorsal vippeknappen på hodeholderen til å flate ut i sagittalplanet (nesen vendt opp eller ned), og bruk deretter det sentrerte omfanget til å tilordne bregma på nytt.
10. Bruk justeringsindikatoren til å utjevne i koronalplanet ved hjelp av koronalvinkelknappen. Mål på flere punkter gjennom rostral/kaudal aksen for å gjøre rede for overflatedeformasjoner i skallen.
11. Legg merke til posisjonen på urskiven på koronarvinkelknappen, da dette er 0° rotasjonsposisjon.

6. Justere de sentrale rotasjonsaksene for vinklede koordinater

1. Fest senterområdet i verktøyholderen og plasser mikromanipulatoren til den beregnede koordinaten fra avsnitt 1. Vær oppmerksom på at R/L-koordinaten for den vinklede implantasjonen tilsvarer lengden på side A.
   1. I eksemplet i figur 1er de vinklede koordinatene for fiberoptisk plassering rettet mot VMN (A/P = -1,4, R/L = [2,03] ved 0° coronal rotasjon, [0,00] ved 15° coronal rotasjon, D/V = -5,4).
2. Se ned på området og merk denne koordinaten (R/L 2,03 mm fra midtlinjen i henhold til VMN-eksemplet; Figur 4, midtre panel). Dette merket representerer punktet der kanylen kommer inn i hjernen når hodet er rotert.
3. Flytt mikromanipulatoren over midtlinjen (R/L = 0,00). Bruk koronalvinkelknappen til å rotere hodet til vinkelen som er beregnet i avsnitt 1.
   1. Hvis trådkorset allerede er på linje med merket, går du videre til avsnitt 7.
   2. Hvis trådkorset ikke er på linje med referansemerket, justerer du hodeposisjonen i z-aksen ved hjelp av den vertikale skiftknappen (figur 2) til trådkorset stiller seg opp så nært som mulig til merket.
4. Drei hodet tilbake til 0° koronal posisjon. Hvis det vertikale skiftet ble justert i trinn 6.3, tilordner du bregma på nytt ved hjelp av det midterste området.
5. Gjenta trinn 6.3 og 6.4 til trådkorset konsekvent treffer referansemerket når hodet roteres (Figur 4C).
6. På dette tidspunktet skal det vilkårlige rotasjonspunktet som er etablert i avsnitt 1 nå være på linje med det stereotaktiske rotasjonssenteret.

7. Mikroinjeksjon

1. Plasser den stereotaktiske boret i holderen og manøvrer mikromanipulatoren til den første injeksjonskoordinaten.
   1. I henhold til eksemplet for målretting av VMN, borer du ved A/P = -1,4 og R/L = 0,4 mens hodet er i vater.
2. Senk boret til boret er like over skallen. Slå på boret, og senk forsiktig til boret nettopp har boret gjennom skallen (ikke dura).
3. Gjenta for det kontralaterale injeksjonsstedet.
4. Bruk en steril nålefører til å introdusere en 90° bøyning i en 27-30 G nål (f.eks. av en steril 0,5 ml insulinsprøyte), og bruk den bøyde kanylen til å stikke forsiktig gjennom dura materen.
5. MERK: Hvis blødning oppstår, bruk trykk med en steril bomullsspisset applikator og rengjør med sterilt vann til blødningen har stoppet.
6. Når du er klar til å injisere, legg forsiktig en fylt Hamilton-sprøyte i stereotaktisk holder.
   MERK: Koordinatene på mikromanipulatoren gjelder ikke lenger etter at du har byttet til et nytt verktøy. Bruk midten av burr hullet som det nye målet for injeksjon.
7. Plasser nålen forsiktig over burrhullet.
8. Senk nålen til den berører duraen litt i midten av burrhullet. KRITISK: Nullstill mikromanipulatoren bare i z-aksen, slik at koordinatene på mikromanipulatoren for det stereotaktiske sentreringsområdet og boret opprettholdes.
9. Senk nålen sakte ned i hjernen, og se nøye på for å sikre at nålen ikke avbøyer på kanten av burrhullet. Fortsett å senke til 0,05 mm ventral til D/V injeksjonskoordinaten og vent i 1 min. Dette ekstra trinnet skaper en liten "lomme" for å minimere viral tilbakestrømning på nålfjerning.
10. Løft kanylen langsomt til D/V-koordinaten og start injeksjonen.
    MERK: Strømningshastigheten og volumet vil variere avhengig av målområdet og eksperimentell design. For optogenetisk silencing av VMN-nevroner er det ønskelig med tilstrekkelig dekning, slik at 200 nL virus injiseres med en hastighet på 1 nL / s.
11. Etter mikroinjeksjon, vent 10 min på injeksjonsstedet for å minimere efflux av virus under abstinens.
12. Trekk mikropipetten langsomt ut av hjernen med en omtrentlig hastighet på 1 mm/min.
13. Når nålen er klar av skallen, kaste ut et lite volum virus for å sikre at nålen ikke har tilstoppet med blod eller vev. Bruk en steril bomullsspissapplikator for å fjerne viruset før du fortsetter.
14. Gjenta trinn 7.6-7.12 for den kontralaterale siden.
15. Forsegle mikroinjeksjonshullene med benvoks for å forbedre helbredelsen (Figur 5B).

