Summary
המתואר כאן הוא הליך סטריאוטקטי שיכול למקד אזורים מאתגרים וקשים להשכה למוח (בשל מגבלות מרחביות) באמצעות גישה קורונטית זוויתית. פרוטוקול זה מותאם הן למודלים של עכברים והן למודלים של חולדות וניתן ליישם אותו על יישומים מוחיים מגוונים, כולל השתלת צינורית ומיקרו-נג'קציה של מבנים ויראליים.
Abstract
ניתוח סטריאוטקטי הוא כלי חיוני במעבדה המודרנית למדעי המוח. עם זאת, היכולת למקד במדויק ומדויק אזורים במוח קשה להגיע עדיין מציב אתגר, במיוחד בעת מיקוד מבני המוח לאורך קו האמצע. אתגרים אלה כוללים הימנעות של סינוס קשת מעולה החדר השלישי ואת היכולת למקד באופן עקבי גרעיני מוח סלקטיביים ודיסקרטיים. בנוסף, טכניקות מתקדמות יותר במדעי המוח (למשל, אופטוגנטיקה, פוטומטריית סיבים והדמיה של שני פוטונים) מסתמכות על השתלה ממוקדת של חומרה משמעותית למוח, ומגבלות מרחביות הן מכשול נפוץ. מוצג כאן פרוטוקול ניתן לשינוי למיקוד סטריאוטקטי של מבני מוח מכרסמים באמצעות גישה קורונית זוויתית. זה יכול להיות מותאם 1) מודלים עכבר או חולדה, 2) טכניקות שונות במדעי המוח, ו 3) אזורי מוח מרובים. כדוגמה מייצגת, הוא כולל את החישוב של קואורדינטות סטריאוטקטיות למיקוד של גרעין ההונאה ההיפותלמוסית של העכבר (VMN) לניסוי עיכוב אופטוגנטי. הליך זה מתחיל במיקרו-רינג'ק דו-צדדי של וירוס הקשור לאדנו (AAV) המקודד ערוץ כלוריד רגיש לאור (SwiChR++) למודל עכבר תלוי Cre, ואחריו ההשתלה הדו-צדדית הזוויתית של צינורית fiberoptic. באמצעות גישה זו, הממצאים מראים כי הפעלה של תת קבוצה של נוירונים VMN נדרש עבור תגובות נגד פיקוח גלוקוז שלם היפוגליקמיה המושרה אינסולין.
Introduction
שליטה עצבית בהתנהגות, האכלה ומטבוליזם כרוכה בתיאום של נוירו-מעגלים מורכבים, אינטגרטיביים ומיותרים. מטרת הנהיגה של תחום מדעי המוח היא לנתח את הקשר בין מבנה המעגל העצבי לתפקוד. למרות שכלי מדעי המוח הקלאסיים (כלומר, נגעים, זריקות פרמקולוגיות מקומיות וגירוי חשמלי) חשפו ידע חיוני לגבי תפקידם של אזורי מוח ספציפיים השולטים בהתנהגות ובמטבוליזם, כלים אלה מוגבלים על ידי חוסר הספציפיות וההיפוךשלהם 1.
ההתקדמות האחרונה בתחום מדעי המוח שיפרה מאוד את היכולת לחקור ולתפעל את תפקוד המעגל באופן ספציפי מסוג תא עם רזולוציה ספאטיוטמפוראלית גבוהה. 2 אופטוגנטית ו כימיה3 גישות, למשל, לאפשר מניפולציה מהירה והפיכוי של פעילות בסוגי תאים מוגדרים גנטית של בעלי חיים נעים בחופשיות. אופטוגנטיקה כרוכה בשימוש בערוצי יונים רגישים לאור, המכונים channelrhodopsins, כדי לשלוט בפעילות העצבית. המפתח לטכניקה זו הוא אספקת הגנים של channelrhodopsin ומקור אור כדי להפעיל את opsin. אסטרטגיה נפוצה להעברת גנים היא באמצעות שילוב של 1) עכברים מהונדסים גנטית המביעים Cre-רקומבינאז בנוירונים נפרדים, ו -2) וקטורים ויראליים תלויי Cre קידוד channelrhodopsin.
