Summary
激光消融是研究生物系统再生的一项广泛应用技术。提出的方案描述了使用标准激光扫描共生显微镜进行激光消融，以及斑马鱼横向线中再生内泌细胞的后续延时成像。
Abstract
毛细胞是机械感细胞，可以调解听觉。这些细胞在人类受损后不会再生，但它们在非哺乳动物脊椎动物（如斑马鱼）中自然补充。斑马鱼横向线系统是一个有用的模型，用于描述感觉毛细胞再生。横向线由头发细胞器官组成，称为神经瘤，由一串内膜细胞（INMC）连接在一起。INMC作为祖细胞，在发育过程中产生新的神经瘤。INMC 可以修复细胞死亡创建的横向线系统中的间隙。此处介绍了一种使用传统的激光扫描共生显微镜和转基因鱼在 INMC 中表达绿色荧光蛋白的选择性 INMC 消融方法。然后，延时显微镜用于监测 INMC 再生并确定间隙闭合率。这表示不需要专用设备的细胞消融的可访问协议，例如高功率脉冲紫外激光器。消融协议可能服务于更广泛的利益，因为它可能有助于其他细胞类型的消融，使用的工具集已经可供许多用户使用。该技术将进一步实现不同条件下和不同遗传背景下的 INMC 再生表征，从而促进对感觉祖细胞再生的理解。
Introduction
最渐进的听力损失的核心是感觉毛细胞的破坏，这些细胞将外在的听觉刺激转化为大脑可检测到的神经冲动。耳蜗毛细胞死亡导致永久性听力损失，因为成年哺乳动物缺乏在损伤后再生这些细胞的能力。相反，非哺乳动物脊椎动物，如斑马鱼，可以再生因声学创伤或耳毒性侮辱而失去的毛细胞。斑马鱼机械感横向线是一个简单和容易操纵的器官系统，可用于研究毛细胞再生1，2，3。
横向线由称为神经瘤的小感觉斑块组成，这些斑块在发育过程中由一串称为内膜细胞（INMC）的拉长细胞连接。鉴于其增殖能力作为明显的干细胞，产生新的头发细胞包含器官，INMC的行为是社区非常感兴趣的4，5。与INMC相关的许多研究都表明，附近的Schwann细胞抑制其增殖，这些细胞缠绕在横向线神经周围，可能通过Wnt/β-catenin信号的抑制剂。6，7，8.虽然对 INMC 增殖和分化到新神经瘤的调控已经描述得很清楚，但管理 INMC 在消融后再生的机制尚未阐明。该协议作为一种消融单个 INMC 和分析其后续再生行为的方法。
各种破坏毛细胞、支持细胞和整个神经瘤的方法已经发表，以及监测恢复的方法。化学消融对毛细胞有效，但有毒化学物质的剂量，如CuSO4必须显著增加，以消除其他横向细胞类型9。虽然荧光显微镜下的电融是破坏 INMC 以研究再生的一种有效而简单的方法，但很难狭隘地瞄准，因此可能会造成重大的附带损害。因此，这可以掩盖 INMC 特定行为10 、11的各个方面。激光消融协议已经采用，但它们要求使用一般实验室或成像设施中不一定存在的专用设备（即高功率脉冲紫外激光器12）。此处描述的方法可与配备普通 405 nm 激光的激光扫描共电显微镜执行，通常用于成像 DAPI 和其他蓝色荧光。这种方法的一个优点是，在细胞损伤之前和之后可以立即进行共声成像，而无需使用任何其他激光控制系统或转移到配备脉冲激光的另一台显微镜上。
一种类似的方法被描述为斑马鱼脊髓13的消融神经元。但是，上一种方法需要用于细胞消融的 FRAP 模块，这不是此协议的要求。此外，鉴于不同细胞类型（即转基因荧光的亮度、体内的深度和细胞形状）的不同属性，根据使用的细胞类型，可能需要进行重大修改。此处详述的协议更有可能对更肤浅的细胞有效，因为使用相同方法演示感觉毛细胞消融。还概述了一个再生测定，以评估消融后 INMC 的恢复率，这不是上述研究的一个特点。
本文详细介绍的基于激光的细胞消融协议通过优化激光条件、消融前和消融成像以及延时显微镜，捕获 INMC 的再生能力。这些要素汇集在一起，全面描绘了 INMC 的再生和差距缩小。虽然此协议在这里用于销毁 INMC，但它可能应用于需要可靠和有效评估细胞消融的其他工作。它也是一种可访问的技术，因为它可以在任何配备 405 nm 激光的共合显微镜上进行。
Protocol
所有动物工作都经过佩斯大学机构动物护理和使用委员会根据2018-1号议定书的批准。
1. 斑马鱼幼虫的准备
- 在进行实验前3~5天建立交配，这样幼虫在安装激光消融时，在受精后2天（dpf）到4dpf。