8. Fiberoptisk implantasjon

MERK: Etter viral injeksjon implanteres bilaterale fiberoptiske kanyler i beregnet vinkel i henhold til avsnitt 1. Vær oppmerksom på at disse koordinatene allerede skal merkes på skallen fra § 6.

1. Gjenta trinn 7.1 –7.4 for de vinklede koordinatene.
2. Sett hodet tilbake i nivå 0°-stilling.
3. Deretter bruker du håndboret til å produsere fire ekstra hull for beinskruene: to skal plasseres fremre og to bakre (Figur 5A). Disse vil tjene som ankre for å feste fiberoptikken til skallen (Figur 5D).
   MERK: Pass på at du deler hullene langt nok unna de vinklede koordinatgravhullene for å imøtekomme gjæringsdelen av fiberoptisk som sitter over skallen.
4. Så forsiktig som mulig, bruk den lille flathodeskrutrekkeren til å sette beinskruene slik at de sitter fast i skallen, men ikke trenger inn i hjernen.
5. Klem en fiberoptisk kanyle inn i kanyleholderen og legg den i stereotaktisk holder.
6. Roter hodet til den beregnede vinkelen, og legg merke til igjen at koordinatene på mikromanipulatoren ikke gjelder for det nye verktøyet. Bruk midten av de vinklede burrhullene som implantasjonsmål.
7. Senk fiberoptisk til den bare berører duraen i midten av burrhullet (Figur 5C). Null mikromanipulatoren i z-aksen, og sakte langsommere fiberoptisk til D / V vinklet koordinat (-5,4 per VMN-eksempel).
8. Bruk cyanoacrylatgel til å koble den fiberoptiske ferrule til de ipsilaterale ankerskruene, og påfør deretter en akselerant med en mikropipettespiss (Figur 5D).
9. Når cyanoacrylatgelen er fullstendig herdet, løsner du kanyleholderen forsiktig og hever til den er klar av den fiberoptiske ferrule.
10. Gjenta trinn 8,5-8,9 for den kontralaterale vinklede koordinaten, og jevn deretter hodet. For ekstra sikkerhet, lag en ekstra forbindelse mellom de to vinklede fiberoptiske kanylene med cyanoacrylatgelen og akseleranten (Figur 5D).
11. Forbered en liten, relativt tynn mengde tannsement. Påfør på overflaten av skallen, sørg for å dekke ankerskruene og bunnen av de fiberoptiske kanylene grundig. La ferruleen være ren for etterfølgende parring med de fiberoptiske patchkablene.
12. Når sementen er ferdig tørr, fjern musen fra stereotaktisk apparat.
13. Plasser musen i et gjenopprettingsbur med termisk støtte. La den gjenopprette og overføre til hjemmeburet når det ser ut som varsel, mobil og er grooming.

9. Postkirurgisk behandling

1. Overvåk dyr daglig i 3 dager postoperativt for atferd, holdning, aktivitet og grooming, og hold oversikt over matinntak og kroppsvekt.
2. Hvis dyr viser noen generelle indikatorer på smerte eller dårlig helse, kontakt veterinærtjenester.
3. Tillat mus minst 2 uker for utvinning og for viralt uttrykk før du starter atferdsstudier.

10. Optogenetikk

1. For utførelsen av optogenetikkstudier, se Sidor et al.⁸.
2. Valider viralt uttrykk og fiberplassering når studiene er fullført.