בעוד שאופטוגנטיקה מספקת אמצעים אלגנטיים ומדויקים ביותר לשליטה בפעילות העצבית, השיטה מותנית במיקרו-ערך סטריאוטקטי מוצלח של וקטור ויראלי ומיקום סיבים לאזור מוח מוגדר. למרות הליכים סטראוטקטיים הם דבר שבשגרה במעבדה המודרנית למדעי המוח (ויש כמה פרוטוקולים מצוינים המתארים הליך זה)4,5,6, היכולת למקד באופן עקבי ורבייה אזורי מוח נפרדים לאורך קו האמצע (כלומר, ההיפותלמוס הבינוני, אזור במוח קריטי לרגולציה של פונקציות הומיאוסטטיות7) מציג אתגרים נוספים. אתגרים אלה כוללים הימנעות של סינוס קשת מעולה, החדר השלישי, גרעין היפותלמי סמוך. בנוסף, ישנן מגבלות מרחביות משמעותיות להשתלה דו-צדדית של חומרה הנדרשת למחקרי עיכוב. עם אתגרים אלה בחשבון, פרוטוקול זה מציג הליך ניתן לשינוי למיקוד אזורי מוח נפרדים באמצעות גישה סטריאואטקטית זוויתית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים אושרו בהתאם למכונים הלאומיים לבריאות, המדריך לטיפול ושימוש בבעלי חיים ואושרו הן על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) והן על ידי בריאות ובטיחות סביבתית באוניברסיטת וושינגטון.
1. חישוב קואורדינטות זוויתיות
- באמצעות אטלס מוח קורונול, לסמן משולש ימני, כך היתר עובר דרך אזור היעד של עניין. בדוגמה הייצוגית (איור 1), הגרעין ההיפותלמוסי ונטורומדיאלי (VMN) מיועד בזווית של 15° מקו האמצע של קורונלי.
הערה: מיקום ציר הסיבוב המתואר באיור 1 (ולכן, אורך צד C) הוא שרירותי וניתן לשנותו כך שיתמקד בכל אזור במוח. למרות שזה עשוי להיראות מנוגד לאינטואיציה, שלבים מאוחרים יותר בפרוטוקול יתאימו את מיקום הראש בציר z כך שנקודה זו תתיישר עם מרכז הסיבוב הסטריאוטקטי (ראה סעיף 6). עם זאת, מומלץ לא לחרוג מזווית סיבוב קורונל של 15° בשל אילוצים פיזיים של מנגנון מחזיק הראש. - קבע את הזווית הרצויה (a) ואת האורך המשוער של צד B והשתמש בטריגונומטריה כדי לחשב את אורך הצדדים A ו- C. שלב זה חשוב למיקום נכון של הראש במהלך הסיבוב.
הערה: בדוגמה באיור 1, קווי רשת אטלס משמשים להערכת אורך צד B, המניב אורך של 7.576 מ"מ. מידע זה משמש לחישוב אורך צד A:
בדוגמה זו, 2.03 מ"מ מציין את מרחק R / L מקו האמצע שבו הצינורית fiberoptic נכנס למוח כאשר הראש מסתובב על ידי 15 °.- לחלופינית, חשב את אורך צד C כדי להעריך את קואורדינטת D/V:
הערה: 1) אורך היתר (C) אינו מייצג את עומק ההזרקה אך יהיה מועיל בקביעת קואורדינטת D/ V, אשר ייתכן שיהיה צורך להתאים כדי להתאים את האורך המוגבר לעומת צד B עבור זריקות ישר ב. לכן מומלץ לבצע זריקות בדיקה כדי לייעל את קואורדינטת D/V. 2) בדוגמה זו המתמקדת ב- VMN, מתקבלות שתי קבוצות של קואורדינטות: אחת עבור המיקרו-יז'ק שאינו זוויתי (A/P = -1.4, R/L = 0.4 ב- 0°, D/V = -5.7) ואחת להשתלה סיבים זוויתית (A/P = -1.4, R/L = 0.0 ב- 15°, D/V = -5.4).
- לחלופינית, חשב את אורך צד C כדי להעריך את קואורדינטת D/V:
2. הכנת הסטריאוטקס להליך זוויתי
- ודא כי המסגרת הסטריאו-טסטרואטקטית והמיקרו-מניפולטור כוילו (ראה מדריך קופף לפרוטוקול מלא).
- מניחים את מד הגובה המרכזי לתוך השקע של צלחת הבסיס של מחזיק הראש.
- אבטח את טווח הריכוך במחזיק הכלים ולאחר מכן תבדוק את הטווח. התאימו את מיקום המיקרו-מניפולטור עד שהכוונת מיושרת ומתמקדת על כוונת המד.
הערה: במהלך שלב זה, ההיקף ממוקם במישור המוקד של מרכז הסיבוב של בעל הראש. לאחר שהוקם, אין להזיז את המיקרו-מניפולטור במהלך השלבים הנותרים. - הניחו את מוטות האוזניים במחזיקים ומרכזו כך שקווי המחוון משני הצדדים יהיו ב- 0 (איור 3A).
- השתמשו במתיודד-לרוחב ובידיות הקדמיות-אחוריות על מחזיק הראש (איור 2) כדי ליישר את מוטות האוזניים במישורי x ו- y מעל הכוונת של מד הגובה המרכזי(איור 3A).
- כדי ליישר את מיקום פס האוזן בציר z, הסירו את מוטות האוזניים מהמחזיק והסירו את מד הגובה המרכזי. החלף את מוטות האוזניים ומרכז אותם שוב ב- 0.
- ראה את הכוונת. השתמש בכפתור ההזזה האנכי (איור 3B) ובידית הטיה קורונל, בהתאמה, כדי להנמיך ולסובב את מוטות האוזניים עד שהכוונת של הטווח תישאר מרוכזת בין מוטות האוזניים לאורך סיבוב קורונל.
- הסטריאוטקס מכויל ומוכן כעת. אין לבצע התאמות נוספות בעמדת בעל הראש.
3. הכנת חומרים להזרקה/השתלה
- ודא שכל המכשירים, הכלים הכירורגיים והחומרים מעוקרים ומונחים בשדה כירורגי סטרילי ליד הסטריאוטקס.
- לטפל ולאחסן מבנים ויראליים בהתאם לרמת הבטיחות הביולוגית שלהם ולדרישות הרגולציה הביולוגית המוסדית הרלוונטיות.
- צייר את הנגיף לתוך המזרק, תוך שמירה על שימוש בשיטות טיפול נאותות וציוד מגן אישי.
4. הרדמה
- הקלט את משקל הגוף של העכבר לפני הניתוח.
- מרדים עמוק את העכבר באמצעות איזופלוראן.
- ודא שהעכבר הוא מרדים עמוק על ידי ביצוע בדיקת צביטת הבוהן עד התגובה נרתעת נעדרת. אם החיה ממשיכה להראות רפלקסים חזקים, להגדיל את הריכוז ו/או משך ההרדמה.
- יש למרוח משחת עיניים על כל עין כדי לשמור עליהם לחים במהלך הניתוח.
- לגלח את הקרקפת ממש מאחורי האוזניים רק מאחורי העיניים עם קוצץ שיער.
- ספק לעכבר משכך משכך משכך שך שאושר על-ידי IACUC.
- לעקוב באופן רציף אחר החיה לאורך כל ההליך הכירורגי ולספק תמיכה תרמית.
5. הליך כירורגי
- מניחים את הראש לתוך מחזיק הראש על ידי הצבת החותכות העליונות לתוך הרווח בסרגל הנשיכה, מוודאים כי הלשון היא מתחת לסרגל הנשיכה.
- אבטחו את הראש בסורגי האוזניים על ידי החדרה עדינה של מוטות האוזניים לתוך הבשר השמיעה החיצוני, והבטיחו כי מוטות האוזניים ממוקמים באופן סימטרי (בדרך כלל בין שלוש לארבעה לעכבר מבוגר). שלב זה הוא קריטי כדי להבטיח שהראש יציב ומרוכז לסיבוב.
- להכין באופן אספטי את אזור החתך המגולח עם שלושה סקראבס לסירוגין של betadine ואלכוהול דגימות, או עם הכנה חלופית מאושרת על ידי המוסד.
- מניחים וילון כירורגי על החיה כדי לשמור על שדה כירורגי סטרילי ולהפחית את הסיכון לזיהום לאחר הניתוח.
- לחשוף את הגולגולת על ידי ביצוע חתוך לאורך קו האמצע הקשת של הקרקפת. מגרדים בעדינות את פני הגולגולת כדי להסיר כל פאסיה ולחשוף את התפרים.
הערה: אם קשה לדמיין קווי תפר, מי חמצן יכולים להיות מוחלים על הגולגולת באמצעות אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה כדי לשפר את הדמיה של התפר. - מניחים את טווח המרכז במחזיק ומרכזים את הכוונת על ברגמה(איור 4,פאנל שמאלי). אפס המיקרו-מניפולטור.
- הזיזו את הכוונת למבדה, וצינו את המרחק של ברגמה-למדה (B-L).
הערה: אם קווי התפר אינם עוקבים אחר קו ישר לאורך קו האמצע, מומלץ להקים את קו האמצע באמצעות "קו ההתאמה הטובה ביותר" דרך ברגמה ומבדה. עם זאת, אם השלבים לעיל מתבצעים, המיקום הראשוני של רticle היקף צריך להיות באמצע הדרך בין מוטות האוזן מקרוב את תפר B-L באמצע הקו. - אם מרחק ה-B-L קטן או גדול משמעותית מ-4.21 מ"מ, התאם בהדרגה את ברגמה שהוקצתה כדי לקבל מרחק B-L של 4.21 מ"מ ± 0.2 מ"מ.
- החלף את טווח המרוכז במחוון היישור. מניחים את הגששים על למבדה וברזמה ומתאימים את ידית הטיית בגב על מחזיק הראש לרמה במישור הקשת (האף פונה למעלה או למטה), ולאחר מכן השתמש בטווח המרכז כדי להקצות מחדש ברגמה.
- השתמש מחוון היישור כדי לרמה במישור קורונל באמצעות ידית הטיה קורונל. מדוד במספר נקודות לאורך ציר rostral / caudal כדי להסביר עיוותי פני השטח בגולגולת.
- שים לב למיקום על לוח המחוגים של ידית הטיה קורונל, שכן זהו מיקום הסיבוב של 0°.
6. יישור הצירים המרכזיים של הסיבוב לקואורדינטות זוויתיות
- אבטח את טווח הריכוז במחזיק הכלים ומיקם את המיקרו-מניפולטור לקואורדינטות המחושב מסעיף 1. שים לב שמתאם R/L עבור ההשתלה הזוויתית תואם לאורך צד A.
- בדוגמה באיור 1, הקואורדינטות הזוויתיות למיקום פינופטי המתמקדות ב- VMN הן (A/P = -1.4, R/L = [2.03] בסיבוב 0° קורונלי, [0.00] בסבב קורונלי של 15°, D/V = -5.4).
- תצפית על הטווח ולסמן קואורדינטות אלה (R/L 2.03 מ"מ מקו האמצע לכל הדוגמה VMN; איור 4, החלונית האמצעית). סימן זה מייצג את הנקודה שבה הצינורית תיכנס למוח ברגע שהראש יסתובב.
- מקם מחדש את המיקרו-מניפולטור מעל קו האמצע (R/L = 0.00). השתמש ידית הטיה קורונל לסובב את הראש לזווית מחושבת בסעיף 1.
- אם כוונת הטווח כבר מסתדרת בשורה עם הסימן, המשך לסעיף 7.
- אם כוונת הטווח אינה תואמת את סימן ההתייחסות, התאם את מיקום הראש בציר z באמצעות ידית ההזזה האנכית (איור 2) עד שהכוונת תתיישר קרוב ככל האפשר לסימן.
- סובב את הראש בחזרה לתנוחה 0° קורונל. אם ההזזה האנכית הותאמה בשלב 6.3, הקף מחדש את ברגמה באמצעות טווח הריכוך.
- חזור על שלבים 6.3 ו- 6.4 עד שהכוונת תגיע בעקביות לסימן ההתייחסות בעת סיבוב הראש (איור 4C).
- בשלב זה, נקודת הסיבוב השרירותית שנקבעה בסעיף 1 צריכה להיות מיושרת כעת עם מרכז הסיבוב הסטריאו-פקטקטי.
7. מיקרו-ינון
- מניחים את המקדחה הסטריאו-טסטרואטקטית במחזיק ומתמרנים את המיקרו-מניפולטור לקואורדינטת ההזרקה הראשונה.
- לפי הדוגמה למיקוד ה- VMN, תרגיל ב- A/P = -1.4 ו- R/L = 0.4 כאשר הראש הוא מאוזן.
- מנמיכים את המקדחה עד שהקטטה נמצאת ממש מעל הגולגולת. הפעל את המקדחה, בעדינות נמוך יותר עד קצת רק קדח דרך הגולגולת (לא דורה).
- חזור על הפעולה עבור אתר ההזרקה הנגדי.
- השתמש נהג מחט סטרילי כדי להציג עיקול 90° לתוך מחט 27-30G (למשל, של מזרק אינסולין סטרילי 0.5 מ"ל), ולהשתמש במחט מכופפת כדי לחטט בעדינות דרך מאטר דורה.
- הערה: אם מתרחש דימום, הפעילו לחץ עם אפליקטור סטרילי עם קצה כותנה ונקיו עם מים סטריליים עד שהדימום ייפסק.
- כאשר מוכן להזריק, בזהירות למקם מזרק המילטון מלא לתוך המחזיק סטריאוטקטי.
הערה: הקואורדינטות במיקרו-מניפולטור אינן חלות עוד לאחר המעבר לכלי חדש. השתמש במרכז חור בר כמטרה החדשה להזרקה. - מקם בזהירות את המחט מעל חור הבר.
- מנמיכים את המחט עד שהיא נוגעת מעט בדורה במרכז חור הבר. קריטי: אפס את המיקרו-מניפולטור רק בציר z, כך הקואורדינטות על micromanipulator עבור היקף מרכז סטריאוטקטי ומקדחה נשמרים.
- לאט להוריד את המחט לתוך המוח, צופה מקרוב כדי להבטיח כי המחט לא להסיט על קצה החור burr. ממשיכים להנמיך עד 0.05 מ"מ גחון לקואורדינטת הזרקת D/V ולחכות 1 דקות. צעד נוסף זה יוצר "כיס" קטן כדי למזער את זרימת הגב הנגיפית על הסרת מחט.
- לאט לאט להעלות את המחט לקואורדינטת D / V ולהתחיל את הזריקה.
הערה: קצב הזרימה והנפח ישתנו בהתאם לאזור היעד ולעיצוב ניסיוני. עבור השתקה אופטוגנטית של נוירונים VMN, כיסוי מספיק הוא הרצוי, כך 200 nL של וירוס מוזרק בקצב של 1 nL / s. - לאחר microinjection, לחכות 10 דקות באתר ההזרקה כדי למזער את השפכים של וירוס במהלך הגמילה.
- מוציאים לאט את המיקרופיט מהמוח בקצב משוער של 1 מ"מ/דקה.
- ברגע המחט ברורה של הגולגולת, להוציא נפח קטן של וירוס כדי להבטיח את המחט לא סתום עם דם או רקמה. השתמש אפליקטור סטרילי כותנה קצה כדי להסיר את הנגיף לפני שתמשיך.
- חזור על שלבים 7.6-7.12 עבור הצד הנגדי.
- אטמו את חורי הבר הזעיר עם שעוות עצם כדי לשפר את הריפוי (איור 5B).
8. השתלת פינופטית
הערה: לאחר הזרקה ויראלית, קנולות פינופטיות דו-צדדיות מושתלות בזווית המחושבת לכל סעיף 1. שים לב כי קואורדינטות אלה כבר צריך להיות מסומן על הגולגולת מסעיף 6.
- חזור על שלבים 7.1 – 7.4 עבור הקואורדינטות הזוויתיות.
- החזר את הראש למיקום ברמה 0°.
- לאחר מכן, השתמש במקדחת היד כדי לייצר ארבעה חורים נוספים לברגי העצם: שניים צריכים להיות ממוקמים הקדמיים ושניים אחוריים (איור 5A). אלה ישמשו כעוגנים להצמדת הסיבים לגולגולת(איור 5D).
הערה: הקפד לחלל את החורים רחוק מספיק מן חורי בר קואורדינטות זווית כדי להתאים את החלק ferrule של fiberoptic שיושב מעל הגולגולת. - בעדינות רבה ככל האפשר, השתמש במברג השטוח הקטן כדי להגדיר את ברגי העצם כך שהם יושבים בחוזקה בגולגולת אך אינם חודרים למוח.
- מהדקים צינורית פינופטית למחזיק הצינורית ומניחים אותה במחזיק הסטריאו-אקטריאוטקטי.
- סובב את הראש לזווית המחושבת, וציין שוב כי הקואורדינטות במיקרו-מניפולטור אינן חלות על הכלי החדש. השתמש במרכז חורי הבר הזוויתיים כמטרת ההשתלה.
- מנמיכים את הפירופטי עד שהוא נוגע בדורה במרכז החור(איור 5C). אפס את המיקרו-מניפולטור בציר z, ואז לאט לאט לאט הפירופטי לקואורדינטות בזווית D/V (-5.4 לכל דוגמת VMN).
- השתמשו בג'ל ציאנואקרילט כדי לחבר את הפרולה הסיבית לברקי העוגן האיסיליטרליים, ולאחר מכן החל מאיץ עם קצה מיקרופיפט(איור 5D).
- לאחר ג'ל ציאנואקרילט התקשה לחלוטין, שחרר בעדינות את מחזיק הצינורית ומעלה עד נקי של ferrule fiberoptic.
- חזור על שלבים 8.5-8.9 עבור הקואורדינטות הזוויתיות הנגדיות ולאחר מכן החלק את הראש. לאבטחה נוספת, הפוך חיבור נוסף בין שתי הקנולות הפיינופטיות הזוויתיות עם ג'ל ציאנואקרילט ומאיץ(איור 5D).
- הכן כמות קטנה, דקה יחסית של מלט דנטלי. יש למרוח על פני הגולגולת, תוך הקפדה לכסות ביסודיות את ברגי העוגן ואת בסיס הקנולות הפינופטיות. השאר מספיק של ferrule נקי להזדווגות לאחר מכן עם כבלי תיקון fiberoptic.
- לאחר השלמת המלט יבש, להסיר את העכבר מן המנגנון סטריאוטקטי.
- מקם את העכבר בכלוב שחזור עם תמיכה תרמית. אפשר לו להתאושש ולהעביר לכלוב הביתי ברגע שהוא נראה ערני, נייד, והוא טיפוח.
9. טיפול לאחר ניתוח
- לעקוב אחר בעלי חיים מדי יום במשך 3 ימים לאחר הניתוח עבור התנהגות, יציבה, פעילות, וטיפוח, ולשמור תיעוד של צריכת מזון ומשקל הגוף.
- אם בעלי חיים מפגינים אינדיקטורים כלליים לכאב או לבריאות לקויה, התייעצו עם שירותים וטרינריים.
- אפשר לעכברים לפחות שבועיים להחלמה ולביטוי ויראלי לפני תחילת מחקרים התנהגותיים.
10. אופטוגנטיקה
- לביצועים של מחקרים אופטוגנטיים, עיין סידור ואח'8.
- אמת ביטוי ויראלי ומיקום סיבים בסיום הלימודים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה מתאר הליך כירורגי לביצוע מחקרים אופטוגנטיים כדי לחקור את התפקיד של נוירונים VMN ההיפותלמי בשליטה גליקמית9. הראשון מנוצל היה גישה סטריאוטקטית סטנדרטית (לא זוויתית) עבור מיקרו-יז'ק דו-צדדי של וירוס channelrhodopsin מעכב ל- VMN. בעוד שגישה זוויתית תתאים גם היא, הגישה הסטנדרטית (הלא זוויתית) נבחרה מכיוון שהיא מספיקה כדי למקד את אזור העניין במוח והיא גישה קלה, אמינה ועקבית. עם זאת, בהתחשב בסמיכותו של ה-VMN לקו האמצע, אילוצי החלל לא אפשרו השתלה לא זוויתית של פינופטיקה דו-צדדית, מה שמחייב פיתוח אסטרטגיה כירורגית להשתלת סיבים מדויקים בזווית(איור 6).
באמצעות אסטרטגיה כירורגית זו, אנו microinjected AAV תלוי Cre מבטא ערוץ שונה channelrhodopsin אניון מוליך ערוץ התמזג עם כתב פלואורסצנטי, המכונה וירוס "SwiChR ++"10, דו-צדדי ל VMN של עכברים Nos1-cre. לאחר מכן השתלת סיב אופטי דורסולטר לכל אתר הזרקה בזווית של 15° מקו האמצע. כצפוי, ביטוי ויראלי הוגבל ל- VMN ולא זוהה באזורים אחרים במוח.
איור 1: דוגמה מייצגת לחישוב קואורדינטות זוויתיות המתמקדות בגרעין הנטורומדיאל ההיפותלמוסי. זוויות ומקטעי קו אינם משורטטים לקנה מידה. ( A) יש לחשבאורךזה באמצעות טריגונומטריה בסיסית. בדוגמה זו, A = 2.03 מ"מ. (B) אורך משוער בהתבסס על הקצאה של ציר שרירותי של סיבוב. בדוגמה זו, B = 7.576 מ"מ. (C) תת לחץ דם מחושב. יש לציין כי עומק החדרת fiberoptic / מחט תלוי הקרבה הרצויה לאזור היעד, אשר דורש אופטימיזציה. נתון זה שונה מפייבר ואח' 201911. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: ידיות התאמה למנגנון מחזיק הראש הסטריאו-טסטרואקטיבי. נתון זה שונה מפייבר ואח' 201911. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: יישור מרכז הסיבוב של מחזיק הראש. (א)מיקום מוטות האוזניים. (B)תצפית על הטווח במהלך סיבוב קורונל ברמה של 0° (משמאל), במהלך סיבוב של 15° לפני התאמת ההזזה האנכית ומרכז הסיבוב אינו מיושר כהלכה (אמצע), ובמהלך סיבוב של 15° לאחר התאמת המשמרת האנכית, ומרכז הסיבוב מיושר כראוי (מימין). נתון זה שונה מפייבר ואח' 201911. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: הקצאת ברגמה ויישור ראש החיה עם צירי סיבוב מרכזיים. (A) תמונה מייצגת המציינת מיקום ברגמה טיפוסי. (B)ציור סימן הפניה כאשר הראש הוא רמה, לפני יישור. (C)ציר סיבוב מיושר כהלכה, לאחר התאמת המשמרת האנכית והתאמת ברגמה מחדש. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הליך השתלה סיבים. (A)תצוגת טווח מיקוד של חורי טייס עבור מיקרו-יז'ק (m), סיבים (f) וברגים עוגן (*). (B)מיקוד תצוגת היקף של ברגי עוגן מושתלים, וחורי קידוח מיקרו-יז'ק מכוסים שעוות עצם. (C)מיקום הפייבופטי למקומו במהלך ההשתלה הזוויתית. (D)מיקום סיבים בזווית דו-צדדית מייצגת. חצים שחורים מנוקדים מציינים אזורים שבהם דבק העל משמש לעגן את הסיבים לברדי העוגן והפינופטיים האיסיליטרליים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: תוצאות מייצגות למיקוד דו-צדדי של ההיפותלמוס הגחוני. (A)סכמטי המייצג מיקרו-נסיגה דו-צדדית ואסטרטגיה סיבים זוויתית למיקוד VMN. (B)תמונה מייצגת המציגה ביטוי דו-צדדי של SwiChR-GFP ונזק לרקמות מדרכיים סיבים זוויתיים. 3V = החדר השלישי, ARC = גרעין arcuate, ו- VMN = גרעין ventromedial. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההתקדמות האחרונה במדעי המוח תמכה בתובנה והבנה מתקדמות לגבי הפעילות והתפקוד של מדעי המוח. זה כולל את היישום של טכנולוגיות אופטוגנטיות וכימוגנטיות כדי להפעיל או להשתיק אוכלוסיות עצביות נפרדות ואתרי ההקרנה שלהם ב vivo. לאחרונה, זה כלל התפתחות של אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית (למשל, GCaMP, RCaMP) וביוסנסורים פלואורומטריים אחרים (למשל, דופמין, נוראדרנלין) להקלטת ויוו של פעילות עצבית בסוג תא מוגדר בבעלי חיים נעים בחופשיות. עם זאת, תעסוקה יעילה של טכנולוגיות אלה מסתמכת על ניתוח סטריאוטקטי מוצלח כדי למקד את אזור העניין. אמנם ישנם מספר פרוטוקולים מבוססים המתארים שיטות אלה, אשר מתאימים למיקוד אזורי מוח רבים, מיקוד אזורי מוח עמוק לאורך קו האמצע מייצג אתגרים נוספים משמעותיים. הדגמה כאן היא טכניקה כירורגית מפורטת למיקוד אזורי מוח נפרדים באמצעות גישה סטריאו-טאוטקטית זוויתית. חשוב לציין, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת וליישם למגוון רחב של טכניקות מדעי המוח (כלומר, אופטוגנטיקה, כימוגנטיקה, וגישות פוטומטריה סיבים).
באמצעות גישה זו, הוא הראה כי השתקה אופטוגנטית חריפה של נוירונים VMN מבטא סינתאז תחמוצת החנקן העצבית (נוירונים VMNNOS1) קהה תגובות גלוקגון היפוגליקמיה המושרה באינסולין בעכברים9. באמצעות גישה שונה במקצת, הוא הוכיח עוד יותר כי הפעלה חד צדדית של נוירונים VMNNOS1 1) מעורר היפרגליקמיה חזקה המונעת על ידי תגובות נגד פיקוח השמורות בדרך כלל לתגובה היפוגליקמיה, ו 2) מעורר התנהגות חוסר תנועה הגנתית. יתר על כן, תגובות התנהגותיות ומטבוליות אלה כרוכות בהקרנות עצביות לאזורי מוח נפרדים. באופן ספציפי, ההפעלה של נוירונים VMNNOS1 הקרנה לגרעין המיטה הימנית של terminalis סטריה מעורבים בתגובות גליקמיות, ואילו נוירונים VMNNOS1 הקרנה לאפור periaqueductal קשורים לתגובות התנהגות המושרה פחד9.
יש לציין כי הפרוטוקול הוא ספציפי מאוד לסטראוטקס Kopf Model 1900 ואביזרים נלווים. בעוד שמערכת זו מאפשרת השתלה מדויקת, ניתנת לשחזור, כמו גם מיקרו-הפעלה לאזורי מוח נפרדים (עם מיקום קו מרכזי משותף על פני כלים מרובים), ניתן להתאים את האסטרטגיה והגישה כך שיתאימו למסגרות סטריאוטקזמיות אחרות. באופן ספציפי, במקום לסובב את הראש כדי לבצע מיקרו-ערך והשתלות זוויתיות, גישה חלופית היא לנצל את אותם עקרונות ולסובב את המניפולטור הגחוני-גחוני במקום (ראה קוריה ואח'12).
כמו בכל שיטה חדשה, חשוב לאנשים לייעל את הטכניקה כדי לשפר את האמינות, העקביות והדיוק של הניסוי. בנוסף, חשוב לכלול את הפקדים המתאימים הדרושים לניתוח ופרשנות נאותים של נתונים. אלה כוללים את השימוש בבקרות פסולת Cre-שליליות, פקדי כתב ויראליים (כלומר, AAV-GFP), אימות אפנון ירי עצבי תלוי אור באמצעות אלקטרופיזיולוגיה, ו (עם השלמת המחקר) אימות של פילוח ויראלי ומיקום סיבים באזור העניין. מומלץ להתייחס לפרסום על ידי קרדוזו ולאמל13 לסקירה מפורטת של שיקולים טכניים ובקרות מוצעות.
לסיכום, הכנסת טכניקות מדעי המוח מתקדמות ומדויקות יותר תמכה בקידום והבנה משמעותיים של תפקיד המוח בהתנהגות, קוגניציה ופיזיולוגיה, והתקדמות זו עשויה להוביל לטיפולים פוטנציאליים להפרעות הקשורות ל- CNS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות (NIDDK) מעניק F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G.J.M.), פרס מדע בסיסי חדשני של האגודה האמריקאית לסוכרת (#1-19-IBS-192 ל-G.J.M.) ולמרכז לחקר השמנת יתר תזונתית במימון NIDDK (DK-035816), מרכז לחקר הסוכרת (DK-017047) וסוכרת, השמנת יתר ומטבוליזם אימון מענק T32 DK0007247 (T.H.M) באוניברסיטת וושינגטון.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | -- | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
- King, B. M. The rise, fall, and resurrection of the ventromedial hypothalamus in the regulation of feeding behavior and body weight. Physiology and Behavior. 87, 221-244 (2006).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Roth, B. L.
- Richevaux, L., Schenberg, L., Beraneck, M., Fricker, D. In Vivo Intracerebral Stereotaxic Injections for Optogenetic Stimulation of Long-Range Inputs in Mouse Brain Slices. Journal of Visualized Experiments. , e59534 (2019).
- Fricano-Kugler, C. J., Williams, M. R., Luikart, B., Salinaro, J. R., Li, M. Designing, packaging, and delivery of high titer crispr retro and lentiviruses via stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. , e53783 (2016).
- McSweeney, C., Mao, Y. Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors. Journal of Visualized Experiments. (99), e52653 (2015).
- Lowell, B. B. New Neuroscience of Homeostasis and Drives for Food, Water, and Salt. New England Journal of Medicine. 380, 459-471 (2019).
- Sidor, M. M., et al. In vivo optogenetic stimulation of the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. , e51483 (2015).
- Faber, C. L., et al. Distinct Neuronal Projections from the Hypothalamic Ventromedial Nucleus Mediate Glycemic and Behavioral Effects. Diabetes. 67, 2518-2529 (2018).
- Berndt, A., et al. Structural foundations of optogenetics: Determinants of channelrhodopsin ion selectivity. Proceedings of the National Academy of Scences. 113, 822-829 (2016).
- Faber, C. L., Matsen, M. E., Meek, T. H., Krull, J. E., Morton, G. J. A customizable procedure for angled stereotaxic implantation and microinjection in the rodent brain. Kopf Carrier. 96, (2019).
- Correia, P., Matias, S., Mainen, Z. Stereotaxic Adeno-associated Virus Injection and Cannula Implantation in the Dorsal Raphe Nucleus of Mice. Bio-Protocol. 7, 2549 (2017).
- Cardozo Pinto, D. F., Lammel, S. Hot topic in optogenetics: new implications of in vivo tissue heating. Nature Neuroscience. 22, 1039-1041 (2019).