注：Et（krt4：EGFP）sqEt20（简称ET20）增强剂陷阱线，其中内胚细胞清楚地标有增强的绿色荧光蛋白（eGFP），允许相对容易的细胞识别和消融11，14。为了确认激光消融特异性和灵活性，ET20鱼用Tg（神经D：tdTomato）鱼繁殖，其中横向线神经标有红色荧光蛋白或Tg（myo6b：actin-GFP），用GFP15，16标记感觉毛细胞。 - 第二天胚胎采集后，在E3介质中孵育含有0.0001%甲基乙蓝色，直到准备麻醉和安装。
2. 制备低凝胶加糖和三油溶液
- 在 250 mL 玻璃 Erlenmeyer 烧瓶中，加入 48 mL 的 1x E3 介质、2 mL 的 15 mM 三叶草库存溶液和 0.5 g 低熔化的 agarose。
- 微波溶液在高30s和漩涡（戴热保护手套）溶解的气糖。重复 30 s 的加热循环，直到红糖完全溶解。
- 将糖储存在加热至42°C的培养箱中，直到准备好使用。
3. 斑马鱼幼虫麻醉
- 在 50 mL 锥形管上，加入 24 mL 的 1x E3 介质和 1 mL 的三金库存溶液 （15 mM） 到最终浓度为 600 μM. 漩涡混合。
- 用含有600μM三丁的8 mL E3，装载平底细胞培养板的六孔之一。
- 使用转移移液器将斑马鱼幼虫移入 74 μm 网下转移插入。
- 将网状底部刀片转移到包含 E3 + 三分液的六井板的井中。让幼虫在井中至少保持3分钟或直到完全麻醉。通过敲击插入件测试麻醉。幼虫不应该因为水龙头而起头和游泳。
4. 麻醉斑马鱼幼虫的荧光筛查
- 将每井一个麻醉幼虫放到 12 个井中疏水涂层的幻灯片上进行筛选。确保幻灯片每个井中形成的半月板的曲率最小，以减少筛选时光学失真。这可以通过在放置幼虫后从每一个井中去除少量 E3 来完成。
- 在直立显微镜上的 10 倍目标下（配备汞弧灯、金属卤化物灯或 LED 光源以及适当的滤波块），在侧线系统的神经瘤细胞和内神经瘤细胞中表达 eGFP 的幼虫屏幕。
- 选择表达更强烈的幼虫，从而产生更亮的eGFP，这大概是转基因的同质性。
注：在ET20线中，eGFP以环绕每个神经瘤的地衣细胞环以及连接这些器官的内皮瘤细胞的狭窄地带表示。更强的eGFP表达（更亮的荧光）有助于更有效的消融。 - 为了检查消融的特异性，使用双转基因幼虫与ET20 和Tg（神经D：tdTomato） 转基因。如果筛选 Tg（神经D：tdTomato）载体， 使用 RFP 滤波数据集设置来识别一个鲜红的补丁，只是后侧侧线结节的耳朵后面。
- 要在横向神经瘤中除合毛细胞 ，请使用Tg（myo6b：+actin-GFP） 转基因线和屏幕，在每个神经瘤的中心进行GB定位。
- 选择表达更强烈的幼虫，从而产生更亮的eGFP，这大概是转基因的同质性。
- 选择具有神经瘤的陈规定型间距的幼虫。神经瘤间间距的差异可能表明神经瘤在发育过程中出现异常，表明在横向基因17中存在有缺陷的迁移行为或细胞增殖。此类缺陷还可能影响消融后 INMC 的迁移或再生行为。
注：间距的常见缺陷包括由第一迁移的原生（prim1L1）沉积的前部最神经瘤与由同一原始沉积的第二个神经瘤（prim1L2）之间异常大的距离，通常与更多的后瘤的拥挤有关。
5. 安装幼虫，用于激光消融和成像
- 点管 3 - 4 麻醉幼虫成一小滴 E3/三分液在盖滑底盘的中心 （35 毫米菜与 14 毫米数字 1.5 盖玻片）.去除多余的溶液，使幼虫保持在一个小液滴中，只是大到足以容纳它们。
- 将碟子转移到双目立体显微镜的舞台上，并操纵变焦和对焦，使所有幼虫都进入视野。
- 从加热培养箱中取出含有低熔点阿加糖的 Erlenmeyer 烧瓶。使用转移移液器将阿加罗斯溶液转移到盖幻灯片上，以生成薄层。抽出多余的藻糖，直到液体填满盘子底部的井，注意不要吸气任何幼虫。
- 使用发刀或发圈快速排列在 agarose 溶液中的幼虫，以便它们彼此对齐，并向左排列左角。
- 用发刀轻轻压下幼虫的玻璃，使幼虫的右侧向下。它们位于轮廓中。年龄超过3 dpf的幼虫往往漂浮，因为他们膨胀的游泳膀胱，所以他们可能需要反复压在玻璃上，直到阿加罗斯开始凝胶。
- 大约60岁后，阿加罗斯将开始凝固，幼虫将无法重新定向。在室温下，请等待约 5 分钟，使盖滑上的红玫瑰完全凝固。一旦气糖凝固，使用转移移液器填充一半与E3含有1x三分素的菜。
6. 定位预期目标和消融前成像
- 打开激光扫描共声显微镜系统的电源，并通过集成成像软件进行初始化。选择 63x Plan-Apochromat 油浸入目标（数值孔径 1.40）或类似。涂抹浸入式油，并将盘子固定在圆形阶段插入，使幼虫朝左的左面。
- 在亮场或差分干扰对比度照明下，选择其中一种安装的幼虫进行成像。使用对焦旋钮调整对焦，使最接近盖玻片的鱼侧的皮肤对焦，通过上月细胞的指纹样图案来识别。
- 对焦后，切换到 GFP 通道中的荧光照明。通过 GFP 表达式沿水平 myoseptum 定位后侧线。荧光细胞环表示神经瘤地衣细胞，而拉长的细胞链是内皮瘤细胞。
- 从原始 1 神经瘤开始，通常位于蛋黄的后，使用舞台控制操纵杆或其他舞台运动控制，沿水平 myoseptum 目视扫描。
- 遵循内胚细胞的字符串，直到到达primIL3和primIL4（L3和L4）神经瘤之间的区域（图1A）。
注：其他区域也可以作为目标，但主干和尾部的这一部分往往最接近盖玻璃，因此，最易消融。 - 如果对多个幼虫进行成像，请设置第一阶段位置，然后通过取消选择相应的复选框来停用多个阶段位置选项。
- 重复步骤 6.4.1=6.4.2。每个所需的阶段位置（每个幼虫）。
- 遵循内胚细胞的字符串，直到到达primIL3和primIL4（L3和L4）神经瘤之间的区域（图1A）。
- 识别 L3+L4 区域中的细胞体后，切换到采集模式。
- 使用 488 nm 或 491 nm 激光激活 GFP 成像轨道。
- 通过激活"成像设置"下拉菜单下的 T-PMT 复选框，将透水光（透光光电倍增管或 T-PMT）通道添加到激活的 488nm 激光轨道。
- 将激光功率设置为 6%，针孔尺寸设置为 1 个 Airy 单元等效，将数字增益设置为 750，用于成像 ET20 幼虫。任何给定的幼虫的精确增益和激光功率可能会有所不同，具体取决于它们安装的盖滑点有多近以及荧光的亮度。调整增益，使细胞体饱和，以捕获否则暗淡的投影和菲利波迪亚。
- 调整参数的帧大小为 1024 像素 x 1024 像素，数字变焦为 0.7（145.2 μm x 145.2 μm 图像大小）。将平均值设置为 2 以提高图像质量。
- 选中 z 堆栈框以显示 z 位置下拉菜单。在快速扫描时，聚焦，直到内科细胞刚刚出焦。设置第一个切片，然后聚焦通过样本，直到内胚细胞再次出焦点。设置最后一个切片。确保它包含大约 25 μm 的 z 堆栈。将成像间隔设置为 1 μm。
- 开始实验以捕获预消融 z 堆栈（图 1B）。如果已添加阶段位置，则停用位置选项，以便仅对当前位置进行成像。捕获文件后保存该文件。
7. 细胞体激光消融
- 单击 "显示所有工具"。此选项位于采集接口的顶部。
- 单击"映像设置"的下拉菜单。在 [成像设置] 中，单击 [添加新轨道]（表示为" "。
- 在"成像设置"中，单击"染料"的下拉菜单。选择 DAPI 作为染料。
- 单击"频道"的下拉菜单，通过取消单击其各自的复选框取消选择所有其他曲目。确保仅选择 DAPI 轨道。
- 在 DAPI 轨道中，单击 405 进行 "激光设置"。将激光功率提高至 75%。在扫描候选细胞体进行消融时，松开 DAPI 通道以关闭激光。
- 在视场中，内膜细胞的主体居中，将扫描帧放大至 20x~22 倍。在应用缩放时，可能需要调整框架位置，以保持单元格体居中。一旦单元格正文填满视场，请停止实时扫描。
注：单元格主体应占据整个视野。在此缩放级别，GFP 将快速漂白。通过快速工作，最大限度地缩短激光曝光时间。使用变焦而不是选择感兴趣的区域来增加小区域的激光功率分布。 - 检查 405 nm 激光快门盒以激活轨道。将激光功率调整为 75%。设置 45 s 的计时器。激活连续扫描并启动计时器。在 45 s 时立即停止扫描。
8. 延后成像和延时显微镜研究再生
- 单击"频道"的下拉菜单。在通道中，取消单击[DAPI]轨道以灭活消融激光。单击"获取模式"的下拉菜单。
- 在采集模式下，单击"缩放"。
- 通过使用滑块或键入"0.7"，将缩放减小到0.7。
- 为确保细胞消融成功，将增益增加至900，并快速扫描视场。
注：目标单元格或单元格中不应显示 GFP。如果荧光仍然观察到，则返回到步骤 7.1~7.3。 - 使用与消融前成像描述的相同或类似设置，捕获并保存消融后图像（图 1C）。如果图像显示荧光细胞或其他细胞体的残余物需要去除，请重复激光消融步骤，在内膜细胞串中产生可见的间隙。
- 检查 T-PMT 通道图像以进一步确认细胞损坏。受损的细胞会有颗粒状的外观，并且核经常会膨胀或变得不规则的形状（图2）。
- 为确保细胞消融成功，将增益增加至900，并快速扫描视场。
- 捕获消融前图像、必要时消融单元格以及捕获每个单个阶段位置的延后图像后，通过激活用于图像捕获的阶段位置和时间选项来设置延时显微镜。将时间参数设置为 24 小时或其他所需端点和 15 分钟间隔。开始实验以获取图像并在完成时保存生成的文件（第二天）。
- 如果要进一步研究或提高幼虫，请用细钳将幼虫从红糖中小心地取出，然后转移到E3介质中，无需三分素即可恢复。如果不进一步使用，根据批准的动物协议安乐死（快速和持续浸泡在冰浴中是一种常见方法），并按照机构的要求处理它们。
9. 图像分析
- 在首选图像处理软件（材料表）中打开一个后消融 z堆栈文件。拆分通道，使每个通道位于单独的查看窗格中。
- 在 GFP 通道窗口中，使用直线工具在其余 INMC 的尖端之间绘制一条直线。这可以通过在 z 堆栈中上下滚动或在绘制线条之前执行最大强度投影来帮助。
- 使用"测量"工具获取在 x 和 y 平面中 INMC 端之间的距离。
- 滚动浏览原始 z 堆栈中的 z 切片，以确定 z 平面中的 INMC 之间的距离。
- 使用毕达哥拉斯定理计算 INMC 末端之间的总距离（2 + b2 = c2。低衰量是总距离（或间隙大小）。
- 在电子表格应用程序中输入结果距离测量，以进行数据分析。
- 使用共和系统上的集成成像软件或免费提供的图像分析软件查看步骤 8.2–8.3 中收集的延时显微镜文件。确定通过细胞投影填充内膜细胞间间隙的时间点。这可以通过检查多个 z 切片来确认所有维度的间隙的闭合。
- 要最准确地测量间隙闭合时间，请使用消融后图像时间戳（在 Finder 或文件资源管理器中可见）作为零时间点;测量从延时图像堆栈开始的时间可能会导致低估关闭时间，具体取决于在消延其他阶段位置等时经过的时间。
- 只需将原始间隙大小 （μm） 除以完全间隙闭合所需的小时或分钟，即可得出闭合率。
Representative Results
为了消融 INMC 并记录再生，如步骤 5.4 所述，ET20 转基因线的 GFP 表达斑马鱼幼虫在受精后 2 天或 3 天安装，进行消融。可以同时安装多种鱼，以便单个实验中可以捕获多个时间推移。确定了位于primIL3和primIL4神经瘤之间的横向线区域，并按照步骤6.5~6.7（图1A，B）中所述捕获了消融前图像。
三个细胞体被瞄准激光消融，在大约40μm的 INMC 字符串中形成间隙。通过高增益和随后的成像进行消融扫描后确认，消融区域中没有细胞体，在相邻的 INMC 的拉长投影之间留下间隙（图 1C）。细胞死亡通过消融后检查T-PMT通道进一步证明。受损和垂死的细胞被标记为肿胀和形状不规则的核以及颗粒状的外观（图2，概述）。在某些情况下，延时成像还显示，大型类腺细胞的招募可能是巨噬细胞（图2，星号）。消融的 INMC 周围的黑暗区域表示在上皮上膜细胞中光漂白。在这些实验中，这些细胞似乎没有被激光照射损坏或破坏;相反，他们的荧光暂时减少。延时显微镜显示，这些细胞通常在消融后恢复，并没有改变形状或以其他方式出现损坏（未发表的结果，Volpe等人）。
为了支持INMC破坏的特异性，在双转基因ET20和 Tg（神经D：tdTomato） 幼虫中进行了消融，其中横向神经（在内神经细胞以下的微米以下运行）被标记为红色荧光蛋白。在 INMC 串中产生相当大的间隙的几个细胞的消融对基于红色荧光的横向线神经几乎没有或没有影响（图 3）。通过选择性地破坏横向线神经瘤内的单个感觉毛细胞，证明了消融表面局部细胞的技术的灵活性。使用与上面详述的基本上相同的协议（第7节和第8节 ），转基因Tg（myo6b：+actin-GFP） 幼虫中的单毛细胞被破坏，而不会对相邻细胞造成明显损伤（图4）。消融的毛细胞在延时显微镜后没有恢复荧光，其核在激光照射后明显颗粒状和畸形（图4B）。与 INMC 消融类似，明显的巨噬细胞经常被招募到激光照射点（未发表的结果，Volpe 等人）。
在激光消融和消融后图像捕获后，使用免费图像分析软件测量间隙大小。测量工具根据单个 INMC 的宽度和选择多少个细胞进行消融，演示了间隙大小，范围从几微米到 100 微米不等（图 5）。延时显微镜用于记录再生过程中的 INMC 行为。在50项试验中，15项差距（30%）在24小时内通过再生关闭。在大多数情况下，能够恢复的 INMC 在映像后的几小时内就恢复了。恢复被定义为来自邻近细胞的投影接触的时间点，该时间点在消融后 16 小时发生，间隙约为 40 μm（电影 1）。Z 堆栈经过仔细检查，以确保细胞接触发生在单个 z 平面内，避免了由于 z 投影而可能发生的伪影。逻辑回归分析表明，间隙闭合的概率与间隙大小相关（p = 0.0453），较小的差距更有可能愈合。间隙为 55.5 μm，则关闭概率为 50%（图 5）。
在70%的病例中，INMC无法完全缩小消融造成的差距。然而，即使在这些情况下，我们也能够监测来自邻近 INMC 的长投影的形成，这在某些方面类似于扩展神经元生长锥体（电影 2）。因此，这些实验还可以提供对INMC在损伤后行为的洞察。
图1：激光照射对内胚细胞进行选择性消融。（A） 选择神经瘤3和primIL4之间的内神经瘤细胞进行消融。这些单元格显示特征主轴形状，拉长投影与相邻单元格实体重叠。（B） 消融成像确定细胞体，可以消融产生间隙。（C） 消融后成像证实成功消融，如间隙区域无细胞体所示。比例线 = 10 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：消融后成像显示细胞死亡对GP标记的内膜细胞中的激光照射反应。透光光电倍增成像 （T-PMT） 表示存在具有颗粒状（包围）的坏死细胞，以及可能具有巨噬细胞的不规则形状的细胞的招募 （*） 。GFP 和 T-PMT 通道的合并确认细胞死亡和巨噬细胞活动发生在消融地点。比例线 = 10 μm. 请单击此处查看此图的较大版本。
图3：内神经瘤消融的特异性。（A） 双转基因Tg（ET20）中预消融GP标记的内皮瘤细胞（绿色）和ttomato标记的横向线神经 （红色）;神经D：tdTomato） 幼虫。靠近横向线神经的细胞体被瞄准消融。（B） 消融后成像显示目标细胞体与完整的横向线神经消融。比例线 = 10 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4：使用共体显微镜使感觉毛细胞消融。（A）消融成像确定一种GPC标记的感官毛细胞（*）透光光电倍增管（T-PMT）成像显示正常毛细胞形态，圆横截面。（B） 消融后成像确认靶向毛细胞成功消融。T-PMT 图像表示头发细胞形状不规则，激光照射后粒度增加，表明细胞死亡，而不是光漂白。比例线 = 10 μm。请单击此处查看此图的较大版本。
图 5：逻辑回归将间隙闭合的概率作为间隙宽度的函数（以 μm 为单位）进行模型。分数为 0 表示完全间隙闭合，而分数为 1 表示不完全间隙闭合。结果表明，间隙宽度对内胚细胞闭合各间隙的能力的影响具有统计学意义（p = 0.0453，n = 24 总计;n = 12 闭闭间隙，n = 12 不完全闭合间隙）。 请单击此处查看此图的较大版本。
电影1：16小时后显示间隙闭合（±40μm）的延时显微镜。 每 15 分钟捕获一次图像，并且所有时间点都会进行最大强度 z 投影。 请点击这里下载此视频。
电影 2： 未关闭的 INMC 间隙的延时显微镜。 将显示其余 INMC 的拉长和分支投影。 请点击这里下载此视频。
Discussion
该协议描述了一种通用的激光细胞消融方法，可以在任何配备近紫外线激光（405 nm 波长）的共合体显微镜上执行。该协议解决了以前采用的方法的限制，如电融（造成更普遍的损伤11）和脉冲UV激光消融（需要额外的专用设备12。前和后消融共合成像提供有关实验成功的快速反馈。随后的延时显微镜为细胞类型的再生提供了一个简单的检测，对于感官系统发育至关重要。
对在神经瘤和 INMC 中强烈表达 GFP 的转基因斑马鱼进行预筛选至关重要。具有明亮荧光的幼虫和原始衍生神经瘤的大致均匀间距是激光消融的候选选择。即使在这些鱼中，偶尔也会有变暗的 INMC，可能在第一次逃脱检测。这些细胞在激光消融后可以留在后面，防止在 INMC 之间形成真正的间隙。应调整数字增益，以在消融前成像期间显示这些调光器，以便它们也可以与 405 nm 激光瞄准（步骤 8.2）。
同样，激光瞄准有时不会完全摧毁细胞;相反，它会漂白荧光，导致未能创造真正的差距。这些细胞通常会在延时显微镜期间增加荧光。与T-PMT成像一起，在消融后成像步骤中的增益调整有助于确保所有目标细胞都得到有效去除。它通常需要两个或三个单独的细胞消融，以在 INMC 字符串中产生间隙。细胞死亡可以通过在目标细胞中出血或颗粒状外观来检测;不过，这可能需要激光瞄准后短暂的等待期（在某些情况下，不久之后会观察到明显的凋亡或坏死数字）。
此程序的一个限制是，在优化激光条件并成功进行 INMC 再生之前，可能需要多次实验试验。激光功率和激光的总停留时间可能需要对不同的样品进行轻微的调整。研究发现，过度的激光应用会损害横向线路自身修复的能力。这包括 1） 单个细胞过度暴露激光照射，可能对周围组织造成额外损伤，以及 2） 字符串中太多细胞的消融，导致更大的间隙。用户必须在充分照射细胞之间取得平衡，以确保其破坏，不要过度暴露细胞，因为细胞可能会减慢或阻止再生。通过适当的设置，发现可以移除 INMC，而不会对后侧线神经造成明显损伤，这表明与电融11不同，此协议将附带损害降至最低。在观察到的间隙中，没有形成新的神经瘤，大概是因为横向线神经完好无损，底层胶质细胞仍然和抑制 INMC 6、7、8、11的增殖。
证明这种共理激光消融方法也可以应用于其他细胞类型，特别是在那些表面上位于动物体内的细胞类型，包括感觉毛细胞（图4）。类似的方案可用于吸收皮肤细胞，以检查伤口修复或神经元的斧头再生研究，如前面描述的13。预计这项技术将成为实验室实验的有益补充，这些实验室拥有共体显微镜，但没有用于激光消融的其他专门设备。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作由NIH R15赠款1R15DC015352-01A1和佩斯大学内部资金来源资助。鱼线由弗拉基米尔·科尔日14号、凯蒂·金特15号、16号和詹姆斯·赫德斯佩斯实验室提供。我们要感谢A.詹姆斯·赫德斯佩斯和他的小组成员对这些实验的反馈，以及佩斯大学的同事的支持。RStudio 的物流回归分析尤其得到了我们同事马修·艾洛-拉门斯的协助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well PTFE Printed Slides | Electron Microscopy Sciences | 63425-05 | |
| 15 mM Tricaine stock solution | Sigma | E10521 | 15 mM Tricaine in reverse osmosis water |
| 1X E3 + 600 µM Tricaine | Dilute 15 mM Tricaine stock 25X in 1X E3 media | ||
| 1X E3 media | Dilute 60X E3 media to 1X in reverse osmosis water (16.7 ml/L) | ||
| 60 X E3 media | All components purchased from Sigma-Aldrich | 34.4 g Nacl, 1.52 g Kcl, 5.8 g CaCl2.2H2O, 9.8 g MgSO4.7H20 in 1 liter reverse-osmosis water | |
| Bx60 Compound microscope with mercury arc lamp fluorescence | Olympus | ||
| LSM 700 confocal microscope equipped with 405 nm, 488 nm, and 555 or 561 nm lasers | Carl Zeiss Microscopy, LLC | A 5 mW 405 nm laser was used for ablation; Ablations and imaging were performed through a 63x Plan-Apochromat objective with an NA of 1.40 | |
| FIJI/ImageJ Image processing software | Multiple contributors | Downloadable at https://fiji.sc/ | |
| Dissecting needle modified into hair knife | Fisher Scientific | 19010 | An eyelash was glued onto the end of a wood-handled dissecting needle |
| Microsoft Excel software | Microsoft Corp. | Google sheets is a no-cost alternative to Microsoft Excel | |
| Glass bottom 35 mm dishes with no. 1.5 coverslip, 20 mm window | Mattek Corporation | P35G-1.5-20-C | 35 mm petri dish, 20 mm glass window |
| Immersol 518F Immersion Oil | Fisher Scientific | 12-624-66A | |
| Low Gelling Agarose | Sigma Life Science | A9414-256 | |
| Corning Netwell Insert with 74 um Polyester Mesh, 24 mm Insert | Millipore Sigma | CLS3479-48EA | |
| Rstudio software | Rstudio PBC | Downloadable at https://rstudio.com/ | |
| SMX-168-BL Stereo microscope | Motic | ||
| Transfer Pipette | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| ZEN software | Carl Zeiss Microscopy, LLC |
References
- Denans, N., Baek, S., Piotrowski, T. Comparing Sensory Organs to Define the Path for Hair Cell Regeneration. Annual Review Cell & Developmental Biology. 35, 567-589 (2019).
- Ghysen, A., Dambly-Chaudiere, C.
- Lush, M. E., Piotrowski, T. Sensory hair cell regeneration in the zebrafish lateral line. Dev Dyn. 243 (10), 1187-1202 (2014).
- Ledent, V. Postembryonic development of the posterior lateral line in zebrafish. Development. 129 (3), 597-604 (2002).
- Nunez, V. A., et al. Postembryonic development of the posterior lateral line in the zebrafish. Evolution and Development. 11 (4), 391-404 (2009).