Representative Results

Denne protokollen beskriver en kirurgisk prosedyre for å utføre optogenetikkstudier for å forhøre rollen som hypothalamus VMN-nevroner i glykemisk kontroll⁹. Først brukt var en standard (ikke-vinklet) stereotaktisk tilnærming for bilateral mikroinjeksjon av en hemmende channelrhodopsin virus til VMN. Selv om en vinklet tilnærming også ville være egnet, ble standard (ikke-vinklet) tilnærming valgt fordi den er tilstrekkelig til å målrette hjerneregionen av interesse og er en enkel, pålitelig og konsekvent tilnærming. Men gitt VMNs nærhet til midtlinjen, tillot plassbegrensninger ikke den ikke-vinklede implantasjonen av bilateral fiberopti, noe som nødvendiggjorde utviklingen av en kirurgisk strategi for nøyaktig implantering av fiberopti i en vinkel (figur 6).

Ved hjelp av denne kirurgiske strategien mikroinjiserte vi en Cre-avhengig AAV som uttrykker en modifisert channelrhodopsin anion-ledende kanal smeltet sammen med fluorescerende reporter, referert til som et "SwiChR ++" virus¹⁰, bilateralt til VMN av Nos1-cre mus. Dette ble etterfulgt av implantasjon av en optisk fiber dorsolateral til hvert injeksjonssted i en 15 ° vinkel fra midtlinjen. Som forventet var viralt uttrykk begrenset til VMN og ikke oppdaget i andre hjerneområder.

Figur 1: Representativt eksempel på beregning av vinklede koordinater rettet mot hypothalamus ventromedialkjernen. Vinkler og linjesegmenter tegnes ikke for å skaleres. (A) Denne lengden skal beregnes ved hjelp av grunnleggende trigonometri. I dette eksemplet er A = 2,03 mm. (B) Beregnet lengde basert på tildeling av vilkårlig rotasjonsakse. I dette eksemplet er B = 7,576 mm. (C) Beregnet hypotenus. Det skal bemerkes at dybden av fiberoptisk / nålinnsetting avhenger av ønsket nærhet til målområdet, noe som krever optimalisering. Dette tallet er endret fra Faber et al. 2019¹¹. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Justeringsknapper for det stereotaktiske hodeholderapparatet. Dette tallet er endret fra Faber et al. 2019¹¹. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Justere hodeholderens rotasjonssenter. (A) Plassering av ørestengene. (B) Sikting ned i området under 0° nivå coronal rotasjon (venstre), under 15 ° rotasjon før du justerer det vertikale skiftet, og rotasjonssenteret er feiljustert (midten), og under 15 ° rotasjon etter justering av det vertikale skiftet, og rotasjonssenteret er riktig justert (høyre). Dette tallet er endret fra Faber et al. 2019¹¹. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Tilordne bregma og justere dyrehodet med sentrale rotasjonsakser. (A) Representativt bilde som indikerer typisk bregmaplassering. (B) Tegne et referansemerke mens hodet er i vater, før justering. (C) Riktig justert rotasjonsakse, etter justering av det vertikale skiftet og justering av bregma. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Fiberoptisk implantasjonsprosedyre. (A) Sentrert omfangsvisning av pilothull for mikroinjeksjon (m), fiberoptisk (f) og ankerskruer (*). (B) Sentrert omfangsvisning av implanterte ankerskruer, og beinvoks dekket mikroinjeksjonsborhull. (C) Plassering av fiberoptisk på plass under vinklet implantasjon. (D) Representativ bilateral vinklet fiberoptisk plassering. Prikkete svarte piler indikerer områder der superlim brukes til å forankre fiberoptisk til ankerskruene og ipsilateral fiberoptisk. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Representative resultater for bilateral målretting av ventromedial hypothalamus. (A) Skjematisk som representerer bilateral mikroinjeksjon og vinklet fiberoptisk strategi for målretting av VMN. (B) Representativt bilde som viser bilateralt uttrykk for SwiChR-GFP og vevsskade fra vinklede fiberoptiske trakter. 3V = tredje ventrikel, ARC = arcuate nucleus, og VMN = ventromedial kjerne. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Nylige fremskritt innen nevrovitenskap har støttet avansert innsikt og forståelse av aktiviteten og funksjonen til hjerne nevrokretser. Dette inkluderer anvendelsen av optogenetiske og kjemogenetiske teknologier for å aktivere eller kneble diskrete nevronpopulasjoner og deres projeksjonssteder in vivo. Mer nylig har dette inkludert utviklingen av genetisk kodede kalsiumindikatorer (f.eks. GCaMP, RCaMP) og andre fluorometriske biosensorer (f.eks. dopamin, noradrenalin) for in vivo-registrering av nevronaktivitet i en definert celletype hos fritt bevegelige dyr. Effektiv ansettelse av disse teknologiene er imidlertid avhengig av vellykket stereotaktisk kirurgi for å målrette regionen av interesse. Mens det er flere etablerte protokoller som beskriver disse metodene, som er egnet for å målrette mange hjerneregioner, representerer målretting av dype hjerneregioner langs midtlinjen betydelige ekstra utfordringer. Demonstrert her er en detaljert kirurgisk teknikk for å målrette diskrete hjerneregioner via en vinklet stereotaktisk tilnærming. Viktigst, denne teknikken kan tilpasses og brukes på et mangfoldig spekter av nevrovitenskapelige teknikker (dvs. optogenetikk, kjemogenetikk og fiberfotometri tilnærminger).

