Summary
여기에 설명된 것은 각진 관상 접근 법을 사용하여 도전적이고 도달하기 어려운 뇌 영역(공간 제한으로 인해)을 표적으로 할 수 있는 입체적 절차입니다. 이 프로토콜은 마우스와 쥐 모델에 모두 적응할 수 있으며, 바이러스 구조의 캐뉼라 이식 및 미세 주입을 포함하여 다양한 신경 과학 응용 분야에 적용 될 수있다.
Abstract
입체 수술은 현대 신경 과학 실험실에서 필수적인 도구입니다. 그러나 도달하기 어려운 뇌 영역을 정확하고 정확하게 표적으로 삼는 능력은 여전히 어려움을 겪고 있으며, 특히 미드라인을 따라 뇌 구조를 대상으로 할 때 더욱 그렇다. 이 도전은 우수한 처상 부비동과 세 번째 심실의 피하고 일관되게 선택적이고 이산적인 두뇌 핵을 표적으로 하는 기능을 포함합니다. 또한, 보다 진보된 신경과학 기술(예를 들어, 광유전학, 광섬유 광측정, 2광화상)은 뇌에 중요한 하드웨어의 표적 이식에 의존하고 있으며, 공간적 한계는 일반적인 장애물이다. 여기에 제시된 각진 관상 접근 방식을 사용하여 설치류 뇌 구조물의 입체 적 표적을 위한 수정 가능한 프로토콜이 있습니다. 그것은 1) 마우스 또는 쥐 모델, 2) 다양한 신경 과학 기술, 및 3) 여러 뇌 영역에 적응 할 수있다. 대표적인 예로, 광유전학억제실험을 위한 마우스 시상하부 환원핵(VMN)의 표적화를 위한 스테레오전술 좌표의 계산을 포함한다. 이 절차는 광에 민감한 염화물 채널(SwiChR+++)을 크레의존 마우스 모델에 인코딩한 아데노 관련 바이러스(AAV)의 양자 간 미세 주입으로 시작하여 광섬유 캐뉼라의 각진 양자 이식이 뒤따릅니다. 이 접근법을 사용하여, 사실 인정은 인슐린 유도한 저혈당에 대한 포도당 반규제 반응을 위해 VMN 뉴런의 서브세트의 활성화가 필요하다는 것을 보여줍니다.
Introduction
행동, 먹이 주기 및 신진 대사의 신경 제어는 매우 복잡 한의 조정을 포함, 통합, 그리고 중복 신경 회로. 신경 과학 분야의 운전 목표는 신경 회로 구조와 기능 사이의 관계를 해부하는 것입니다. 고전적인 신경 과학 도구 (즉, 병변, 국소 약리학적 주사 및 전기 자극)는 행동과 신진 대사를 제어하는 특정 뇌 영역의 역할에 관한 중요한 지식을 발견했지만, 이러한 도구는 특이성과 가역성의 부족에 의해 제한됩니다1.
신경 과학 분야의 최근 발전은 높은 현시성 해상도를 가진 세포 형 특정 방식으로 회로 기능을 심문하고 조작하는 능력을 크게 향상했습니다. 변성2 및 화학 유전학3 접근은, 예를 들면, 자유롭게 움직이는 동물의 유전으로 정의된 세포 모형에 있는 활동의 급속하고 가역적인 조작을 허용합니다. 광유전학은 신경 활동을 통제하기 위하여, 관상자극증이라고 칭한 광과민이온 채널의 사용을 관련시킵니다. 이 기술의 핵심은 채널로독신의 유전자 전달과 opsin을 활성화하는 빛의 원천입니다. 유전자 전달을 위한 일반적인 전략은 1) 유전자 조작 마우스의 조합을 통해 이산 뉴런에서 Cre-recombinase를 발현하고, 2) 채널로독신을 코딩하는 Cre-의존하는 바이러스 벡터.
광유전학은 신경 활동을 제어하는 우아하고 매우 정밀한 수단을 제공하지만, 이 방법은 정의된 뇌 부위로 바이러스 벡터 및 광섬유 배치의 성공적인 입체 미세 주입에 달려 있습니다. 입체적 절차는 현대 신경과학 실험실 내에서 흔히 볼 수 있지만 (그리고 이 절차를 설명하는 몇몇 우수한 프로토콜이 있다)4,5,6,미드라인을 따라 이산 뇌 영역을 일관되고 재현적으로 표적으로 할 수 있는 (즉, 내분비 시상 하부, 홈 모성 기능의 조절에 중요한 뇌 영역7)추가 과제를 제시한다. 이 도전은 우수한 처상 부비동, 제 3 심실 및 인접한 시상하믹 핵의 피하는 것을 포함합니다. 또한, 억제 연구에 필요한 하드웨어의 양자 이식에 상당한 공간 적 한계가 있다. 이러한 과제를 염두에 두고, 본 원에서 이 프로토콜은 각진 입체적 접근법을 통해 이산 뇌 영역을 대상으로 하는 수정 가능한 절차를 제시합니다.
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Protocol
모든 절차는 국립 보건원, 동물 관리 및 사용 가이드에 따라 승인되었으며 워싱턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 및 환경 보건 및 안전 모두에 의해 승인되었습니다.
1. 각진 좌표 계산
- 관상 동맥을 사용하여, hypotenuse가 관심의 대상 영역을 통과 할 수 있도록 오른쪽 삼각형을 표시합니다. 대표적인 예에서(도 1),시상하심 심근핵(VMN)은 관상 동맥 중음부로부터 15° 각도를 표적으로 한다.
참고: 도 1(따라서 측면 C의 길이)에 묘사된 회전 축의 배치는 임의적이며 임의의 뇌 영역을 대상으로 수정할 수 있습니다. 직관적이지 않은 것처럼 보일 수 있지만 프로토콜의 이후 단계는 이 점이 회전의 입체 중심과 정렬될 수 있도록 z축에서 헤드의 위치를 조정합니다(섹션 6 참조). 그러나 헤드 홀더 장치의 물리적 제약으로 인해 15°의 관상 회전 각도를 초과하지 않는 것이 좋습니다. - 원하는 각도(a) 및 측면 B의 추정 길이를 설정하고 삼각방법을 사용하여 측면 A 및 C의 길이를 계산합니다. 이 단계는 회전 중에 헤드를 올바르게 배치하는 데 중요합니다.
참고: 도 1의예에서 아틀라스 그리드라인은 B 측의 길이근을 근사화하여 길이7.576mm를 산출하는 데 사용됩니다. 이 정보는 측면 A의 길이를 계산하는 데 사용됩니다.
이 예에서, 2.03 mm는 머리가 15°로 회전할 때 광섬유 캐뉼라가 뇌로 들어가는 중간선으로부터의 R/L 거리를 나타낸다.- 선택적으로, D/V 좌표를 근사화하기 위해 측면 C의 길이를 계산합니다.
참고: 1) 저혈압(C)의 길이는 주사의 깊이를 나타내지 않지만 D/V 좌표를 결정하는 데 도움이 되며, 이는 직선 주사의 경우 증가된 길이 대 측면 B를 수용하기 위해 조정될 필요가 있을 수 있다. 따라서 D/V 좌표를 최적화하기 위해 테스트 주사를 수행하는 것이 좋습니다. 2) VMN을 대상으로 하는 이 예에서, 좌표의 두 세트가 얻어진다: 비각진(A/P = -1.4, R/L = 0°에서 0.4, D/V = -5.7) 및 각진 광섬유 이식용(A/P = -1.4, R/L=0.0)=15/D에서 0.0°되는 미세 주입을 위한 좌표가 있습니다.
- 선택적으로, D/V 좌표를 근사화하기 위해 측면 C의 길이를 계산합니다.
2. 각진 절차에 대한 스테레오세스 준비
- 입체 프레임과 미세 조작기가 보정되었는지 확인합니다(전체 프로토콜의 경우 Kopf 설명서 참조).
- 헤드 홀더 베이스 플레이트의 소켓에 중앙 높이 게이지를 놓습니다.
- 공구 홀더의 중심 범위를 확보한 다음 범위를 파악합니다. 십자선이 정렬되고 게이지 십자선에 초점을 맞출 때까지 미세 조작기의 위치를 조정합니다.
참고: 이 단계에서 범위는 헤드 홀더의 회전 중심의 초점 평면에 위치되고 있습니다. 일단 확립되면, 마이크로 조작기는 나머지 단계 동안 이동해서는 안됩니다. - 이어바를 홀더에 넣고 양쪽의 표시선이0(그림 3A)에있도록 중앙에 놓습니다.
- 헤드홀더(그림 2)에내측 측면 및 전방 후방 손잡이를 사용하여 중심 높이 게이지(그림3A)의십자선 위에 x-및 y-평면의 귀 바를 중앙정렬한다.
- z축의 이어 바 위치를 정렬하려면 홀더에서 이어 바를 제거하고 중앙 높이 게이지를 제거합니다. 이어 바를 교체하고 0에서 다시 중앙에 표시합니다.
- 범위를 내려다 볼 수 있습니다. 수직 시프트 노브(도3B)와관상 기울기 노브를 사용하여, 교차체가 관상 회전 전반에 걸쳐 이어 바 사이에 중앙으로 유지될 때까지 이어바를 낮추고 회전한다.
- 이제 스테레오탁이 보정되고 준비되었습니다. 헤드 홀더의 위치를 더 이상 조정하지 마십시오.
3. 사출/이식용 재료 준비
- 모든 기기, 수술 도구 및 재료가 멸균되어 스테레오탁스 옆에 멸균 수술장에 배치되도록 하십시오.
- 생물 안전 수준 및 관련 기관 생물 안전 규제 요구 사항에 따라 바이러스 성 구조를 처리하고 저장합니다.
- 적절한 취급 관행과 개인 보호 장비를 사용하는 데 주의를 기울여 주사기에 바이러스를 그립니다.
4. 마취
- 수술 전에 마우스의 체중을 기록합니다.
- 이소플루란을 사용하여 마우스를 심히 마취합니다.
- 플린칭 응답이 없을 때까지 발가락 핀치 테스트를 수행하여 마우스가 심히 마취되었는지 확인합니다. 동물이 강한 반사 신경을 계속 표시하는 경우, 마취의 농도 및 / 또는 기간을 증가.
- 각 눈에 눈 연고를 바르면 수술 중에 촉촉하게 유지하십시오.
- 두피를 귀 뒤에서 머리 깎아 눈 바로 뒤로 면도합니다.
- IACUC 승인 진통제와 마우스를 제공합니다.
- 수술 시술 전반에 걸쳐 동물을 지속적으로 모니터링하고 열 지원을 제공합니다.
5. 외과 적 절차
- 상단 절개를 물린 막대의 틈새에 놓고 혀가 물린 바 아래에 있는지 확인하여 머리 홀더에 넣습니다.
- 이어바를 외부 청각 육류에 부드럽게 삽입하여 이어바를 고정하여 이어바가 대칭적으로 배치되도록 합니다(일반적으로 성인 마우스의 경우 3~4개). 이 단계는 헤드가 안정적이고 회전중심이 되도록 하는 데 매우 중요합니다.
- 부시적으로 베타딘과 알코올 면봉의 세 번갈아 스크럽으로 면도 절개 영역을 준비하거나, 또는 다른 제도적으로 승인 된 수술 부위 준비.
- 멸균 수술장을 유지하고 수술 후 감염의 위험을 줄이기 위해 동물 위에 외과 커튼을 놓습니다.
- 두피의 처상 중간선을 따라 절개를 함으로써 두개골을 노출시합니다. 두개골 표면을 부드럽게 긁어 내어 근막을 제거하고 봉합사를 노출시합니다.
참고: 봉합선이 시각화하기 어려운 경우, 과산화수소는 봉합물 시각화를 개선하기 위해 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 두개골에 적용될 수 있습니다. - 중앙 범위를 홀더에 배치하고 bregma(그림 4,왼쪽 패널)에 십자선을 중심으로합니다. 마이크로 조작기제로.
- 십자선을 람다로 옮기고, 브레그마 람다(B-L) 거리를 주목한다.
참고: 봉합사 선이 미드라인을 따라 직선을 따라가지 않는 경우, 브레그마와 람다를 통해 "가장 적합한 라인"을 사용하여 미드라인을 설정하는 것이 좋습니다. 그러나 위의 단계를 따르는 경우, 범위 망상의 초기 배치는 이어 바 사이의 중간이어야하며 B-L 중간 선 봉합사에 밀접하게 근사해야합니다. - B-L 거리가 4.21mm보다 훨씬 적거나 큰 경우 할당된 브레그마를 점진적으로 조정하여 0.2mm의 B-L 거리를 ±.
- 중심 범위를 정렬 표시기로 바꿉다. 람다와 브레그마에 프로브를 놓고 머리 홀더의 등지 기울기 손잡이를 위 또는 아래로 향하는 코의 수준으로 조정한 다음 중심 범위를 사용하여 bregma를 다시 할당합니다.
- 관상 기울기 손잡이를 사용하여 관상 평면의 레벨에 정렬 표시기를 사용합니다. 두개골의 표면 변형을 고려하여 장막/소달 축 전체의 여러 지점에서 측정합니다.
- 관상 기울기 손잡이의 다이얼의 위치를 참고하십시오.
6. 각진 좌표에 대한 회전의 중앙 축 정렬
- 공구 홀더의 중심 범위를 보호하고 마이크로 조작기를 섹션 1에서 계산된 좌표에 배치합니다. 각진 이식에 대한 R/L 좌표는 측면 A의 길이에 해당합니다.
- 도 1의예에서, VMN을 대상으로 하는 광섬유 배치에 대한 각진 좌표는 (0° 코로날 회전에서 A/P = -1.4, R/L = [2.03], [0.00] 15° 관상 회전, D/V = -5.4)이다.
- 범위를 아래로 보고이 좌표를 표시 (VMN 예당 중간라인에서 R / L 2.03 mm; 그림 4,중간 패널). 이 표시는 머리가 회전하면 캐뉼라가 뇌에 들어가는 지점을 나타냅니다.
- 중간선(R/L = 0.00)을 통해 미세 조작기 재배치. 관상 기울기 손잡이를 사용하여 1절에서 계산된 각도로 머리를 회전시합니다.
- 스코프 십자선이 이미 마크와 정렬된 경우 섹션 7로 진행합니다.
- 스코프 십자선이 기준마크와 일치하지 않는 경우, 십자선이 마크에 가능한 한 가까이 줄 때까지 수직 시프트 노브(도2)를사용하여 z축의 헤드 위치를 조정한다.
- 머리를 0° 관상 위치로 다시 회전합니다. 수직 시프트가 6.3 단계에서 조정된 경우 중심 범위를 사용하여 bregma를 다시 할당합니다.
- 십자선이 머리회전 시 기준마크에 일관되게 부딪힐 때까지 6.3 및 6.4단계를 반복한다(도4C).
- 이 시점에서 섹션 1에 설정된 임의회전 지점이 이제 회전의 고정체 중심과 정렬되어야 합니다.
7. 미세 주입
- 고정 관념 드릴을 홀더에 놓고 마이크로 조작기를 첫 번째 사출 좌표로 기동합니다.
- VMN을 대상으로 하는 예에 따라, 헤드가 레벨인 동안 A/P = -1.4 및 R/L = 0.4에서 드릴한다.
- 비트가 두개골 바로 위에 될 때까지 드릴을 낮춥다. 드릴을 켜고, 비트가 두개골을 뚫을 때까지 부드럽게 낮춥니다(두라가 아님).
- 금단사 주입 부위에 대해 반복하십시오.
- 멸균 바늘 드라이버를 사용하여 27-30G 바늘 (예 : 멸균 0.5 mL 인슐린 주사기)에 90 ° 굽힘을 도입하고 구부러진 바늘을 사용하여 듀라 마터를 부드럽게 찌릅니다.
- 참고: 출혈이 발생하면 멸균 면 팁 어플리케이터로 압력을 가하고 출혈이 멈출 때까지 멸균물로 청소하십시오.
- 주입 할 준비가되면, 신중하게 스테레오 테틱 홀더에 채워진 해밀턴 주사기를 배치합니다.
참고: 새 도구로 전환한 후 마이크로 조작기의 좌표가 더 이상 적용되지 않습니다. 버 구멍의 중심을 주입을 위한 새 대상으로 사용하십시오. - 조심스럽게 버 구멍 위에 바늘을 배치합니다.
- 바늘이 버 구멍의 중앙 에 있는 두라에 약간 닿을 때까지 낮춥습니다. 중요: 고정관 중심 범위 및 드릴에 대한 미세 조작기의 좌표가 유지되는 등 z축에서만 미세 조작기제로 고정됩니다.
- 바늘을 천천히 뇌로 낮추고 바늘이 버 구멍 가장자리에서 빗가지 않도록 면밀히 관찰합니다. D/V 사출 좌표에 0.05mm 복부까지 계속 낮추고 1분 기다립니다. 이 추가 단계는 바늘 제거에 바이러스 성 역류를 최소화하기 위해 작은 "포켓"을 만듭니다.
- 천천히 바늘을 D/V 좌표로 올리고 주사를 시작합니다.
참고: 유량과 부피는 대상 영역 및 실험 설계에 따라 달라집니다. VMN 뉴런의 광유전학 침묵의 경우 충분한 커버리지가 필요하므로 200 nL의 바이러스가 1 nL/s의 속도로 주입됩니다. - 마이크로 주입 다음, 철수 하는 동안 바이러스의 efflux를 최소화 하는 주사 사이트에서 10 분 기다립니다.
- 천천히 1mm / 분의 대략적인 속도로 뇌에서 마이크로 파이펫을 철회.
- 바늘이 두개골이 맑으면 바늘이 혈액이나 조직으로 막히지 않도록 소량의 바이러스를 배출하십시오. 멸균 면 팁 어플리케이터를 사용하여 바이러스를 제거하기 전에 계속하십시오.
- 반복 단계 7.6-7.12 에 대한 모순 측.
- 치유를 개선하기 위해 뼈 왁스로 미세 주입 버 구멍을 밀봉(그림 5B).
8. 광섬유 이식
참고: 바이러스 주사 후, 양측 광섬유 카누아섹션 1당 계산된 각도로 이식됩니다. 이러한 좌표는 이미 섹션 6의 두개골에 표시되어야 합니다.
- 각진 좌표에 대해 7.1 ~7.4 단계를 반복합니다.
- 머리를 레벨 0° 위치로 되돌려 놓습니다.
- 다음으로, 손 드릴을 사용하여 뼈 나사에 대한 4개의 추가 구멍을 생성합니다: 2개는 전방으로 배치되어야 하고 2개의후방(그림 5A). 이들은 두개골에 광섬유를 부착하는 앵커 역할을합니다(그림 5D).
참고: 두개골 위에 있는 광섬유의 발효 부분을 수용할 수 있도록 각진 좌표 버 구멍에서 멀리 떨어진 구멍을 공간화해야 합니다. - 가능한 한 부드럽게 작은 플랫 헤드 드라이버를 사용하여 두개골에 단단히 앉아 있지만 뇌를 관통하지 않도록 뼈 나사를 설정합니다.
- 광섬유 캐뉼라를 캐뉼라 홀더에 고정하여 스테레오테틱 홀더에 넣습니다.
- 계산된 각도로 머리를 회전하여 마이크로 조작기의 좌표가 새 도구에 적용되지 않는다는 점을 다시 지적합니다. 각진 버 구멍의 중심을 이식 대상으로 사용한다.
- 버홀(그림 5C)의중앙 내의 두라에 닿을 때까지 광섬유를 낮춥니다. z축에서 마이크로조작기를 0으로 만든 다음 광섬유를 D/V 각진 좌표로 천천히 느리게 합니다(VMN 예제당-5.4).
- 시아노아크레이트 젤을 사용하여 광섬유 퍼룰을 ipsilateral 앵커 나사에 연결한 다음 마이크로 피펫팁(그림 5D)으로가속을 적용합니다.
- 시아노아크라일트 젤이 완전히 강화되면 캐뉼라 홀더를 부드럽게 풀고 광섬유 발효가 제거될 때까지 올립니다.
- 반대로 각진 좌표에 대해 8.5-8.9 단계를 반복한 다음 머리를 평평하게 합니다. 추가 보안을 위해, 시아노아크레이트 젤과 가속제(도5D)와두 각진 광섬유 캐뉼라 를 추가로 연결한다.
- 작고 상대적으로 얇은 양의 치과 시멘트를 준비하십시오. 두개골 표면에 바르면 광섬유 캐뉼라의 앵커 나사와 베이스를 철저히 덮으십시오. 광섬유 패치 케이블과의 후속 결합을 위해 퍼룰을 충분히 깨끗하게 유지합니다.
- 시멘트가 건조 완료되면, 스테레오 전술 장치에서 마우스를 제거합니다.
- 열 지지가 있는 복구 케이지에 마우스를 배치합니다. 복구하고 경고, 모바일, 손질되면 홈 케이지로 전송 할 수 있습니다.
9. 수술 후 치료
- 행동, 자세, 활동 및 그루밍을 위해 수술 후 3 일 동안 매일 동물을 모니터링하고 음식 섭취량과 체중기록을 보관하십시오.
- 동물이 통증이나 건강이 좋지 않은 일반적인 지표를 나타내는 경우 수의사 서비스와 상의하십시오.
- 마우스를 적어도 허용 2 복구 및 행동 연구를 시작 하기 전에 바이러스 성 발현에 대 한 주.
10. 광유전학
- 광유전학 연구의 성능을 위해, Sidor 외.8을참조하십시오.
- 연구 완료 시 바이러스 성 발현 및 섬유 배치를 검증합니다.
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Representative Results
이 프로토콜은 혈당 조절9에서시상 하 부 VMN 뉴런의 역할을 심문하기 위한 광유전학 연구를 수행하기위한 외과 적 절차를 설명합니다. 먼저 활용된 것은 VMN에 대한 억제 채널로도신 바이러스의 양자 미세 주입을 위한 표준(비각각) 입체적 접근법이었다. 각진 접근법도 적합하지만, 관심 있는 뇌 영역을 대상으로 하기에 충분하고 쉽고 신뢰할 수 있고 일관된 접근 방식이기 때문에 표준(비각각) 접근법이 선택되었습니다. 그러나, VMN이 중공선에 근접한 점을 감안할 때, 공간 제약은 양측 광섬유의 비각각 이식을 허용하지 않았고, 광섬유를 각도로 정확하게 이식하기 위한 외과 전략의 개발이 필요하였다(그림6).
이 외과 전략을 사용하여, 우리는 "SwiChR ++" 바이러스10이라고칭한 변형된 채널로 도프신 애니온 전도 채널을 표현하는 Cre 의존AAV를 마이크로인치, Nos1-cre 마우스의 VMN에 양자간. 이어서 각 주사 부위에 중간선으로부터 15° 각도로 광섬유 를 이식하였다. 예상대로, 바이러스 성 발현은 VMN으로 제한되었고 다른 뇌 영역에서는 검출되지 않았습니다.
도 1: 시상하부 심혈핵을 대상으로 하는 각진 좌표를 계산하는 대표적인 예입니다. 각도 및 선 세그먼트는 배율조정에 그려지지 않습니다. (A)이 길이는 기본 삼각법으로 계산해야 합니다. 이 예에서 A = 2.03 mm.(B)임의회전 축의 할당에 따라 추정 된 길이. 이 예에서 B = 7.576 mm.(C)계산된 저혈압. 광섬유/바늘 삽입의 깊이는 최적화가 필요한 대상 부위에 원하는 근접에 따라 달라집니다. 이 수치는 Faber 등에서 수정되었습니다. 201911. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 스테레오전술 헤드 홀더 장치에 대한 조정 노브. 이 수치는 Faber 등에서 수정되었습니다. 201911. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 머리 홀더 회전 중심정렬. (A)이어바 의 위치 지정. (B)수직 시프트를 조정하기 전에 15° 회전 시 0° 레벨 관상 회전(왼쪽)에서 범위를 내려다보고, 회전 중심이 정렬(가운데) 및 수직 시프트를 조정한 후 15° 회전하는 동안, 회전 중심이 적절히 정렬되고(오른쪽). 이 수치는 Faber 등에서 수정되었습니다. 201911. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 브레그마를 할당하고 동물 머리를 회전의 중앙 축과 정렬합니다. (A) 일반적인 bregma 배치를 나타내는 대표적인 이미지. (B)헤드가 정렬 전 수준인 동안 참조 마크를 그립니다. (C)수직 시프트를 조정하고 브레그마를 재조정한 후 회전축을 적절히 정렬하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 광섬유 이식 절차. (A)미세 주입 (m), 광섬유 (f) 및 앵커 나사 (*)에 대한 파일럿 구멍의 중심 범위 보기. (B)이식된 앵커 나사및 뼈 왁스 커버 미세주입 드릴 구멍의 중심 범위 보기. (C)각진 이식 중에 광섬유를 제자리에 배치합니다. (D)대표적인 양측 각진 광섬유 배치. 점선 된 검은 화살표는 슈퍼 접착제가 앵커 나사와 ipsilateral 광섬유에 광섬유를 고정하는 데 사용되는 영역을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 심엽실 시상하부 양측 표적에 대한 대표적인 결과. (A)VMN을 대상으로 양자 미세 분사 및 각진 광섬유 전략을 나타내는 회로도. (B)각진 광섬유로의 SwiChR-GFP 및 조직 손상의 양측 발현을 보여주는 대표적인 이미지. 3V = 제3 심실, ARC = 아크로테 핵 및 VMN = 심엽기 핵. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
신경 과학의 최근 발전은 뇌 신경 회로의 활동과 기능에 대한 고급 통찰력과 이해를 지원했습니다. 이것은 생체 내의 이산 신경 인구 및 그들의 투영 사이트를 활성화하거나 침묵하기 위하여 optogenetic 및 화학 유전학 기술의 응용을 포함합니다. 최근에는 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표(예를 들어, GCaMP, RCaMP) 및 기타 불소 측정 생체 센서(예: 도파민, 노르에피네프린)의 개발을 포함하고 있으며, 자유롭게 움직이는 동물의 정의된 세포 유형에서 신경 활성을 생체 내에서 기록하는 데 포함되어 있다. 그러나 이러한 기술의 효과적인 고용은 관심 영역을 대상으로 성공적인 입체 수술에 의존합니다. 많은 두뇌 지구를 표적으로 하는 데 적합한 이러한 방법을 설명하는 몇몇 확립된 프로토콜이 있는 동안, 중간선을 따라 깊은 두뇌 지구를 표적으로 하는 것은 중요한 추가 도전을 나타냅니다. 여기에 입증 각도 입체 접근 방식을 통해 이산 뇌 영역을 대상으로 상세한 수술 기술입니다. 중요한 것은, 이 기술은 적응하고 신경 과학 기술의 다양한 범위에 적용될 수 있습니다 (즉, 광유전학, 화학 유전학 및 섬유 광합성 접근).
이러한 접근법을 이용하여, VMN 뉴런의 급성 광유전학 침묵이생쥐9에서인슐린 유발 저혈당에 대한 글루카곤 반응을 발동시키는 뉴런 산화물 신디사이저(VMNNOS1 뉴런)를 발현하는 것으로 나타났다. 약간 변형된 접근법을 사용하여, VMNNOS1 뉴런 1)의 일방적인 활성화가 일반적으로 저혈당에 대한 반응을 위해 예약된 반규제 반응에 의해 구동되는 견고한 고혈당을 유도하고, 2) 방어 부동성 행동을 유도한다는 것을 더 입증된다. 더욱이, 이러한 행동 및 신진 대사 응답 은 별개의 뇌 영역에 신경 예측을 포함. 구체적으로, Stria 말단의 전방 침대 핵으로 투사되는 VMNNOS1 뉴런의 활성화는 혈당 반응에 관여하는 반면, 복어로 발사되는 VMNNOS1 뉴런은 공포 유발 행동 반응9에연결된다.
프로토콜은 Kopf Model 1900 스테레오탁스 및 동반 액세서리와 매우 구체적이라는 점에 유의해야 합니다. 이 시스템은 정확하고 재현 가능한 이식뿐만 아니라 이산 뇌 영역(여러 도구에 걸쳐 공통중심 위치)에 미세 주입을 가능하게 하지만, 전략과 접근 방식은 다른 스테레오탁스 프레임에 맞게 조정할 수 있습니다. 구체적으로, 각진 미세 주입 및 이식을 수행하기 위해 머리를 회전하는 대신, 대안적인 접근법은 동일한 원리를 활용하고 대신 등복부 조작기를 회전시키는 것입니다(Correia외. 12참조).
새로운 방법과 마찬가지로 개인이 실험의 신뢰성, 일관성 및 정확도를 개선하기 위해 기술을 최적화하는 것이 중요합니다. 또한 데이터의 적절한 분석 및 해석에 필요한 적절한 제어를 포함하는 것이 중요합니다. 여기에는 크레네거티브 리터메이트 컨트롤, 바이러스 기자 제어(즉, AAV-GFP), 전기생리학을 이용한 빛 의존성 뉴런 발사 변조 검증, (연구 완료 시) 관심 영역에서바이러스 표적화 및 광섬유 배치의 유효성 검사가 포함됩니다. 기술적 고려 사항과 제안된 컨트롤에 대한 자세한 검토를 위해 카르도조와 램멜13의 출판물을 참조하는 것이 좋습니다.
요약하자면, 더 진보되고 정확한 신경과학 기술의 도입은 행동, 인식 및 생리학에서 뇌의 역할에 대한 상당한 발전과 이해를 지원해 왔으며, 이러한 발전은 CNS 관련 장애에 대한 잠재적 인 치료법으로 이어질 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 당뇨병 및 소화 및 신장 질환 연구소 (NIDDK)가 F31-DK-113673 (C.L.F.), T32-GM-095421 (C.L.F.), DK-089056 (G)에 의해 지원되었습니다..M 미국 당뇨병 협회 혁신적인 기초 과학 상(#1-19-IBS-192 ~ G.J.M)과 NIDDK 가 자금을 지원하는 영양 비만 연구 센터(DK-035816), 당뇨병 연구 센터(DK-017047) 및 당뇨병, 비만 및 신진 대사 훈련 그랜트 T32 DK0007247 (T.H.M) 워싱턴 대학에서.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fiberoptic Cannulae | Doric Lenses | MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT | Customizable |
| Kopf Model 1900 Stereotaxic Alignment System | Kopf | Model 1900 | |
| Kopf Model 1900-51 Center Height Gauge | Kopf | Model 1900-51 | |
| Kopf Model 1905 Alignment Indicator | Kopf | Model 1905 | |
| Kopf Model 1911 Stereotaxic Drill | Kopf | Model 1911 | |
| Kopf Model 1915 Centering Scope | Kopf | Model 1915 | |
| Kopf Model 1922 60-Degree Non-Rupture Ear Bars | Kopf | Model 1922 | |
| Kopf Model 1923-B Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf | Model 1923-B | |
| Kopf Model 1940 Micro Manipulator | Kopf | Model 1940 | |
| Micro4 Microinjection System | World Precision Instruments | -- | |
| Mouse bone screws | Plastics One | 00-96 X 1/16 | |
| Stereotaxic Cannula Holder, 1.25mm ferrule | Thor Labs | XCL | |
| Surgical Drill | Cell Point Scientific | Ideal Micro Drill |
References
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