- Grant, K. A., Raible, D. W., Piotrowski, T. Regulation of latent sensory hair cell precursors by glia in the zebrafish lateral line. Neuron. 45 (1), 69-80 (2005).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. Supernumerary neuromasts in the posterior lateral line of zebrafish lacking peripheral glia. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 102 (5), 1496-1501 (2005).
- Lush, M. E., Piotrowski, T. ErbB expressing Schwann cells control lateral line progenitor cells via non-cell-autonomous regulation of Wnt/beta-catenin. eLife. 3, 01832 (2014).
- Hernandez, P. P., et al. Sublethal concentrations of waterborne copper induce cellular stress and cell death in zebrafish embryos and larvae. Biological Research. 44 (1), 7-15 (2011).
- Moya-Diaz, J., et al. Electroablation: a method for neurectomy and localized tissue injury. BMC Developmental Biology. 14, 7 (2014).
- Sanchez, M., Ceci, M. L., Gutierrez, D., Anguita-Salinas, C., Allende, M. L. Mechanosensory organ regeneration in zebrafish depends on a population of multipotent progenitor cells kept latent by Schwann cells. BMC Biology. 14, 27 (2016).
- Viader-Llargues, O., Lupperger, V., Pola-Morell, L., Marr, C., Lopez-Schier, H. Live cell-lineage tracing and machine learning reveal patterns of organ regeneration. eLife. 7, (2018).
- Morsch, M., et al. Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (120), e54983 (2017).
- Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo. Developmental Dynamics. 231 (2), 449-459 (2004).
- Kindt, K. S., Finch, G., Nicolson, T. Kinocilia mediate mechanosensitivity in developing zebrafish hair cells. Developmental Cell. 23 (2), 329-341 (2012).
- Toro, C., et al. Dopamine Modulates the Activity of Sensory Hair Cells. Journal of Neurosciences. 35 (50), 16494-16503 (2015).
- Dalle Nogare, D., Chitnis, A. B. A framework for understanding morphogenesis and migration of the zebrafish posterior Lateral Line primordium. Mechanisms of Development. 148, 69-78 (2017).