Ved hjelp av denne tilnærmingen er det vist at akutt optogenetisk silencing av VMN-nevroner som uttrykker nevronal nitrogenoksidsyntase (VMN^NOS1 nevroner) stumper glukagonresponser på insulinindusert hypoglykemi hos mus⁹. Ved hjelp av en litt modifisert tilnærming, er det videre demonstrert at ensidig aktivering av VMN^NOS1 nevroner 1) fremkaller robust hyperglykemi som drives av kontraregulatoriske svar som normalt er reservert for respons på hypoglykemi, og 2) fremkaller defensiv immobilitetsadferd. Videre innebærer disse atferdsmessige og metabolske responsene nevronale projeksjoner til distinkte hjerneområder. Spesielt er aktiveringen av VMN^NOS1 nevroner som projiserer til den fremre sengekjernen til stria terminalis involvert i glykemiske responser, mens VMN^NOS1 nevroner som projiserer til periaqueductal gray er knyttet til fryktinduserte atferdsresponser⁹.

Det skal bemerkes at protokollen er svært spesifikk for Kopf Model 1900 stereotax og tilhørende tilbehør. Selv om dette systemet muliggjør presis, reproduserbar implantasjon samt mikroinjeksjon for å diskrete hjerneregioner (med en felles midtlinjeposisjon på tvers av flere verktøy), kan strategien og tilnærmingen tilpasses andre stereotakaxiske rammer. Spesielt, i stedet for å rotere hodet for å utføre vinklede mikroinjeksjoner og implantasjoner, er en alternativ tilnærming å bruke de samme prinsippene og rotere dorsal-ventral manipulatoren i stedet (se Correia et al.¹²).

Som med alle nye metoder, er det viktig for enkeltpersoner å optimalisere teknikken for å forbedre eksperimentets pålitelighet, konsistens og nøyaktighet. I tillegg er det viktig å inkludere de nødvendige hensiktsmessige kontrollene for riktig analyse og tolkning av data. Disse inkluderer bruk av Cre-negative forsøplingskontroller, virale reporterkontroller (dvs. AAV-GFP), verifisering av lysavhengig nevronal avfyringsmodulering ved hjelp av elektrofysiologi, og (ved studiefullføring) validering av viral målretting og fiberoptisk plassering i interesseområdet. Det anbefales å henvise til publikasjonen av Cardozo og Lammel¹³ for en detaljert gjennomgang av tekniske hensyn og foreslåtte kontroller.

Oppsummert har innføringen av mer avanserte og presise nevrovitenskapelige teknikker støttet et betydelig fremskritt og forståelse av hjernens rolle i atferd, kognisjon og fysiologi, og disse fremskrittene kan føre til potensielle terapier for CNS-relaterte lidelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fiberoptic Cannulae	Doric Lenses	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Customizable
Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System	Kopf	Model 1900
Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge	Kopf	Model 1900-51
Kopf Model 1905 Alignment Indicator	Kopf	Model 1905
Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill	Kopf	Model 1911
Kopf Model 1915 Centering Scope	Kopf	Model 1915
Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars	Kopf	Model 1922
Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder	Kopf	Model 1923-B
Kopf Model 1940 Micro Manipulator	Kopf	Model 1940
Micro4 Microinjection System	World Precision Instruments	--
Mouse bone screws	Plastics One	00-96 X 1/16
Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule	Thor Labs	XCL
Surgical Drill	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill